酶促原位制备基于过酸的可移除抗微生物涂料组合物及其使用方法

摘要

本发明公开了原位酶促制备的基于过酸的可移除抗微生物涂料组合物及它们的使用方法，所述方法用于在多个位点控制微生物。

说明书

本专利申请要求全部提交于2009年7月27日的四个美国临时申请 61/228732、61/228735、61/228737和61/228746的权益。

发明领域

本发明涉及控制微生物的方法，所述方法包括用可移除的抗微生物成 膜组合物涂覆表面，所述组合物包含原位酶促生成的过氧酸，以及施用所述 组合物的方法。

发明背景

化学消毒剂目前用于越来越多的行业以确保食品安全并遵从更严格的 健康和安全法规。用于去污、消毒和灭菌的组合物必须具有优异的杀菌功 效、作用迅速、无腐蚀性并且微量起效。理想的组合物必须具有杀灭微生物 的多个机制，因此提供抗广谱微生物的功效并减少导致耐抗杀菌剂的微生物 进化的可能性。

包含过氧化物尤其是过氧化氢(HP)和过乙酸(也称为过氧乙酸， PAA)的组合物已证明是非常有效的抗微生物剂。多种此类制剂已通过了必 须的测试并且成为注册产品如消毒剂、杀菌剂和杀芽孢剂。许多这些过氧化 物/过氧酸组合物为溶液，它们可用于处理水溶液、表面和物体。一些组合 物经批准用于接触食品表面并用于一些食品的消毒。一些组合物也注册为用 于蒸汽相处理的消毒剂或杀菌剂。

已描述了清洁、灭菌、和/或消毒硬质表面、肉产品、活植物组织和医 疗设备以杜绝有害微生物生长的方法(美国专利6,545,047；美国专利 6,183,807；美国专利6,518,307；美国专利申请公布20030026846；和美国 专利5,683,724)。也已报道过酸在制备用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物 中是有用的(美国3,974,082；美国专利5,296,161；和美国专利 5,364,554)。

制备过酸的方法有若干个。例如WO2006/076334描述了包含过氧化物 和过酸水溶液的杀微生物和去污组合物；美国专利5,130,124描述了具有过 氧化氢的含水抗微生物成膜组合物；WO1996/022687描述了包含过氧化氢 的氧化成膜组合物。酶催化剂也可用于促进过酸的生成。共有的共同未决的 美国专利公开申请2008/0176299A1描述了酶促生产过酸的方法，其全文以 引用方式并入本文。也已描述了用于过酸的酶促生产的酶如酯酶(美国专利 3,974,082)、蛋白酶(美国专利5,364,554)、酯酶和脂肪酶(美国专利 5,296,161)。

尽管有如上所述的过酸制备方法，存在原位酶促生成基于过酸的、易 于移除的、均一化的抗微生物涂料组合物的需要，所述组合物在施用到表面 后提供短期和长期(或残余的)的抗微生物功效。

发明内容

本发明通过提供方法和组合物解决了上述问题，所述组合物是抗微生 物的，并且也通过在目标表面上形成抗微生物涂层提供长期的抗微生物效 应。

在一个方面，本发明涉及提供在位点处控制微生物的方法，所述方法 包括以下步骤：

a)通过组合组分形成组合物，所述组分包含：

i)成膜的水溶性或水分散性试剂；

ii)惰性溶剂；

iii)羧酸酯底物；

iv)过氧源；

v)酶催化剂，所述酶催化剂具有过水解酶活性从而形成至少一 种过氧酸以提供至少第一抗微生物剂；和

vi)流变改性剂；

b)将所述组合物施用到所述位点；

c)允许所述组合物干燥从而在所述位点上形成涂层。

本发明的另一方面涉及提供控制位点处微生物的方法，所述方法包括 以下步骤：

(a)提供包含惰性溶剂和成膜试剂的第一预混组分；

(b)提供包含具有过水解酶活性的酶催化剂、羧酸酯底物和过氧源的 第二预混组分；

(c)将所述第一预混组分和所述第二预混组分混合以获得包含具有过 氧酸的第一抗微生物剂的液体涂料组合物；

(d)将所述涂料组合物施用到所述位点；并且

(e)允许所述涂料组合物干燥从而在所述位点上形成涂层。

本发明的另一方面涉及包含组分的抗微生物组合物，所述组分包括：

a)成膜的水溶性或水分散性试剂；

b)惰性溶剂；

c)羧酸酯底物；

d)过氧源；

e)具有过水解酶活性的酶催化剂；和

f)流变改性剂

其中，在组合所述组分时形成过氧酸。

生物序列简述

下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨 基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(Requirements for Patent  Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence  Disclosures-the Sequence Rules))，并且符合世界知识产权组织(World  Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及 European Patent Convention(EPC)和Patent Cooperation Treaty(PCT)的序 列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative  Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和 格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQ ID NO：1是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC31954先锋霉素 C脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)亚种枯草芽孢杆菌菌 株168(GenBank Accession#NP_388200)先锋霉素c脱乙酰酶的氨基酸序 列。

SEQ ID NO：3是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633 (GenBank Accession#YP_077621.1)先锋霉素c脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580 (GenBank Accession#YP_077621.1)先锋霉素c脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)(GenBank Accession #CAB76451.2)乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是热纤梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC27405 (GenBank Accession#ZP_00504991)乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)GenBank  Accession#AAB70869.1)乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(GenBank  Accession#NP_227893.1)乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.) (GenBank Accession#AAB68821.1)乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B14911(GenBank  Accession#ZP_01168674)先锋霉素c脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是耐盐嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125 (GenBank Accession#NP_244192)乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16先锋霉 素c脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是高温产氢菌(Thermoanaerobacterium  saccharolyticum)乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14是莱廷格热袍菌(Thermotoga lettingae)乙酰木聚糖酯 酶的氮基酸序列。

SEQ ID NO：15是Thermotoga petrophilia栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶的氨 基酸序列。

SEQ ID NO：16是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2“a”乙酰木聚糖 酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2“b”乙酰木聚糖 酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18是实施例1中使用的引物f27405的核苷酸序列。

SEQ ID NO：19是实施例1中使用的引物r27405的核苷酸序列。

SEQ ID NO：20是由用于制备实施例1中使用的质粒pSW196的SEQ  ID NO：18和19扩增的核酸产物的核酸序列。

SEQ ID NO：21是存在于CE-7糖酯酶中的4个保守基序的邻接氨基酸 序列。

SEQ ID NO：22是实施例8中使用的正向引物[TAACTGCAGT AAGGAGGAAT AGGACATGGC CTTCTTCGAT TTACCCACTC]的核苷酸 序列。

SEQ ID NO：23是实施例8中使用的反向引物[TGATCTAGAT TAGCCTTTCT CAAATAGTTT TTTCAAGA]的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24是由用于制备质粒pSW207的SEQ ID NO：22和23扩增 的核酸产物的核酸序列。

SEQ ID NO：25是实施例8中使用的正向引物[TAAGAATTCT AAGGAATAGG ACATGGCGTT TCTTCGACCT GCCTCTG]的核苷酸序 列。

SEQ ID NO：26是实施例8中使用的反向引物[AAACTGCAGT TAGCCCTTCT CAAACAGTTT CTTCAG]的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27是由用于制备实施例8中使用的质粒pSW228的SEQ  ID NO：25和26扩增的核酸产物的核酸序列。

SEQ ID NO：28是实施例9中使用的正向引物Tma_C277Sf [GGACAACATCTCACCTCCTTCTA]的核苷酸序列。

SEQ ID NO：29是实施例9中使用的正向反向引物Tma_C227Sr [TAGAAGGAGGTGAGATGTTGTCC]的核苷酸序列。

SEQ ID NO：30是实施例9中使用的质粒pSW228的T.maritima(海栖 热袍菌)乙酰木聚糖酯酶的密码子优化序列。

发明详述

除非另行指出，所有百分数、份数、比率等均按重量计。商标以大写 体标示。此外，当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上 限数值和优选下限数值的列表形式给出时，此类公开将具有相同的效应，因 为如果在指定范围内的每个单独数值-以及在公开范围内获取自任意两个 单独数值的组合的任何范围-已被具体描述，甚至假如所述单独数值不是 本文唯一或单独公开的。除非另行指出，凡在本文中给出某一数值范围之 处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数。除非 明确说明，当定义一个范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体 数值。

为清楚起见，本文使用的术语应理解为如本文所述，或如本发明的领 域中的普通技术人员所理解的那样。此外，本文所使用的某些术语的解释提 供如下：

“过酸”是其中酸性-OH基已被-OOH基取代的羧酸。如本文所用， “过酸”与过氧酸(peroxyacid)、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸 (percarboxylic acid)和过氧性酸(peroxoic acid)同义。过酸包括过乙酸， 这一点通常是已知的。如本文所用，术语“过乙酸”或“PAA”与过氧乙 酸、乙过氧酸(ethaneperoxoic acid)和CAS登记号79-21-0的所有其他同义 词同义。

“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油；三乙酸甘油酯；甘油三醋酸酯， 1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的 所有其他同义词同义。

“过氧源”是指可被释放到溶液中的任何过氧化物化合物或包含过氧 化氢的化合物。

“剪切速率”是指流动物质中的速度梯度并以秒的倒数(s^-1)的SI单 位进行测量。

“剪切致稀特性”或“假塑性特性”是指随着剪切速率提高显示出粘 度降低的流体。

“易于移除的”是指在施用所述液体涂料组合物到受关注的表面后易 于移除形成的涂层，但不至于被无意的物理接触移除。

“非挥发性的”是指其蒸汽压在25℃低于1000帕斯卡的化合物。

“惰性溶剂或水性溶剂”是指有利于施用所述涂料组合物到所述位点 的水或任何其他溶剂。水性溶剂也可用于清洗被涂覆的表面以按需移除涂 层。

“成膜试剂”或“水溶性或水分散性涂层剂”在本文中可互换使用， 它们是指形成膜并被用于向受关注的表面提供保护性涂层的涂剂。这些涂剂 或是水溶性的，或是水分散性的。这些涂剂进一步详述于下文中。

“金属螯合剂”或“多价螯合剂”是指结合金属或含金属的杂质并阻 止它们对过氧化氢或过氧酸的分解催化的制剂。

“流变改性剂”或“流变剂”是指提高粘度和/或提供剪切致稀特性给 组合物，并引起含水处理剂或涂料组合物粘附到受关注的表面的化合物。

“重量％”是指相对于溶液或分散体总重量的重量百分比。

“液体涂料组合物”是指包含至少一种水溶性成膜试剂、惰性溶剂、 羧酸酯底物、过氧源、以及具有过水解酶活性的酶催化剂的组合物，其中制 备至少一种过氧酸。

如本文所用，“抗微生物剂”或“抗微生物特性”是指制剂杀灭微生 物、阻止或预防微生物污染(例如形成屏障)、或抑制或阻止微生物生长、 捕集微生物以灭杀、阻止生物膜形成或除去/移除生物膜的能力。

如本文所用，“抗微生物剂”是指具有抗微生物特性的化合物或物 质。

“微生物”旨在包括由系统发育范围的细菌和古生菌、以及单细胞 (例如酵母)和丝状(例如霉菌)真菌、单细胞和丝状藻类、单细胞和多细 胞寄生生物、病毒、朊病毒和类病毒组成的任何生物。

如本文所用，“生物杀灭剂”是指通常广谱的化学试剂，它灭活或破 坏微生物。将表现出灭活或破坏微生物能力的化学试剂称为具有“生物杀 灭”活性。

“生物膜”是指包被在自身生长的聚合物基体内并附着到活的或惰性 的表面微生物结构化群落。

“干燥”是指存在于制剂中的惰性溶剂或任何其他液体通过蒸发而被 除去的过程。

“消毒剂”是指提供抗微生物活性的一种制剂。根据官方的消毒剂测 试，消毒剂是在测试条件下在10分钟内杀死99.9％的特定测试微生物的化 学制品。(Germicidal and Detergent Sanitizing Action of Disinfectants，Official  Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists，第 960.09段及适用章节，第15版，1990(EPA Guideline 91-2))。

“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义为，在指定温度 每分钟产生1微摩尔过酸产物所需的过水解酶活性的量。

将“半衰期”或“τ”定义为PAA浓度已下降到其最大值一半时的时 间。

“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”互换使用并且是指包含具有过水 解活性的酶的催化剂，即，表现出催化过氧化物源和底物之间的反应以形成 过酸的能力的酶，并且所述酶可为完整微生物细胞、透化的微生物的一个或 多个细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶、或纯 化酶的形式。

“乙酰木聚糖酯酶”是指酶(E.C.3.1.1.72；AXE)，其催化乙酰化木 聚糖和其他乙酰化糖类的脱乙酰作用，并且也具有显著的过水解活性适于由 羧酸酯来制备过羧酸。

“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸分子，其包括编码序列前的 调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。

“分离的核酸片段”和“分离的核酸分子”可互换使用，并且是指单 链或双链的，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基的RNA或 DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离型核酸分子可由cDNA、基因组DNA 或合成DNA的一个或多个片段构成。

“表达”是指源于本发明的核酸分子的有义(mRNA)或反义RNA的 转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

“转化”是指将核酸分子转入宿主生物的基因组中，使得基因稳定遗 传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(如质粒)基 因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化” 生物。

“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心。位于Virginia，USA的微生 物保藏中心。

“第一抗微生物剂”是指根据本发明的方法在涂料组合物中原位生成 的抗微生物剂。在一个优选的实施方案中，第一抗微生物剂为过氧酸。

“第二抗微生物剂”是指除了存在于涂料组合物中的过氧酸之外的附 加抗微生物剂。根据本方法，这种制剂不是原位生成的。在一个优选的实施 方案中，第二抗微生物剂为季铵化合物。

“RGQ”是指在SEQ ID NO：1位118-120的氨基酸残基的高度保守基 序，所述序列是CE-7酶家族的特征。

“GXSQG”是指在SEQ ID NO：1位179-183的氨基酸残基的高度保守 基序，所述序列是CE-7酶家族的特征。

“HE”是指在SEQ ID NO：1位298-299的氨基酸残基的高度保守基 序，所述序列是CE-7酶家族的特征。

“LXD”是指在SEQ ID NO：1位267-269的氨基酸残基的高度保守基 序，所述序列是CE-7酶家族的特征。

“基本上类似于”是指核酸分子其中一个或多个核苷酸碱基上的改变 导致增加、取代、或缺失一个或多个氨基酸，但不影响DNA序列编码蛋白 的功能特性(即，过水解活性)。

“特征基序”、“CE-7特征基序”和“标签基序”是指具有定义活性 如过水解酶活性的酶家族共有的保守结构。

在一个方面，本发明为包括使用过水解酶与过氧源和羧酸酯的组合以 形成过氧酸的方法。过水解酶是催化过氧源(例如过氧化氢)与选择的底物 的反应以形成过酸的酶。如上文所述，具有过水解酶活性的酶包括但不限于 脂肪酶、酯酶、蛋白酶、非血红素卤代过氧化物酶和CE-7族的糖酯酶如乙 酰木聚糖酯酶或先锋霉素C脱乙酰酶。

这些酶的过水解活性的应用已在共有的美国专利公开申请 2009/0005590A1、美国专利公开申请2008/0176299A1和美国专利公开申请 2007/042924A1和美国专利公开申请61/102,520中进行了描述，其全文均以 引用方式并入本文。

在结构上属于CE-7酯酶家族的某些酶(例如头孢菌素C脱乙酰酶 (CAH)和乙酰木聚糖酯酶(AXE)表现出用于将羧酸酯(在过氧的无机 来源例如过氧化氢、过碳酸钠、过硼酸钠存在下)转化成浓度足以用作消毒 剂和/或漂白剂的过酸的显著过氧化水解活性。该体系通过在不需要高浓度 过氧的情况下制备高浓度的过酸来达到高效率(例如，如共有的美国专利申 请公布2008/0176299A1所述的那样)。

过水解酶催化剂可用作完整微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物 细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶、或纯化酶。酶催化剂还 可为化学改性的(例如通过聚乙二醇化或通过与交联试剂反应来改性)。还 可使用本领域技术人员熟知的方法将过水解酶催化剂固定到可溶性或不溶性 载体。

CE-7家族的糖酯酶

CE-7家族成员，先锋霉素C脱乙酰酶(E.C.3.1.1.41；系统命名先锋霉 素C乙酰水解酶；CAH)和乙酰木聚糖酯酶(E.C.3.1.1.72)存在于植物、 真菌(如顶头孢霉(Cephalosporidium acremonium))、酵母(如圆红冬孢 酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis))和 细菌(如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)、Norcardia  lactamdurans、以及芽孢杆菌属的许多成员)中(Politino等人，Appl. Environ.Microbiol，63：4807-4811，1997)；Sakai等人，J.Ferment.Bioeng. 85：53-57，1998)；Lorenz，W.和Wiegel，J.，J.Bacteriol.，179：5436-5441， 1997)；Cardoza等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54：406-412，2000)； Mitshushima等人，同上，Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol. 30：413-419，1975)；Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606，2003， Takami等人，NAR，28：4317-4331，2000)；Rey等人，Genome Biol.，5： article 77，2004)；Degrassi等人，Microbiology.，146：1585-1591， 2000)；美国专利公开6,645,233；美国专利公开5,281,525；美国专利公开 5,338,676；和WO 99/03984。与SEQ ID NO：1具有显著同源性的CE-7家族 成员的不完全列表在SEQ ID NO 1-18中提供。

作为(Vincent等人，同上)CE-7家族成员的糖酯酶，先锋霉素C脱乙 酰酶(E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(E.C.3.1.1.72)水解在乙酰化聚合 木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖和乙酰化纤维素上的乙酰基。因此，乙 酰化糖类可为用于使用本发明的方法(即在过氧源的存在下)产生过羧酸的 合适底物。乙酰化糖类的实例包括但不限于乙酰化葡萄糖(例如葡萄糖五乙 酸酯)、乙酰化甘露糖、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)和乙酰化纤维 素。

一些酶如那些适用于本发明方法的酶具有标记基序，所述基序可用于 限定和/或鉴定结构上相关的酶家族，所述酶对限定的底物家族具有相似的 酶活性。特征基序可为单个邻接氨基酸序列或不连续的保守基序的集合，它 们一起形成特征基序。通常，保守基序以氨基酸序列表示。如本文所述，本 发明的过水解酶属于CE-7家族的糖酯酶。该酶家族能通过如下所述存在的 标记基序进行限定。

CE-7家族成员是与众不同的，因为它们通常表现出对乙酰化低聚木糖 和先锋霉素C的酯水解活性，表明CE-7家族提供对小范围底物具有多功能 脱乙酰酶活性的单独一类蛋白(Vincent等人，同上)。Vincent等人描述了 该家族成员之间的结构相似性并限定了CE-7家族(SEQ ID NO：21)的标记 序列基序特征。利用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：1进行比对的CE- 7特征基序具有若干个高度保守的基序，所述基序是该家族的特征基序，其 包括SEQ ID NO：1的残基118-120(RGQ)、SEQ ID NO：1的残基179-183 (GXSQG)、SEQ ID NO：1的残基298-299(HE)和SEQ ID NO：1的残基 267-269(LXD)。氨基酸序列的多重比对可使用Higgins和Sharp， CABIOS，5：151-153(1989)的Clustal比对方法进行，默认参数(空位罚分 ＝10，空位长度罚分＝10)。使用Clustal方法的成对比对的默认参数通常为 KTUPLE 1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。

过水解酶的氨基酸序列与本文报道的序列有至少50％，优选地至少 60％，更优选地至少70％，甚至更优选地至少80％，甚至更优选地至少 90％，甚至更优选地至少95％，最优选地至少99％的相似性，其中所得酶保 留本发明的功能特性(即过水解活性)，它们适用于本发明的方法。术语 “基本上类似于”也可指具有过水解活性的酶，该酶由在严格条件下与本文 报道的氨基酸序列的核酸分子(例如SEQ ID NO：1-17和30)杂交的核酸分 子编码。因此，应当理解，本发明不仅仅涵盖特定的示例性序列。

在本文示例的过水解酶之间对整体百分比同一性的比较表明，与SEQ  ID NO：1具有少至33％同一性的酶(但保留了特征基序)表现出显著的过 水解酶活性，并且在结构上归为CE-7糖酯酶。

在一个实施方案中，用于该方法的其中一个过水解酶催化剂包括具有 CE-7特征基序的酶，该基序利用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：1进 行比对所述标记基序包含：

i)在SEQ ID NO：1的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：1的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：1的氨基酸位置298-299的HE基序；

其中所述酶也与SEQ ID NO：1具有至少30％的氨基酸同一性。

在另一个实施方案中，该特征基序还包含第四保守基序，其被定义为 当用CLUSTALW比对参考序列SEQ ID NO：1时在第267-269氨基酸残基位 置的LXD基序。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包括具有选自SEQ ID NO：1-17 和30的过水解酶活性的酶，或基本上类似的具有过水解酶活性的酶，所述 酶通过取代、删除或添加一个或多个氨基酸到所述氨基酸序列来得到。

在另一个实施方案中，具有过水解酶活性的基本上类似的酶与选自 SEQ ID NO：1-17和30的一个或多个氨基酸序列具有至少90％，91％， 92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含与如SEQ ID NO：1定义的 邻接特征基序具有至少30％，优选至少36％的氨基酸同一性的酶，其中上 述标记基序(例如RGQ、GXSQG和HE，以及任选LXD)被保留。

在另一个实施方案中，本发明方法的过水解酶体系与附加的酶联合使 用，附加的酶包括但不限于蛋白酶、淀粉酶等。实际上，预期多种酶将用于 本发明，包括但不限于微生物细胞壁降解和糖蛋白降解酶、溶菌酶、半纤维 素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯 酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、异构还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合 酶、木素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、13-葡聚糖酶、 阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、内葡聚糖酶、PNGase、淀 粉酶等，以及或它们的混合物。在一些实施方案中，酶稳定剂用于本发明的 方法。预期通过酶的组合使用，将同时减少该方法中所需的化学制品的量。

虽然在一个优选的实施方案中，已将结构上相关的糖类家族酯酶家族 CE-7的成员的过水解活性用于本方法，获取自任何来源的任何过水解酶也 可用于本方法，所述过水解酶在过氧化氢的存在下主要将酯底物转化成过 酸。

此外，一些水解酶可用于现有方法。就此目的，合适的水解酶包括 (1)属于肽基-肽水解酶类的蛋白酶(例如胃蛋白酶、胃蛋白酶B、凝乳 酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶A、胰凝乳蛋白酶B、弹性蛋白酶、肠激酶、 组织蛋白酶C、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、无花果蛋白酶、凝血酶、纤 溶酶、肾素、枯草杆菌蛋白酶、曲霉肽酶A、胶原酶、梭状芽胞杆菌肽酶 B、激肽释放酶、胃亚蛋白酶、组织蛋白酶D、菠萝蛋白酶、角蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶C、胃蛋白酶C、曲霉肽酶B、尿激酶、羧肽酶A和B、以及氨 基肽酶)；(2)甲酸酯水解酶，包括羧基酯酶、脂肪酶、果胶酯酶和叶绿 素酶；以及(3)具有高过水解与水解比率的酶。在它们中尤其有效的是使 用本发明方法的过水解酶初级、次级、三级、和/或四级结构特征的脂肪 酶，以及表现出高过水解与水解比率的酯酶，以及蛋白工程化的酯酶、角质 酶和脂肪酶。

合适的酶促反应混合物

“合适的酶促反应混合物”、“适于原位生产过酸的组分”、“合适 的反应组分”、以及“合适的含水反应混合物”在本文中互换使用，并且指 其中反应物和酶催化剂发生接触的材料和溶液。本文提供了合适的含水反应 混合物的组分，并且本领域技术人员应当理解适于本发明方法的组分变化范 围。

在一个实施方案中，合适的酶促反应混合物在反应组分组合后原位生 产过酸。像这样的，可提供反应组分作为其中一种或多种反应组分保持分离 直至使用的多组分体系。用于使多种活性组分组合的体系的设计是本领域已 知的，并且一般将取决于各反应组分的物理形式。例如，多活性流体(液- 液)体系通常使用多室分配瓶或两相体系(美国专利申请公开 2005/0139608；美国专利5,398,846；美国专利5,624,634；美国专利 6,391,840；EP专利0807156B1；美国专利申请公开2005/0008526；和PCT 公开WO 00/11713A1)，例如在其中所需漂白剂在使反应性流体混合后产 生的某些漂白应用中发现的。用于生成过酸的多组分体系的其他形式可包括 但不限于设计用于一种或多种固体组分或固体-液体组分组合的那些，例如 粉末(如多种可商购获得的漂白组合物，美国专利公开5,116,575)、多层 片剂(美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(美国专利 6,995,125)和在添加水后反应的固体凝聚物(美国专利6,319,888)。

在另一方面，用于组合反应组分的合适系统使用双喷嘴瓶，如美国专 利公开申请公布2005/014427所公开的那样。适用于本发明方法的供选择装 置为如EP专利0715899B1所公开的双隔室触发-活化流体分配器。

在另一方面，用于混合合适反应组分的合适体系可为具有将反应组分 分开的膜的容器，其中在使用前通过机械力使膜破裂时，混合反应组分。在 另一方面，适用的装置可为袋内袋。

在另一方面，如本发明方法所述用于组合或混合适用酶反应混合物的 装置包括系统、装置、容器、套件、多件包装、袋、分配器和本领域技术人 员已知的用于使反应组分在使用前保持分离的施用装置。

在另一方面，酶过水解产物组合物可包含提供所需功能的附加组分。 这些附加组分包括但不限于缓冲剂、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活 性剂、润湿剂、腐蚀抑制剂(如苯并三唑)、酶稳定剂和过氧化物稳定剂 (如金属离子螯合剂)。许多附加组分为洗涤剂工业中熟知的(参见例如美 国专利公开5,932,532；以引用方式并入本文)。乳化剂的实例包括但不限 于聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于LAPONITERD、玉米淀粉、PVP、CARBOWAX、CARBOPOL、CABOSIL、聚山梨 酸酯20、聚乙烯醇(PVA)和卵磷脂。缓冲体系的实例包括但不限于磷酸二氢 钠/磷酸氢二钠；氨基磺酸/三乙醇胺；柠檬酸/三乙醇胺；酒石酸/三乙醇 胺；琥珀酸/三乙醇胺；乙酸/三乙醇胺；和碳酸氢钠/碳酸钠。表面活性剂的 实例包括但不限于：a)非离子表面活性剂如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共 聚物、乙氧基化的或丙氧基化的直链和支链伯醇和仲醇、以及脂族氧化膦， b)阳离子表面活性剂如季铵化合物、尤其是具有结合氮原子、附加地结合 三个C1-C2烷基的C8-C20烷基的季铵化合物，c)阴离子表面活性剂如烷 烃羧酸(例如C8-C20脂肪酸)、膦酸烷基酯、烷基磺酸盐(例如十二烷基 磺酸钠“SDS”)或直链或支链的烷基苯磺酸盐、烯基磺酸盐，和d)两性 和两性离子表面活性剂如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜碱、以及它们的 混合物。附加组分可包括芳香剂、染料、过氧化氢稳定剂(例如金属螯合剂 如1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(DEQUEST2010，Solutia Inc.，St.Louis，Mo. 和乙二胺四乙酸(EDTA))、TURPINALSL、DEQUEST0520、 DEQUEST0531、酶活性稳定剂(例如聚乙二醇(PEG))、以及洗涤剂 助剂。

在另一方面，可在接触需消毒的表面或无生命物体前预混酶促过水解 产物以生成期望浓度的过氧羧酸。

在另一方面，可预混酶促过水解产物以生成期望浓度的过氧羧酸并可 任选地用水或主要由水组成的溶液稀释以制备具有期望较低浓度过酸的混合 物。

在另一方面，不在接触需消毒的表面或无生命物体前预混酶促过水解 产物以生成期望浓度的过氧羧酸，而是相反地，使生成期望浓度的过羧酸的 反应混合物组分接触需消毒的表面或无生命物体，生成期望浓度的过氧羧 酸。在一些实施方案中，反应混合物的组分在所述位点组合或混合。在一些 实施方案中，将反应组分递送或施用到所述位点并随后混合或组合以生成期 望的过氧酸。

含水反应混合物中催化剂的浓度取决于催化剂的特定催化活性，对该 浓度进行选择以获得所需的反应速率。过水解反应中催化剂的浓度通常在每 毫升总反应体积中具有0.0001mg至10mg，优选0.0005mg至2.0mg的范 围。还可使用本领域技术人员熟知的方法将催化剂固定在可溶性或不溶性载 体上；参见例如Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff， Editor；Humana Press，Totowa，N.J.，USA，1997。使用固定化催化剂允许 在后续反应中进行回收和重复使用。酶催化剂可为完整的微生物细胞、透化 的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化的酶、以及它们的 混合物的形式。

在一个方面，通过组合羧酸酯的化学过水解和酶促过水解生成的过酸 浓度足以提供有效浓度的过酸用于在期望pH进行期望的施用。在另一方 面，本发明的方法提供酶和酶底物的组合以生产期望有效浓度的过酸，其中 在不加入酶的情况下，制备的过酸浓度显著更低。虽然在一些情况下通过无 机过氧化物与酶底物的直接化学反应可存在基本的酶底物的化学过水解，但 生成的过酸浓度可能不足以在期望的应用中提供有效的过酸浓度，并且加入 合适的过水解酶催化剂到反应混合物中显著提高总过酸浓度。

通过至少一种羧酸酯的过水解生成的过酸(例如过乙酸)的浓度为在 过水解反应开始10分钟内，优选地在5分钟内，以及最优选地在1分钟内 达到至少约2ppm，优选地至少20ppm，优选地至少100ppm，更优选地至少 200ppm过酸，更优选地至少300ppm，更优选地至少500ppm，更优选地至 少700ppm，更优选地至少约1000ppm过酸，最优选地至少约2000ppm过 酸。在另一方面，在开始过水解反应后一小时内，更优选地在30分钟内， 最优选地在5分钟内通过过水解催化剂生成的过酸浓度为至少约3000ppm， 优选地至少5000ppm，更优选地8000ppm，最优选地至少10000ppm。在一 个方面，制备期望的浓度过酸所需的反应时间不超过约两小时，优选地不超 过约30分钟，更优选地不超过约10分钟，甚至更优选地不超过约5分钟， 最优选地在约1分钟或更短的时间内。在其他方面，在将所述反应组分结合 后约1分钟至约168小时内，或约1分钟至约48小时内，或约1分钟至8 小时内，或1分钟至2小时内或其中的任何此类时间间隔内，将被一定浓度 的微生物种群污染的硬质表面或无生命物体与根据本文所述的方法形成的过 酸接触。

对反应温度进行选择，以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反 应温度可在正好在高于反应混合物凝固点(大约0℃)至约75℃的范围内， 优选地在约5℃至约55℃的范围内。

包含过酸的最终反应混合物的pH为约5至约9.5，优选地约6至约8， 更优选地约6.5至约7.5。在另一个实施方案中，反应混合物的pH为酸性 (pH＜7)。在反应期间或反应完成后反应混合物的pH可任选地通过加入合 适缓冲液进行控制，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、 或柠檬酸盐。使用缓冲剂时，其浓度通常为0.1mM至1.0M，优选1mM至 300mM，最优选10mM至100mM。

在本发明的一个实施方案中，预混至少一些组分。预混是指混合涂料 混合物的一种或多种单独组分，但不是混合所有成膜组合物的期望组分。在 最终施用或在特定位点使用前必须将涂料组合物的附加组分加到预混组分 中。在另一个实施方案中，必须根据本发明的方法将两种预混组分混合以形 成期望的涂料组合物。

本发明的涂料组合物的组分可被包含在多隔室围堵体系中，该体系本 文也称为多隔室体系。多隔室体系是指在使用前使多隔室体系涂料体系的两 种或更多种反应组分保持分离的装置。在一个方面，多隔室体系包括至少两 个隔室并可包含用于组合液体形式的反应化合物的多室分配瓶或双相体系。 在另一方面，粉末、多层片剂、或具有多个隔室的水不溶性小包可用于固体 形式的化合物或固液形式的组合。在另一方面，用于在使用前使反应组分保 持分离的任何种类的系统、装置、容器、包装、袋、套件、多件包装、分配 器、或用于使反应组分在使用前保持分离的施用装置可根据本发明的方法使 用。

在施用后能够用水溶液除去本发明的涂料。用于移除涂料的有效的水 溶液为包含60至100重量％的水、溶解或分散组分的剩余组分的任何溶 液。溶解或分散的组分包括但不限于溶剂如醇类、增溶剂、表面活性剂、盐 类、螯合剂、酸和碱。

本发明的抗微生物涂料为耐用涂料。在本发明的上下文中耐用性为施 用的抗微生物涂层的特性或特征，所述涂层在干燥后在典型的使用条件下保 留在表面上直至其被有意地开始移除或允许移除。使用条件是在涂层保留在 目标表面上的本发明施用位点期间的普遍环境条件，并且可包括无意接触水 的情况。

施用到目标表面的抗微生物涂层优选地可为连续的或基本上连续的。 在本发明的上下文中连续的或基本上连续的指覆盖目标表面的涂层无空隙、 中断、未覆盖区域、或无意间留下暴露表面区域的涂层缺陷。

本发明的涂层优选地为均匀的或基本上均匀的。在本发明的上下文中 均匀的或基本上均匀的是指涂层在整个涂覆表面仅有小的厚度变化，在整个 涂覆表面的涂层厚度的标准偏差在涂层厚度0-40％的范围内。不均匀的或基 本上不均匀的涂层将不提供施加涂层的整个表面上均匀的抗微生物和移除特 性，并且通常不均匀的涂层外观对很多应用来说被认为是不美观的。

假塑性指数或剪切稀化指数(STI)提供对所述组合物可能表现出的松 垂和滴落的抗性指示。在较低剪切速率下记录的值除以在较高剪切速率下的 值以得到STI。一般来讲，涂覆材料的STI越高，其对松垂和滴落的抗性将 越高。在该公开中将剪切稀化指数定义为在第一剪切速率和第二剪切速率下 测得的粘度的比率，其中所述第二剪切速率的值是所述第一剪切速率的值得 10倍。作为另外一种选择，如果s^-1中的剪切速率是已知的，也能够通过用 转式粘度计在第一rpm和第二rpm测量粘度计算剪切稀化指数，其中所述第 二rpm的值是所述第一rpm的值的10倍。在实例中不受使用的特定第一剪 切速率和第二剪切速率或用于计算STI的特定第一rpm值和第二rpm值的约 束，将剪切稀化指数计算成在1rpm和10rpm测得的粘度比率。

本发明的抗微生物涂层可用作消毒剂。如本文所定义，消毒剂是化学 制品或化学制品混合物，其可为或(i)接触食品的消毒剂，如果其目的在 于控制表面上实际地或潜在地接触食品的微生物，或(ii)不接触食品的消 毒剂，如果所述表面不旨在接触食品。如本文所定义，接触食品的消毒剂在 测试方法条件下在30秒内杀死至少99.999％的特定测试微生物，所述测试 方法如EPA政策DIS/TSS-4：“Efficacy data requirements-Sanitizing rises  for previously cleaned food-contact surfaces”，United States Environmental  Protection Agency，1979年1月30日所述。如本文所定义，不接触食品的消 毒剂在测试方法条件下在5分钟内杀死至少99.9％的特定测试微生物，所述 测试方法如2003年4月10日版并公布于2003年7月的ASTM标准E 1153- 03：“Standard Test Method for Efficacy of Sanitizers Recommended for  Inanimate Non-Food Contact Surfaces”所述。

本发明的涂料组合物能够表现出残余的抗微生物功效，并表现出自我 消毒特性。“残余的抗微生物功效”或“自我消毒特性”指如本文所述形成 的涂层的特性，其在干燥后保持抗微生物活性。干燥涂层的抗微生物活性能 够使用残余自我消毒(RSS)测试进行测量。

一直以来对具有改善的抗微生物功效和改善的作用速度的抗微生物剂 具有长期的需要。对此类制剂的特定需求根据预期应用(例如杀菌剂、消毒 剂、灭菌剂、无菌包装处理等)和可适用的公共健康需求而不同。例如，如 Germicidal and Detergent Sanitizing Action of Disinfectants，Official Methods of  Analysis of the Association of Official Analytical Chemists，第960.09段和可适 用的章节，第15版，1990(EPA Guideline 91-2)所提出的那样，消毒剂应 在室温下(23-27℃)在30秒内对若干种测试生物提供99.999％的减少效果 (5-对数级的减少)。

用于本发明的原位酶促产生的基于过酸的、可移除的抗微生物涂层组 合物可用作标准消毒产品(例如稀释的季铵化合物溶液、过酸泡沫等)的替 代或补充，并且可作为保护性涂层用于正在使用的或未使用的设备的日常消 毒、以及长期保护(数周或数月)。

本公开的原位酶促产生的基于过酸的、可移除的抗微生物涂层组合物 提供若干个优点，包括但不限于杀灭独立生存的或浮游的微生物和生存在生 物膜中的微生物、通过防止生物膜形成并捕获在涂层中、涂层下或换句话讲 与涂层接触的微生物来减少或阻止微生物生长。

本文公开的涂料组合物可通过用流变改性剂配制组合物进行改进以涂 覆垂直的、倾斜的、复杂几何形状的或难以到达的表面。这使得该抗微生物 剂能够被施用于设备上或设备内的表面，而具有传统的剪切-粘度特征和在 25℃低于约0.01帕-秒的粘度的常规抗微生物溶液难以施用到所述表面上。 水平的和垂直的表面可用无抗微生物剂废料的薄层保护性涂层覆盖，因为该 涂层通过流变改性剂防止或极大地减少了滴落的发生。通过用合适的流变改 性剂配制组合物和一定程度的交联，可制备具有多种涂覆特性的涂料组合 物，所述组合物将在表面光洁度和保护性能以及易移除性方面不同。

本发明的涂料组合物提供若干个机制防止微生物或非微生物来源的污 染，例如泥土。例如，当施用液体涂料组合物时，通过涂料制剂中的抗微生 物剂将在表面上浮游的或松散附着的细胞杀灭、或减少或阻止其生长。

此外，在施用本发明的液体抗微生物涂层组合物后，通过在施用的成 膜组合物完全干燥以提供抗微生物膜之前将抗微生物剂散布到水合生物膜 中，表面上受生物膜保护的细胞将被杀死，或其生长可被减少或阻止。就持 续的抗微生物活性而言，希望本发明的抗微生物膜为半渗透的。因此形成的 抗微生物膜构成抗微生物剂的贮存器，其提供比通常在数秒或数分钟内滴落 的常规消毒漂洗液长得多的接触时间。

当涂层存在于位点上时，长时间保持的活性在多种应用中尤其有益。 本发明的成膜抗微生物组合物不会迅速从目标表面上滴落，并且不易于被例 如附带的接触除去。本发明涂料的膜的柔韧性、粘度、强度和粘附性的变型 使得其适应特定的用途，因此在多种情况下提供持续可用的抗微生物保护效 果，其中此类持续的活性(残余的有益效果)以前是不可用的。

在本发明实施中使用的成膜水溶性或水分散性试剂可为下述任何制剂 的至少其中一种，所述制剂为耐用的和可移除的。本发明的膜被设计为在相 对温和的条件下可移除的。例如，本发明的膜当用温度高于15℃，优选地 高于30℃的水溶液处理时能被移除。合适的成膜试剂选自但不限于聚乙烯 醇、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、丙烯酸酯共聚物、离子 烃聚合物、聚氨酯、多糖、官能化的多糖、米糠萃取物、葡甘露聚糖、瓜耳 胶、阿拉伯树胶、johannis树胶、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲 基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素淀粉、羟基乙基淀 粉、黄原胶、角叉菜胶、凝胶多糖、支链淀粉、胶质、葡聚糖、脱乙酰壳多 糖、甘油、藻酸钠、与钙盐交联的藻酸钠、角叉菜胶、环氧乙烷/环氧丙烷/ 环氧乙烷嵌段共聚物、以及它们的组合。本领域的技术人员可根据本发明的 方法容易地选择合适的分子量范围以提供水溶解度范围，从而提供易于移除 的涂层。

聚乙烯醇，有时称为聚(乙烯基醇)，由聚乙烯乙酯通过水解制成， 并且适用于本发明。聚乙烯醇的物理特性受分子量和水解度的控制。最常见 的可用的聚乙烯醇等级，按水解度分级为：87-89％等级(包含11-13摩尔％ 的残余的乙酸乙烯酯单位)，96％水解等级(包含4摩尔％的残余的乙酸乙 烯酯单位)，以及“完全水解的”和“超水解”等级，分别为约98％和大 于99％水解的。较低水解度的(例如74％和79％)也为可商购获得的。一 些优选的水解度为大于85摩尔％，或大于92摩尔％。本发明的聚乙烯醇组 分还可为乙烯醇的共聚物，例如通过使乙酸乙烯酯与少量(至多约15摩尔 ％)的其他单体的共聚物水解而获得的。适当的共聚单体为例如丙烯酸、甲 基丙烯酸、马来酸或富马酸、衣康酸等的酯。此外，乙酸乙烯酯与烃如α- 烯烃(例如乙烯、丙烯或十八烯，等等)、与较高级的乙烯酯如丁酸乙烯 酯、2-己酸乙酯、硬脂酸酯、三甲基乙酸酯、或它们的同系物(由Shell  Chem.Co.销售的“VV-10”型乙烯酯)等的共聚作用产生可被水解为适当 的聚乙烯醇共聚物的共聚物。其他合适的共聚用单体为N-取代的丙烯酰 胺、乙烯基氟化物、乙酸烯丙酯、烯丙醇等。此外游离的不饱和酸如丙烯 酸、甲基丙烯酸、单甲基马来酸等也可用作共聚用单体。

由于有文献中已知的或可商购获得的多种等级，本领域的技术人员能 够通过以任何所期望的比例简单地混合已知的或商品化的等级配制出具有从 74％至大于99％范围内的平均水解度的聚乙烯醇溶液。

膜的柔韧性、水敏感度、溶解的容易程度、粘度、膜强度和聚乙烯醇 膜的粘附性可通过调整分子量和水解度而不同。

在一个实施方案中，用于本发明方法的聚乙烯醇具有约85％至大于 99％的水解度。在另一个实施方案中，聚乙烯醇具有约87％至大于89％的水 解度。

在一个实施方案中，聚乙烯醇的数均分子量(Mn)在约4,000至约 200,000，或约4,000至约150,000，或10,000至约100,000之间的范围内。

在一个实施方案中，聚乙烯醇的分子量在约10,000和130,000之间的 范围内。在另一个实施方案中，可将不同分子量的聚乙烯醇混合以提供期望 的特性。

在一个实施方案中，聚乙烯醇按重量计以溶液重量的约2％至约30％使 用。在一个更加具体的实施方案中，聚乙烯醇按重量计以溶液重量的约2％ 至约15％使用。在一个更加具体的实施方案中，聚乙烯醇按重量计以溶液 重量的约5％至约12％使用。

本发明的成膜组合物可包含按重量计约0.25％至约50％的浓度的 PVP。适当等级的PVP可购自International Specialty Products(Wayne，NJ， USA)。此类等级包括：K-15，具有在约6,000至约15,000范围内的平均分 子量(Mw)；K-30，具有在约40,000至约80,000范围内的分子量；K- 60，具有在约240,000至约450,000范围内的分子量；K-90，具有在约 900,000至约1,500,000范围内的分子量；和K-120，具有在约2,000,000至 约3,000,000范围内的分子量。PVP的混合物，以及PVP和其他成膜化合物 的组合均可使用。合适的等级在共有的和共同未决的美国专利申请：美国专 利2007/0275101A1和美国专利2008/0026026A1中进行了描述，它们全文 均以引用方式并入本文。

通常，与相同浓度的较高分子量的PVP相比，较低分子量的PVP将产 生粘性较低的产物。就给定浓度的PVP而言，随着分子量范围的提高，粘 度也将升高。本发明可使用具有多种分子量范围中的任何一种的PVP。然 而，优选使用具有约15,000至约3,000,000g/mol的分子量分布的PVP。具有 这样的分子量分布的通常产生具有可被容易地调整的粘度并且可被容易地洗 掉而无与涂覆的表面相互作用的显著迹象的成膜组合物。在一个优选的实施 方案中，分子量分布在约15,000和约3,000,000g/mol之间的PVP以按重量 计在约0.25％和约40％之间的浓度存在。在另一个优选的实施方案中，分子 量分布在约30,000和约1,200,000g/mol之间的PVP以按重量计在约0.25％和 约10％之间的浓度存在。

一类被广泛识别为包括高效消毒剂的分子为有机过氧酸分子。近年来 已开展了针对这些化合物的研究，目标至少是为它们提供稳定安全的递送装 置。在过氧酸中，已受到最密切关注的是过氧乙酸(常称为过乙酸或 PAA)。这种特别的过氧酸很少分离成纯化合物，而是通常为在水和非水介 质中的溶液。过氧乙酸常以平衡混合物形式供应，主要包括水、乙酸和过氧 化氢，以及许多其他微量组分如稳定剂(WO 2006/076334；美国专利 5,508,046)。然而，甚至过氧乙酸的平衡体系本质上是热力学不稳定的， 这是由于过氧乙酸分解成乙酸和氧。如果采取特别措施，可延缓此类分解， 但不能完全阻止。使得过氧酸难以使用或贮存的其他特性是它们可迅速猛烈 地分解，尤其是低分子量和高纯度的过氧酸。为了解决该问题，通常原位生 成过氧酸以实现特定的期望功能。此类原位生成具有优点，因为制备的过氧 酸量可通过选择原料的相对组成进行化学计量学控制。此外，由于原位体系 的非平衡本质，可获得比得自平衡体系的过氧酸更高浓度的过氧酸。

也需要以所需速率生成过氧酸：速率太慢可导致性能不佳。本发明的 方法提供酶和酶底物的组合以生产期望有效浓度的过酸，其中在不加入酶的 情况下，制备的过酸浓度显著更低。虽然在一些情况下通过无机过氧化物与 酶底物的直接化学反应可基本上化学过水解酶底物，但生成的过酸浓度可能 不足以在期望应用中提供有效的过酸浓度，并且加入合适的过水解酶催化剂 到反应混合物中显著提高总过酸浓度。

对过酸本质上缺乏稳定性的一个解决方案是提供一个体系，其中产生 或反应形成过酸的反应组分保持分离状态直到需要时(WO 2006/016145)。在本文所述的方法中考虑了对该问题的此类解决方案。

在本发明中成膜组分与其他组分组合，所述其他组分包括羧酸酯底 物、具有过水解酶活性的酶催化剂和过氧源。可将成膜组分和一种或多种以 下组分：羧酸酯底物、酶催化剂和过氧源一起在组合以形成抗微生物涂层组 合物并施用到目标表面之前贮存在一个隔室中，或贮存在分开的隔室中。例 如，可将来自羧酸酯底物、酶催化剂和过氧源的成膜组分贮存在分开的隔室 中，并恰好在施用到目标表面之前组合，或可将成膜组分与羧酸酯底物一起 贮存，但与酶催化剂或过氧源分开直到将它们组合并施用到目标表面时。

本发明的方法使用具有过水解酶活性的酶以耐用的、连续的和易于移 除的成膜组合物形式原位酶促生成有效浓度的过酸，所述酶来自糖酯酶CE- 7家族。如本文所述，编码所述酶(例如具有分离自那不勒斯栖热袍菌 (Thermotoga neapolitana)的氨基酸序列SEQ ID NO：7、分离自海栖热袍 菌(Thermotoga maritima)的氨基酸序列SEQ ID NO：8、或基本上类似的氨 基酸序列的酶)的基因适于在本发明方法中应用。如上文所公开的那样，来 自不同来源的具有过水解酶活性的其他酶也可用于本文所公开的方法。

在一个优选的实施方案中，无机过氧化物源是过氧化氢。本发明不旨 在受无机过氧化氢的限制。过氧化氢可使用酶催化剂和合适的底物生成。在 本发明方法中使用生成过氧化氢和酸的任何酶以及适用底物。例如，来自乳 杆菌(Lactobacillus)菌种的乳酸过氧化物酶可用于本发明方法，所述酶已 知从乳酸和氧生产过氧化氢。

能够生成过氧化氢的其他酶(例如葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、乙二醇 氧化酶、甘油氧化酶、氨基酸氧化酶等)也与酯底物以及本发明方法的过水 解酶组合生成过酸。本发明也使用从底物中生成酸、不生成过氧化氢的酶。 此类酶的实例包括但不限于蛋白酶。

在另一方面，过氧源可为任何过氧化物化合物并且可选自但不限于以 下物质：过氧化氢、过硼酸钠一水合物、过硼酸钠四水合物、过焦磷酸钠、 过氧化脲、过碳酸钠、过氧化钠、以及它们的混合物。

在一个实施方案中，合适的底物包括酯，所述酯通过下式表示：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基

R₆＝C1至C7直链的、支链的或环状的烃基部分，其任选地用羟基或 C1至C4烷氧基取代，其中当R6＝C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个 醚键；

R₅＝C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中 R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任 选地包含一个或多个醚键；

m＝1至R₅中碳原子数；并且其中所述酯的水中溶解度为25℃下至少 5ppm。

在另一个实施方案中，合适的底物也包括用下式表示的酯：R₁-COO- R₂，其中R₁＝C1至C7的直链或支链烷基，其任选地被羟基或C1至C4烷 氧基取代，并且R₂＝C1至C10的直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷 基芳基、烷基杂芳基、杂芳基，-(CH₂CH₂-O)_nH或-(CH₂CH(CH₃)- O)_nH并且n＝1至10。

在另一个实施方案中，合适的底物也包括用下式表示的甘油酯：R₁- COO-CH₂-CH(OR₃)-CH₂-OR₄，其中R₁＝C1至C7的直链或支链烷基，其 任选地被羟基或C1至C4烷氧基取代，并且R₃和R₄是单独的H或R₁C (O)。

在另一个实施方案中，R₆为任选地被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1 至C7支链的烃基部分，任选地包含一个或多个醚键。在一个更优选的实施 方案中，R₆为任选地被羟基取代的C2至C7直链的烃基部分，和/或任选地 包含一个或多个醚键。

在另一个实施方案中，合适的底物也包括乙酰化的糖，其选自乙酰化 的单糖、二糖和多糖。在一个优选的实施方案中，乙酰化糖类包括乙酰化单 糖、二糖和多糖。在另一个实施方案中，乙酰化糖类选自乙酰化木聚糖、乙 酰化木聚糖片段、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙酰化葡萄糖(例如 葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半乳 醛和三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖、以及乙酰化纤维素。在一个优选的实施方 案中，乙酰化糖类选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半 乳醛和三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖，以及乙酰化纤维素。因此，乙酰化糖类 可为用于使用本发明的方法(即在过氧源的存在下)产生过羧酸的合适底 物。

在一个实施方案中，所述底物的实例选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙 酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油 一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸 酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸盐或 酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-葡萄烯糖；1，2-乙二醇的单酯或 二酯、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4- 丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、 1，6-己二醇；以及它们的混合物。

在一个优选的实施方案中，所述底物选自乙酸乙酯、乳酸甲酯、乳酸 乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟 基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、2-乙酰柠檬酸三乙酯、葡萄糖五乙酸酯、葡 糖酸内酯、甘油酯(单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯)如甘油一乙酸酯、甘 油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯(二丙酸甘油基 酯)、甘油三丙酸酯(1，2，3-三丙酰基甘油)、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸 酯(二丁酸甘油基酯)、甘油三丁酸酯(1，2，3-三丁酰基甘油)、乙酰化 糖、以及它们的混合物。

在另一个优选的方面，羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸 酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一 丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在又一方 面，羧酸酯底物选自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。 在一个优选的方面，羧酸酯为选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙 酸酯、以及它们的混合物的甘油酯。

本发明使用的惰性溶剂包括水或包含至少50重量％水的溶液。附加的 溶剂包括一元醇、单官能和多官能醇，优选包含约1至约6个碳原子和1至 约6个羟基。实例包括乙醇、异丙醇、正丙醇、1，2-丙二醇、1，2-丁二醇、2- 甲基-2，4-戊二醇、甘露糖醇和葡萄糖。更高级的二醇类、聚乙二醇、多聚氧 化物、乙二醇醚和丙二醇醚也是有用的。附加的溶剂包括游离酸和下列碱金 属盐：磺化的烷基芳基如甲苯、二甲苯、异丙基苯和苯酚或苯酚醚或二苯醚 磺化物；烷基和二烷基萘磺化物以及烷氧基化衍生物。

对本发明有用的组合物还可包含一种或多种表面活性剂。不受理论的 约束，据信表面活性剂将有助于润湿要涂覆的表面并且将有助于通过膜而平 坦覆盖。据信表面活性剂也有助于当被移除时通过膜起泡，从而辅助移除膜 并洗涤受保护的表面。合适的表面活性剂具有优选的约9至约17的亲水-亲 脂平衡(HLB)。合适的表面活性剂包括但不限于：两性表面活性剂如来自 Tomah Products的Amphoteric N；硅酮表面活性剂如得自BYK Chemie (BYK-Chemie GmbH，Wesel，Germany)的BYK 348；氟化表面活性剂如 得自DuPont(Wilmington，DE，USA)的ZonylFS300；和基于壬基苯酚 聚氧乙烯醚的表面活性剂如得自Dow(Midland，MI，USA)的Triton N- 101。其他合适的表面活性剂包括乙氧基化的癸炔二醇如得自Air Products& Chemicals(Allentown，PA，USA)的Surfynol 465；烷芳基聚醚如得自 Dow的Triton CF-10；辛基苯氧聚乙氧基乙醇如得自Dow的Triton X-100； 乙氧基化的醇如得自Shell(The Hague，the Netherlands)的Neodol 23-5或 Neodol 91-8；得自Dow的Tergitol 15-S-7；得自Stepan Company (Northfield，IL，USA)的Steol-4N，28％的月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠；胺 化氧如得自Stepan的AmmonyxLO；EO/PO嵌段共聚物如得自BASF (Parsippany，NJ，USA)的Pluronic17R4；脱水山梨糖醇衍生物如得自 Uniqema(New Castle，DE，USA)的Tween 20或Tween 60；和季铵化合 物如苯扎氯铵。其他适当的表面活性剂包括有机金属-硅氧烷表面活性剂， 如得自Setre Chemical Company(Memphis，TN，USA)的SilwetL-77；得 自DowCorning Silicones(Midland，MI，USA)的DowCorningQ2-5211； 或得自Siltech Corporation(Toronto，ON，Canada)的SilsurfA008。

它对保护性薄膜的柔韧性和完整性可能是重要的，所得膜被塑化。就 本发明而言所述膜的塑化已通过掺入合适的增塑剂如聚乙二醇或甘油来完 成。适用于本发明的其他增塑剂包括但不限于溶剂、多元醇、平均分子量为 200至800g/mol的聚乙二醇和山梨醇。PEG相对于甘油来说是优选的，因为 甘油易于被微生物代谢，潜在地导致微生物生长。

加入增塑剂一般也允许膜保留轻微发粘的表面感觉。随着增塑剂含量 提高，所得膜也将表现出提高的粘着性。为了捕集空气传播的微粒和垢或其 他物质，此类粘着性在低水平下可为期望的。然而，如果增塑剂含量太高， 涂层变得过于发粘并且将显示出对偶然的机械移除如擦拭的低抗性。

优选的增塑剂量为成膜试剂重量的约1重量％至约20重量％，更优选 地为约5重量％至约10重量％。

本发明可用的组合物也可包含一种或多种流变改性剂用于提高粘度、 或增稠并引起含水处理剂或涂料组合物粘附到表面。粘附使该组合物能够保 持与临时的和驻留的微生物接触较长时间，增强杀菌功效并防止因为过多的 滴落导致的垃圾。流变改性剂可为成膜试剂或与成膜试剂协同作用以形成提 供附加保护的屏障。有用的水溶性或水分散性流变改性剂可被分类为无机的 或有机的。有机增稠剂可进一步被分为天然的和合成聚合物，后者被进一步 分为合成的天然基和合成的石油基。

无机增稠剂一般为经过熏蒸或沉淀从而产生具有大的表面对尺寸比率 的颗粒的化合物，例如胶态硅酸镁铝类(VEEGUM)、胶质粘土(膨润 土)、或二氧化硅(CAB-O-SIL)。有用的天然水凝胶增稠剂主要是蔬菜 来源的流出物。例如，黄蓍胶、刺梧桐树胶和阿拉伯树胶；和提取物如角叉 菜胶、刺槐豆胶、瓜耳胶和果胶；或纯培养物发酵产物如黄原胶都潜在地可 用于本发明。化学上讲，所有这些材料均为复合的阴离子多糖的盐。有用的 合成的天然基增稠剂为纤维质的衍生物，其中在直链的脱水葡萄糖聚合物上 的游离羟基已被醚化或酯化，从而产生在水中溶解并形成粘稠溶液的一类物 质。这类材料包括烷基纤维素和羟基-烷基纤维素，具体地讲包括甲基纤维 素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟乙基纤 维素、乙基羟乙基纤维素、羟丙纤维素和羧基甲基纤维素。另一类优选的增 稠剂包括聚丙烯酸酯如专有的Acusol增稠剂，(例如Acusol 823，Rohm  and Haas，Philadelphia，PA，USA)，和Carbopol增稠剂如Carbopol 934或 Carbopol Aqua-30聚合物(B F Goodrich，Cleveland，OH，USA)。附加的 优选基于丙烯酸酯的流变改性剂包括专有的阳离子Rheovis增稠剂(Ciba， Basel，Switzerland)。聚丙烯酸酯增稠剂可按成膜试剂的重量计以至多3重 量％的浓度进行使用。也可使用增稠剂的混合物，其中取决于所使用的增稠 剂和所期望的最终产物的粘度，所述混合物的总量可为按重量计至多3重量 ％。

就本专利申请而言，其他可能的增稠剂包括糊精、玉米淀粉和含水硅 酸镁类，例如以商品名Laponite XLG(Southern Clay Products，Inc.， Gonzales，TX，USA)销售的硅酸镁钠。

除了原位生成过氧酸之外，组合物中可存在一种或多种附加的抗微生 物剂。对本发明有用的抗微生物剂可为无机剂或有机剂、或它们的混合物。

本文所用术语“无机抗微生物剂”是对包含金属或金属离子如银、 锌、铜等并且具有抗微生物特性的无机化合物的统称。

本发明不受对任何特定的抗微生物剂的选择的限制，并且任何已知的 水溶性或水分散性抗微生物剂均可被包括在本发明的组合物中，例如抗微生 物剂、防霉剂、防腐败剂、消毒剂、消毒杀菌剂、杀菌剂、除藻剂、防污塞 剂、防腐剂、以及上述的组合等等，前提条件是所述抗微生物剂与组合物中 的其他组分化学上相容。抗微生物剂的适当类别描述于下文中。

可用的抗微生物剂的实例包括氯己定、葡萄糖酸氯己定、戊二醛、哈 拉宗、六氯酚、呋喃西林、迷他芬、硫柳汞、C1-C5-对羟基苯甲酸酯、次氯 酸盐、卤卡班、氯苄酚、酚醛树脂、醋酸磺胺米隆、盐酸氨吖啶、季铵盐、 氯和溴释放化合物(例如碱和碱土次氯酸盐和次溴酸盐、异氰尿酸盐、乙内 酰脲的氯化衍生物、磺酰胺、胺等)、过氧化物和过氧酸化合物(例如过乙 酸、过辛酸)、质子化的短链羧酸、氧氯苯磺酸、美溴沙仑、汞溴红、双溴 沙仑、甘油月桂酸酯、1-氧-2-巯基吡啶钠和/或锌、磷酸三钠盐、(十二烷 基)(四甲二胺)甘氨酸和/或(十二烷基)(氨基丙基)甘氨酸等。可用 的季铵盐包括N-C₁₀-C₂₄-烷基-N-苄基-季铵盐，其包含水增溶的阴离子如卤 化物，例如氯离子、溴离子和碘离子；硫酸盐、硫酸二甲酯等以及杂环的亚 胺如咪唑啉盐。季铵盐也可包括其他非卤化的阴离子如丙酸盐和糖精等。有 用的酚醛树脂杀菌剂包括苯酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、邻-苯基-苯酚、 4-氯-间甲酚、氯二甲苯酚、6-正戊基-间甲酚、间苯二酚、间苯二酚-乙酸 酯、对-叔丁基苯酚和邻苄基-对氯酚。已知对防止霉菌菌落可见生长有效的 有用的抗微生物剂包括例如3-碘代-2-炔丙基氨基甲酸丁酯、2-(4-噻唑基) 苯并咪唑、对甲苯基二碘甲基砜、四氯间苯二甲腈、2-吡啶硫醇-1-氧化物 (包括其盐)的锌络合物以及上述的组合。包含抗微生物剂的涂料组合物提 供对各种不同的微生物的防护。

在一个实施方案中，涂料组合物防护革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 涂层抑制或杀灭的革兰氏阳性菌包括但不限于破伤风梭菌(Clostridium  tetani)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、肉毒梭菌(C.botulinum)、其 他梭菌属(Clostridium)菌种、结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、鼠伤寒分枝杆菌(M. typhimurium)、牛分枝杆菌(M.bovis)菌株BCG、BCG亚株、鸟分枝杆 菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、非洲分枝杆菌(M. africanum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海鱼分支杆菌(M. marinum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M. avium subspecies paratuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus  aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、马链球菌(S.equi)、酿脓链 球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)、单核细胞增 多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、依氏李斯特菌(L.ivanovii)、炭 疽杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、星形诺卡菌 (Nocardia asteroides)和其他诺卡氏菌属、草绿色链球菌(Streptococcus  viridans group)、消化球菌属菌种(Peptococcus species)、消化链球菌属 菌种(Peptostreptococcus species)、衣氏放线菌(Actinomyces israelii)和 其他放线菌属菌种(Actinomyces species)、疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)和肠球菌属菌种(Enterococcus species)。涂层 抑制或杀灭的革兰氏阴性菌包括但不限于铜绿假单胞菌(Pseudomonas  aeruginosa)、其他假单胞菌属菌种(Pseudomonas species)、弯曲杆菌属 菌种(Campylobacter species)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、埃利希氏体 属菌种(Ehrlichia species)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus  pleuropneumoniae)、溶血性巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)、出血败 血性巴斯德菌(P.multocida)、其他巴斯德属菌种(Pasteurella species)、 退伍军人病菌(Legionella pneumophila)、其他军团菌属菌种(Legionella  species)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、其他沙门氏菌属菌种 (Salmonella species)、志贺氏菌属菌种(Shigella species)流产布鲁氏菌 (Brucella abortus)、其他布鲁氏菌菌种(Brucella species)、沙眼衣原体 (Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、伯氏考克斯氏体 (Coxiella burnetti)、脑膜炎双球菌(Neiserria meningitidis)、淋球菌(N. gonorrhea)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、杜克雷嗜血杆菌 (H.ducreyi)、其他嗜血杆菌菌种(Haemophilus species)、鼠疫耶尔森氏 杆菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterolitica)、其他耶 尔森氏菌属菌种(Yersinia species)、大肠杆菌(Escherichia coli)、希拉 肠球菌(E.hirae)和其他埃希氏菌属菌种(Escherichia species)、以及其 他肠杆菌(Enterobacteriacae)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia  cepacia)、类鼻疽伯克霍尔德菌(B.pseudomallei)、土拉热弗朗西丝菌 (Francisella tularensis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、核粒梭菌 (Fusobacterium nucleatum)、普雷沃氏菌属菌种(Provetella species)、反 刍动物考德里氏体(Cowdria ruminantium)、克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella  species)和变形杆菌属菌种(Proteus species)。

在另一个实施方案中，所述涂层提供对真菌的保护，所述真菌包括但 不限于链格孢属(Alternaria alternata)、黑曲霉(Aspergillus niger)、出 芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、支孢样支孢霉(Cladosporium  cladosporioides)、澳大利亚德氏霉(Drechslera australiensis)、禾谷粘鞭 霉(Gliomastix cerealis)、稻瘟病丛梗孢属(Monilia grisea)、团青霉 (Penicillium commune)、类茎点霉(Phoma fimeti)、纸皮思霉 (Pithomyces chartarum)和人类线状担子菌(Scolecobasidium humicola)。

痕量杂质尤其是金属可与过氧化氢和过氧酸反应并引起分解。因此许 多过氧化物/过氧酸组合物包括稳定成分，例如鳌合金属的化合物和包含金 属的杂质材料。优选的螯合剂的实例包括但不限于，亚烷基氨基磷酸或其 盐，它们中的一些以商品名Dequest(Thermphos，Vlissingen，the  Netherlands)售卖、1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸及其盐，它们中的一些以商品 名Turpinal(Thermphos)售卖，和2-膦酰基-1，2，4-丁烷三羧酸或其盐，其 以Bayhibit的商品名得自LANXESS Corporation(Pittsburgh，PA， USA)。另一类适用的化合物是氨基羧酸或其盐。一个实例为乙二胺四乙 酸。

此外，其他适用的螯合剂包括吡啶二羧酸、乙烷-1，1，2-三膦酸和亚乙 基-1，1-二膦酸。此外，本领域也熟知的螯合剂为磷酸盐、多磷酸盐、焦磷酸 盐和羧酸如柠檬酸或水杨酸。将有足量的稳定剂或多种稳定剂存在以抑制过 氧化物/过氧酸的分解。

本发明可任选地包括着色剂或染料。对本发明有用的着色剂包括染料 和颜料如食品级颜料。

对本发明有用的染料既包括水溶性的也包括水不溶性的染料。水溶性 染料可被容易地配入到本发明的含水体系中。水不溶性的染料可被包括在可 分散于或悬浮于对本发明有用的抗微生物涂层组合物中的油相中。就本发明 的目的而言，有用的染料通常为吸收可见光从而导致可发现颜色的显现的有 机化合物。也可使用荧光染料，例如为了通过紫外光使膜显色。

在本发明中典型有用的染料是被批准用于食物、药物、化妆品和医疗 设备的着色剂。当前使用的着色剂以及它们的状态如下：食品中允许使用的 着色剂为(1)经过认证的：FD&C蓝1号、FD&C蓝2号、FD&C绿3号、 FD&C红3号、FD&C红40号、FD&C黄5号、FD&C黄6号、Citrus红2 号和橙(B)(2)免除认证的：胭脂树橙提取物、θ-衍-8′-胡萝卜素醛、角 黄素、焦糖、θ-胡萝卜素、胡萝卜油、胭脂虫提取物(胭脂红)、玉米胚乳 油、脱水甜菜(甜菜粉末)、干藻类粗粉、葡萄糖酸亚铁、果汁、葡萄颜色 提取物、葡萄皮提取物、甜辣椒、辣椒油、核黄素、藏红花、合成氧化铁、 万寿菊粗粉和提取物、二氧化钛、部分烘烤的脱脂烹煮棉籽粉、姜黄、姜黄 油树脂、群青蓝和蔬菜汁。药物中允许使用的着色剂(包括食品中允许使用 的着色剂)为(1)经过认证的：FD&C红4号、D&C蓝4号、D&C蓝9 号、D&C绿5号、D&C绿6号、D&C绿8号、D&C橙黄4号、D&C橙黄 5号、D&C橙黄10号、D&C橙黄11号、D&C红6号、D&C红7号、 D&C红17号、D&C红21、D&C红22号、D&C红27号、D&C红28号、 D&C红30号、D&C红31号、D&C红33号、D&C红34号、D&C红36 号、D&C红39号、D&C紫2号、D&C黄7号、D&C黄8号、D&C黄10 号、D&C黄11号和Ext.D&C黄7号。此外，鸡油菌素、β胡萝卜素、叶绿 酸和其他色素是已知的。对于被批准的色素的更加详细的列表和/或讨论， 参见D.M.Marmion，Handbook of U.S.Colorants，Foods，Drugs，Cosmetics  and Medical Devices，John Wiley&amp；Sons Inc.，New York(1991)和 U.S.Code of Federal Regulations，Title 21，parts 70-82。

本发明可任选地包括交联剂。与成膜组合物一起使用交联剂的优点包 括影响膜的机械特性，例如粘着性和机械强度，以及涂层的溶解度。此外， 交联降低粘着性并阻止垢和微生物物理上附着到聚合物膜，这可为某些应用 所期望的。调整交联度以获得期望的特性组合。

适用于聚乙烯醇及其共聚物的交联剂包括但不限于：醛(例如甲醛、 乙二醛、戊二醛)、硼酸、四硼酸钠、金属离子(例如锌、铁、铝、镍、 钒、钴、铜、锆、钛、锰离子)、有机金属化合物(例如有机钛酸盐如 DuPont Tyzor、有机Cr(III)络合物如DuPont Quilon)、硅氧烷(例如 四乙氧基硅烷、聚二甲基硅氧烷)、异氰酸盐(例如封端的、水溶性的或分 散型的异氰酸盐)、环氧化物(例如二缩水甘油醚)、二元羧酸(例如草 酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸)、基于脲的交联剂(例如Sunrez 700)。铋和三价金属阳离子(例如Fe(II)、Fe(III)、Al(III))是优 选的，因为当膜干燥时它们在PVOH聚合物链之间形成共价键。这允许交 联剂被加入成膜液体中成为‘一锅’混合物。为了在不沉淀其他成分如粒状 流变控制剂的情况下高效地交联聚合物，必须仔细的选择合适的浓度。

在多数情况下交联剂将利用标准混合技术与其他成分混合。交联反应 可任选地在存在催化剂的情况下进行，这对本领域的技术人员来说是熟知 的。在醛、异氰酸酯、硅氧烷、二缩水甘油醚和二元羧酸的情况下，可附加 地利用加热和酸催化剂或金属催化剂。

制剂中的交联剂浓度可为零至上限，上限或通过沉淀开始形成时的制 剂稳定性限度确定，或通过高效地移除所得膜时的不稳定性确定。

优选的交联剂浓度很大程度上可取决于交联剂的类型，并且通常低于 聚合物含量的25重量％，更优选地低于聚合物含量的10重量％。

除了前述组分之外，本发明的组合物也可包含一种或多种性能强化添 加剂，也称为“性能增强剂”。这些增强剂包括闪锈抑制剂，其包括用于水 基体系的任何数量的有机或无机材料，用于防止接触该材料的和无遮蔽的金 属生锈。两个实例是苯甲酸钠或苯并三唑。

另一种任选的性能强化添加剂包括推荐用于水基体系的一个或多个消 泡剂的组合，其用于防止产品在施用期间不期望的泡沫。泡沫太多可破坏产 品形成所需的连续膜并导致失效。加入泡沫控制产品也可对混合和加工遮蔽 组合物有利，例如得自Ashland Chemical，Inc.Drew Industrial Division (Covington，KY，USA)的Drewplus L475。附加的任选的性能强化添加剂 为用于提高涂层制剂的储存寿命的抗氧化剂。一个实例为丁基化羟基甲苯。 此外附加的添加剂包括芳香剂。

可附加地加入发泡剂以在施用的涂层中产生气泡。气泡可用作遮光剂 以有利于施用和/或允许接触表面较长时间；例如通过阻止从斜面上滴落和/ 或减少处理某个表面积或体积的涂层制剂的需用量。

也可加入施用指示剂。这些指示剂中的一些如上所述，但是包括颜 料、染料、荧光染料、pH指示剂或在施用期间产生气泡。

少量(按重量计通常小于1％)的这些附加材料可被加入，同时对水或 其他组分进行适当的调整。应当了解，上述任选组分的任何一种或多种的混 合物也可予以使用。

就由纤维基质组成的区域而言，任选的性能增强成分为提供表面效果 的制剂。此类表面效果包括免烫性、易烫性、收缩控制、抗皱、耐久定形、 水分控制、柔软性、强度、防滑性、防静电性、防钩伤性、防起球性、抗污 性、去污性、拒垢性、去垢性、拒水性、拒油性、气味控制、抗微生物性、 或防晒性。

可通过任何装置包括倾注将所述膜或涂层施用到目标表面或区域。膜 或涂层用于在目标表面上实现连续的和/或均匀的层。常规用于漆料和涂层 的涂覆体系可用于涂覆，例如但不限于刷子、滚筒刷、培克刷、垫子、海 绵、梳子、手动泵分配器、压缩空气驱动的喷枪、无气喷枪、电子或静电雾 化器、背包喷涂法设备、气溶胶喷雾罐、衣物、纸材、羽毛、触针、刀子和 其他施用工具。如果将浸渍用作施用涂层的方法，不需要特殊的设备。如果 将气溶胶喷雾用于施用，涂料组合物可与气溶胶推进剂(例如压缩气体)混 合或涂料组合物可通过阻挡材料如罐内的聚合物袋与推进剂物理上分离；如 果涂料组合物和推进剂混合，所述混合物可构成一个或多个液相。

就纤维质基底如纺织物和地毯而言，可通过吸尽、泡沫、弹性交咬、 交咬、浸轧、湿润辊、辗锻、绞丝、绞盘、液体注射、溢流、辊、刷子、滚 筒、喷雾、浸渍、浸入等施用所述涂层。也可通过采用常规缸染法、连续染 色法或纺丝流水线应用来施用该涂层。

在本公开的一个实施方案中，静电喷涂器可被用于涂覆所述表面。静 电喷涂器通过高电势赋予含水涂料组合物能量。该能量起到使含水涂料组合 物雾化和使其充电的作用，以产生细小的荷电颗粒喷剂。静电喷涂器可容易 地购自供应商如Tae In Tech Co.，South Korea和Spectrum，Houston，TX， USA。

在本发明的另一个实施方案中，无气喷枪可用于涂覆目标表面。无气 喷枪利用高的流体压力和特定喷嘴而不是压缩空气来输送和雾化液体。通过 流体泵在通常介于3.5至45MPa范围内的压力下将液体供应至无气喷枪。 当漆料以这样的压力离开流体喷嘴时，它将略微展开并雾化为小滴，而没有 雾化空气的影响。喷出的漆料的高速度将小滴推向目标表面。在无气喷枪上 的流体喷嘴基本上不同于在空气雾化喷枪上的流体喷嘴。合适喷嘴的选择决 定了递送多少漆料以及施用的送风模式。无气喷嘴孔口的大小决定喷出的漆 料数量。无气流体递送是高速的，其速度介于700-2000mL/min的范围内。 推荐的喷枪距离为距离目标约30cm，并且取决于喷嘴类型，10至45cm的 送风模式是可能的。因此，可基于目标表面的大小和形状以及需施用的涂层 的厚度针对每次施用选择喷嘴。无气喷枪产生微小的气流扰动，这可从“难 以到达的区域”排出液体，这种情况将存在于食品加工设备、孵卵所等中。 高流速使得无气在清洁和消毒时有利，其中抗微生物涂层将被施用到较大表 面区域和多个表面上。

所施用的和干燥的膜的厚度将取决于多种因素。这些因素包括成膜试 剂的浓度、流变控制添加剂和/或其他添加剂的浓度、以及施用的温度和湿 度。膜的厚度和膜的均匀度还至少部分地取决于施用设备的参数，例如流体 的输送、喷雾器孔口直径、空气压力或就无气施用而言的活塞泵压力和喷雾 涂敷器与目标表面的距离。因此，可对液体配方进行调整以产生所期望的膜 厚度。对涂料溶液的雾化进行选择，使得在目标区域上施用一层均匀的薄 膜。

目标表面(区域)包括潜在地可能被微生物污染的所有表面，包括通 常难以施用消毒剂或杀菌剂的表面(例如难以到达的表面)。目标表面的实 例包括存在于食品或饮料行业的设备表面(例如罐、传送装置、地面、排放 管、冷却器、冷冻器、冰箱、设备表面、天花板、墙、阀门、皮带、管道、 排放管、管道系统、接头、裂缝、它们的组合等)；建筑表面，包括在建的 建筑、新居建筑和在季节性建筑如假期家居之内或之上的表面(例如天花 板、墙、木质构架、地面、窗户、管道系统)、厨房(下水道、排放管、工 作台面、冰箱、切板)、浴室(淋浴器、盥洗室、排放管、管道、管道系 统、浴缸)、(尤其用于除霉)、甲板、木质表面、壁板和其他家居表面、 沥青木瓦屋顶材料、平台或石材区域(尤其是藻类处理)；船和船设备表 面；垃圾处理、垃圾箱和大型垃圾箱或其他垃圾移除设备和表面；非食品行 业的相关管道和排放管；存在于医院的表面；或其中提供外科手术、门诊病 人、或兽医服务的表面(例如天花板、墙、地面、管道系统、床、设备、医 院/兽医院或其他保健设施中的衣着，包括擦拭物、鞋和其他医院或兽医院 表面)第一反应器或其他紧急服务设备和衣服；锯木场设备、表面和木质产 品；餐馆表面；超市、杂货店、零售和便利店设备和表面；熟食店设备和表 面以及食品制备表面；酿酒厂和面包房表面；浴室表面如下水道、淋浴器、 台面和盥洗室；衣服和鞋；玩具；学校和体育馆设备、天花板、墙、地面、 窗户、管道系统和其他表面；厨房表面如下水道、台面、设施；木质或复合 甲板、水池、热浴缸和温泉表面；地毯；纸材；皮革；动物躯体、毛皮和兽 皮；牲口棚或家畜厩舍表面，例如家禽、牛、奶牛、山羊、马和猪；和家禽 或虾的孵卵所。在其中动物居住的建筑内的表面，例如鸟笼和畜栏，可用本 文所述的抗微生物涂层进行涂覆。附加的表面也包括食物产品，例如牛肉、 禽肉、猪肉、蔬菜、水果、海产品、它们的组合等。

适用于本发明的附加区域包括纤维质基底表面并包括纤维、纱线、织 物、纺织物、非织造材料、地毯、皮革、或纸材。纤维质基底由天然纤维如 羊毛、棉花、黄麻、剑麻、海草、纸材、椰皮纤维和纤维素、或它们的混合 物制成；或由合成纤维如聚酰胺、聚酯、聚烯烃、芳族聚酰胺、聚丙烯酸类 以及它们的共混物制成；或由至少一种天然纤维和至少一种合成纤维的共混 物制成。“织物”是指由纤维构成的天然或合成织物，或其共混物，所述纤 维如棉、人造丝、丝绸、羊毛、聚酯、聚丙烯、聚烯烃、尼龙和芳族聚酰胺 (诸如“NOMEX”和“KEVLAR”)。“织物共混物”是指由两种或更 多种类型的纤维制成的织物。通常这些共混物为至少一种天然纤维与至少一 种合成纤维的组合，但也可为两种或更多种天然纤维的共混物或两种或更多 种合成纤维的共混物。非织造基底包括例如射流喷网非织造材料，如得自E. I.du Pont de Nemours and Company(Wilmington，DE，USA)，和层压的非 织造材料如纺粘-熔喷-纺粘非织造材料。

表面材料的实例为金属(例如钢、不锈钢、铬、钛、铁、铜、黄铜、 铝、以及它们的合金)、矿物质(例如混凝土)、天然的或合成的聚合物和 塑料(例如聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、 聚丙烯腈、聚丁二烯、聚丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚(丙烯腈、丁二烯)、丙 烯腈丁二烯；聚酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯；和聚酰胺如尼龙)。附加表面 包括砖块、瓷砖、陶瓷、瓷器、玻璃、木质(地板)、聚乙烯树脂(地板) 和油毡。

用临时涂层保护的设备或表面可在保护状态下使用或不使用。目标表 面可为疏水性的或亲水性的。

涂覆体系也可为一种或多种组分，并且可包括催化剂。一般而言，涂 层大约被允许固定或干燥大于5分钟以形成膜。然而，该涂层在较短时间内 可为抗微生物有效的，例如在30秒后有效。取决于所期望的用途，涂层可 在其干燥前或干燥之后的任何时间被除去。干燥时间将部分地取决于若干因 素，包括环境条件如湿度和温度。干燥时间还将取决于所施用的涂层的厚 度。

施用到目标表面上的膜或涂层的厚度影响移除所需的时间和施用到表 面上的每单位面积生物杀灭剂的量。较厚的膜增加所述膜需被再施用以保持 期望的抗微生物特性时的时间间隔。膜越薄，通过冲洗移除时将越容易和快 速。因此通过以下方式施用所述制剂是重要的：所述施用产生的薄膜厚度既 易于移除涂层又具有长期的抗微生物特性。如上所述，膜或涂层的厚度为约 0.3至约300微米。在一个更具体的实施方案中，膜或涂层的厚度为约0.5 至约100微米。在一个更具体的实施方案中，膜或涂层的厚度为约1.0至约 30微米。

本发明涉及当使用者认为合适时可被移除的膜。涂层可容易地除去， 并且可通过用水性溶剂或溶液清洗表面而除去。移除时间可根据以下因素确 定：或(i)产生期望的抗微生物活性的期望最短接触时间，通常表达为杀 灭或灭活初始微生物种群中的微生物量，或(ii)在开始后续的操作或加工 步骤之前对从表面上移除涂层的需求或期望。虽然可在任何时候如干燥后移 除涂层，薄膜厚度、抗微生物剂浓度和特定用途决定合适的移除时间。例如 使用者可能期望处理后的设备在停止工作一段时间后恢复正常工作状态。例 如在吃水果之前需要洗涤。当膜中的生物杀灭剂耗尽时，可移除膜并施用新 涂层。例如可定期如每日、每周、或每两周处理排放管。可在施用所述膜后 尽早如30秒后、数小时后、数日后、数周后、数月后、甚至数年后测量抗 微生物活性。因此，移除涂层的时间是涂层用途的函数。

膜移除可通过溶解或分散所得涂层来完成。这可通过将水性溶液施用 于所述涂层上而实现。在一个实施方案中，溶液温度在约15℃至约100℃的 范围内。在另一个实施方案中，溶液温度为约30℃至约80℃。所述溶液或 水的施用可通过简单的冲洗或喷洒于表面上而实现。涂层移除也可通过使用 加压洗涤器来完成，其通过附加的机械应力促进移除。涂层移除也可通过用 沾水的布料或海绵洗涤来完成。此外，温和的添加剂可被利用或与所述水性 溶液混合，以帮助成膜试剂或水分散剂的溶解或分散，所述温和的添加剂包 括常用的酸或碱、螯合剂或洗涤剂。作为另外一种选择，可通过用水和/或 其他组分重复洗涤排放管降解例如在排放管中的膜。也可通过将所述膜剥离 表面、从表面上擦掉或刷掉、或其他机械移除机构来移除。

除了操作者有意地移除之外，移除也包括用自动化系统或机器人系统 移除以及无意的移除，例如在管道或排放管内用液体连续地或定期地接触涂 层一段时间后的移除，者连续地或定期地施加机械应力如磨损导致的移除。

接触时间指涂层或涂料组合物提供对接触或接近所述涂层或涂料组合 物的微生物抗微生物特性的时间。取决于对抗微生物剂的具体需要，接触时 间将不同，这如Germicidal and Detergent Sanitizing Action of Disinfectants，Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists， 第960.09段及适用章节，第15版，1990(EPA Guideline 91-2)所提出的那 样。例如，如果本公开的预期应用是用作接触食品表面的消毒剂，那么所述 组合物应在室温下在30秒内提供对若干种测试微生物的99.999％的减少 (5-对数级的减少)。如果预期应用是用作不接触食品表面的消毒剂，那么 所述组合物应在室温下在5分钟内提供对若干种测试微生物的99.9％的减少 (3-对数级的减少)。如果其目的在于使用该公开作为消毒剂，那么所述组 合物将在10分钟内提供99.9％的减少(3-对数级的减少)。如果预期应用 是提供残余的抗微生物活性，那么本发明方法将允许大于10分钟的接触微 生物的时间。

本发明的涂层提供物理屏障。物理屏障本文定义为由本发明的成膜组 合物形成的膜。所得膜密封处理的表面防止周围的污染，例如垢、脂肪、尘 埃、微生物等。这些污染物将保留在涂层表面上并将在移除涂层时被洗掉。

可制备并实施本文所公开并受权利要求书保护的所有组合物及方法而 无需按照本公开进行过度实验。尽管本公开的方法和组合物已依据本发明的 各个方面和优选实施方案进行了描述，但对本领域的技术人员显而易见的是 可将变型应用于组合物与方法以及本文所述方法的步骤中或步骤序列中而不 脱离本发明的概念、实质和范围。更具体地讲，将显而易见的是化学相关的 某些试剂可取代本文所述的试剂同时实现相同或相似结果。对本领域的技术 人员显而易见的所有此类相似替代品及变型被认为是在如所附权利要求所定 义的本发明的实质、范围及概念内。

一般方法

重组技术和微生物生长

实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且描 述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring  Harbor，N.Y.，1989，T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist， Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring  Harbor，N.Y.，1984，以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience，N.Y.， 1987。

适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内也是众所周知的。 适用于下面实施例的技术可存在于以下文献中：Manual of Methods for General Bacteriology，Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N. Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs  Phillips编辑，American Society for Microbiology，Washington，DC，USA， 1994，或Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，USA， 1989。

除非另外指明，使用的用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性 内切酶和材料均得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI，USA)、BD  Diagnostic Systems(Sparks，MD，USA)、Life Technologies(Rockville， MD，USA)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO，USA)。

SDS凝胶电泳

SDS凝胶电泳使用本领域熟知的方法进行。

硬质表面上的抗微生物活性的测试方法

过酸可具有生物杀灭活性。本领域已知的可适用于本发明的典型备选 生物杀灭剂包括例如氯、二氧化氯、氯异氰尿酸盐、次氯酸盐、臭氧、胺、 氯酚、铜盐、有机硫化合物和季铵盐。使用下述的两种测试方法测量涂料组 合物的生物杀灭功效或抗微生物功效。

不接触食品的消毒剂测试：为了评估涂料组合物在下述情况下的抗微 生物活性：其中在施用所述抗微生物涂层组合物时微生物污染已在目标表面 上存在，使用如ASTM标准E1153-03所述的“Standard Test Method for  Efficacy of Sanitizers Recommended for Inanimate Non-Food Contact  Surfaces”。该测试方法称为不接触食品的消毒剂测试或“NFC测试”。

残余自身消毒测试：为了评估涂料组合物在下述情况下的抗微生物活 性：其中微生物污染接触已干燥的涂层，使用下列残余自身消毒测试方法。 该测试方法称为残余自身消毒测试或“RSS测试”。使用大小为25.4× 25.4mm的无孔的、预清洁的、不锈钢(SS316型)试块进行测试。从生物 体的初始平板(连续转移三次但不超过30次转移)中选择一个菌落并将其 置于10mL AOAC营养肉汤(氯化钠2.5g；牛肉膏2.5g；Anatone 5g；去离 子水500mL)中。在35℃下静态培养接种后的培养物24小时。在制备测试 种菌时，用涡旋搅拌器剧烈搅拌静态培养物，静置15分钟，并将上部三分 之二的培养物转移到无菌管(大约6mL)中。加入胎牛血清(FBS)的有机 垢负载至终浓度为这一测试种菌5重量％的有机垢负载。最终的测试种菌密 度为大约1×10⁸CFU/mL。

将测试试块置于70重量％的乙醇中过夜，浸泡在温和洗涤剂中至少30 分钟，用自来水彻底冲洗并风干。表面一旦清洁后，所有抓握动作用无菌镊 子完成。试块喷洒70重量％的乙醇并彻底干燥。将待测试的涂料组合物的 等分试样(50μL)施用到每个不锈钢试块，用无菌塑料铺展器均匀铺展， 将其置于无菌塑料培养皿中并在生物安全柜中风干过夜。记录环境空气温度 和相对湿度。将未涂布的试块用作对照表面，其在与用涂料组合物处理的试 块相同的条件下进行处理。

通过在所述涂覆试块表面上斑染0.01mL的种菌给试块接种，使用至少 30个菌斑。每个涂料组合物接种至少两个平行测定试块。在5分钟后，将 测试试块无菌转移到20mL Bacto^TM D/E中和肉汤中。用手剧烈振荡所述管， 在超声波水浴中以最大功率处理10s，最后在旋转振荡器上以250rpm振荡4 分钟。培养物的细胞密度使用系列稀释铺板技术用Butterfield Phosphate  Buffer稀释管和Trypticase^TM Soy Agar(TSA)培养皿计算。计算所有样品在 大约30分钟内转移到D/E中和肉汤中的数量。

将经处理的和未经处理的试块平行测定的平均细胞密度(CFU/mL)计 算成单独CFU测量的几何平均数。所有对数为基于10的对数。

实施例

为演示本发明的优选方面，本文提供了以下实施例。本领域的技术人 员应认识到下文实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实施中 功能良好的技术，因此可认为其构成实施的优选模式。然而，本领域的技术 人员应依据本发明理解的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对 所公开的具体实施方案进行许多更改并仍能获得相同或相似的结果。

实施例中使用的缩写词

在说明书中的以下缩写词对应于如下的测量、技术、特性、或化合物 单位：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时， “mm”指毫米；“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指 毫摩尔每升，“M”指摩尔每升，“mmol”指毫摩尔，“℃”指摄氏度； “ppm”指份每一百万份并且指mg/L(毫克每升)，在以下实施例中， “wt”指重量，“wt％”指示按重量计的百分比，“g”指克，“μg”指微 克，“g”指地心引力常数，“HPLC”指高效液相色谱法，“dd H₂O”指 蒸馏并去离子的水，“DI”指去离子的，“dcw”指干细胞重量， “ATCC”或“ATCC”指美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA， USA)，“U”指过水解酶活性单位，“U/mg protein”指每毫克蛋白的过水 解酶活性单位，“rpm”指每分钟转数，“EDTA”指乙二胺四乙酸， “PAA”指过乙酸，“PEG”指聚乙二醇，“Pa·s”指帕秒；“IPTG”指异 丙基-β-D-硫代半乳糖苷；“MPa”指兆帕斯卡；“NMWCO”指示标称截 留分子量，“LB”指Luria肉汤培养基，“OD”指光密度，“g feed/min” 指每分钟投料克数，“SDS”指十二烷基硫酸钠，“o-DA”指邻联茴香 胺，“pNPA”指乙酸对硝基苯酯，“L·cm^-1·mol^-1”指每摩尔每厘米升， “mg/mL”指毫克每毫升，“kg”指千克，“U/mg”指每毫克单位数， “CFU”指菌落形成单位；“FBS”指胎牛血清；“log CFU”指CFU数量 的常用对数10；“CFU/mL”指每毫升CFU；“NFC”指不接触食品的消毒 剂测试；“RSS”指残余的自我消毒活性；“SS316”指不锈钢316型 (ASTM标准)；“TAED”指四乙酰乙二胺。

化学品

所有化学药品得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)，除非另外 指明。Elvanol51-04(部分水解等级的聚乙烯醇，88％等级)得自DuPont (Wilmington，DE，USA)。平均分子量为300g/mol(Carbowax^TM PEG- 300)的聚乙烯二醇得自Dow(Midland，MI，USA)。BTC885、 Onyxide3300和BiosoftN25-7得自Stepan(Northfield，IL，USA)。 BTC885包含50重量％的季铵化合物作为抗微生物剂以及50重量％的惰性 材料。RheovisFRC得自Ciba(Basel，Switzerland)。Glucopon215UP得 自Cognis Corporation(Cincinnati，OH)。PC 5450NF得自Performance  Chemicals，LLC(Concord，NH)。四乙酰乙二胺(TAED B675)得自 Warwick International Ltd.(Flintshire，UK)。过碳酸钠(ProvoxC)得自 OCI Chemical Corp.(Decatur，AL，USA)。TurpinalSL得自Thermphos (Vlissingen，the Netherlands)。SilwetL-77得自Setre Chemical Company (Memphis，TN，USA)。微生物培养基得自DIFCO Laboratories (Detroit，MI，USA)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD，USA)、TCI America(Portland，OR，USA)、Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis，IN，USA)或Sigma-Aldrich Chemical Company(St.Louis， MO，USA)。Bacto^TM D/E中和肉汤得自Difco(Cat.No.281910，Difco^TMLaboratories，Detroit，MI，USA)。

pNPA微板测定法

向96孔微板的每四个孔中加入170μL磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.2)和或10μL 0.1mg的总蛋白/mL细胞裂解液，或10μL 0.02mg的总蛋白 /mL喷雾干燥的酶溶液。覆盖该微板并将其置于微板阅读器(Molecular  Devices SPECTRAmax384Plus)中，然后混合若干秒并在30℃平衡10分 钟。然后向该微板的每个孔同时加入20μL 30mM pNPA溶液，该溶液通过 混合乙腈中的(紧接着使用前)0.6mL 100mM pNPA与1.4mL 50mM磷酸钾 缓冲液(pH 7.2)来制备。在1分钟的反应时间里测量400nm的吸光度变 化。在四个孔中分别测量pNPA水解的背景速度(从在存在酶的情况下测得 的水解速度中减去)，该测量通过用10μL/孔磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.2)取代细胞裂解液或含酶溶液来进行。在pH 7.2的1-cm路径长度槽中测 得的对硝基苯酚的消光系数为10,909L·cm^-1·mol^-1。一pNPA单位的酶活性等 同于在一分钟内催化一微摩尔pNPA水解的蛋白量。

测定流变学特性

使用Brookfield Digital Viscometer Model DV-II(Brookfield Engineering  Laboratories，Middleboro，MA，USA)，用RV系列锭子#6和高玻璃烧杯 评估液体抗微生物制剂的流变学特性。将样品注入玻璃烧杯中以加载样品。 在不同rpm下测量粘度。

高效液相色谱(HPLC)

使用HPLC测定反应混合物中的PAA浓度。使用Supelco Discovery C8 柱(15cm×4.0mm，5μm)和预柱Supelco Superguard Discovery C8。注射体 积为10μL。下表示出用乙腈和去离子水在1.0mL/min和环境温度下的梯度 方法。

使用这一HPLC方法的受关注化合物的保留时间为：MTSO(甲基对- 甲苯亚砜)＝2.34分钟；DEET(N，N-二乙基间甲苯酰胺)＝4.40分钟； TPPO＝(三苯基氧膦)＝5.02分钟；MTS＝(对甲基硫甲苯)＝5.99分钟， TPP＝(三苯基膦)＝6.48分针。

实施例1

克隆并表达来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的乙酰木聚糖酯酶

使用优化用于在大肠杆菌中表达的密码子合成编码来自那不勒斯栖热 袍菌(Thermotoga neapolitana)的乙酰木聚糖酯酶的编码区(GENBANK登录号#AAB70869，SEQ ID NO：7)(DNA 2.0，Menlo Park，CA， USA)。随后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个 循环)，使用引物SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19扩增编码区。将所得核 酸产物(SEQ ID NO：20)亚克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)中以生成质粒pSW196。质粒pSW196用于转化大肠 杆菌KLP18以生成菌株KLP18/pSW196(参见公布的美国专利公开申请 2008/0176299，其全文以引用方式并入本文)。KLP18/pSW196在LB培养 基中在37℃下振荡培养至OD_600nm为0.4-0.5，在那时将异丙基-β-D-硫代半 乳糖苷(IPTG)加至终浓度为1mM，并继续培养2-3小时。离心收获细胞 并贮存在-80℃的20重量％甘油中；使用SDS-PAGE测定在20-40％的总可 溶解蛋白中的过水解酶表达。

实施例2

表达那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)过水解酶的大肠杆菌KLP18/pSW196的发酵

发酵在三个阶段进行：在烧瓶中制备预种子、在14-L发酵罐中制备种 子、以及在200-L发酵罐中发酵放大。通过向一个2L摇瓶加料0.5L种子培 养基制备种子培养物，该种子培养基包含酵母提取物(Difco，1.0g/L)， K₂HPO₄(10.0g/L)，KH₂PO₄(7.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.0g/L)， (NH₄)₂SO₄(4.0g/L)，MgSO₄七水合物(1.0g/L)和柠檬酸铁铵 (0.10g/L)。将培养基的pH调节为6.8，将培养基封装于烧瓶中，然后进 行灭菌。灭菌后加入葡萄糖(50wt％，10.0mL)和1mL氨苄青霉素 (25mg/mL)储备液。将在20％甘油中的1-mL大肠杆菌KLP18/pSW196的 培养物接种到种子培养基中，并在35℃和300rpm下培养。

将种子培养基转移到14-L种子发酵罐(Braun，B.Braun Biotech Inc.， Allentown，PA，USA)中，其在550nm的光密度为约1-2，罐中有8L培养 基，所述培养基包含KH₂PO₄(5.0g/L)，FeSO₄七水合物(0.05g/L)， MgSO₄七水合物(1.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.90g/L)，Biospumex153K 消泡剂(0.5mL/L，Cognis Corporation)，氯化钠(1.0g/L)，CaCl₂二水合 物(0.1g/L)，和微量元素溶液(10mL/L)，所述溶液包含一水合柠檬酸 (10g/L)，MnSO₄水合物(2g/L)，氯化钠(2g/L)，FeSO₄七水合物 (0.5g/L)，ZnSO₄七水合物(0.2g/L)，CuSO₄五水合物(0.02g/L)和 NaMoO₄二水合物(0.02g/L)。消毒后的加入物包括葡萄糖溶液(50重量 ％，80.0g)、氨苄青霉素(25mg/mL)原液(16.00mL)和硫胺素 (3.3g/L)原液(6.00mL)。溶解氧(DO)浓度控制在25％的空气饱和 度。首先通过叶轮搅拌(速率为400至1400rpm)，随后通过透气(在标准 条件下速率为2至10L/min)来控制DO。将温度控制在35℃。将pH控制 在6.8。NH₄OH(29重量％)和H₂SO₄(200g/L)被用于pH控制。将塔顶 压力保持在0.50巴。当培养物密度达到OD_550nm大于5时或当肉汤中的葡 萄糖浓度下降到小于1g/L时，将8L培养物转移到200L Sartorius Biostet- DCU-D生产发酵罐中。

加到200-L Sartorius Biostet-DCU-D生产发酵罐(Sartorius Stedium  North America Inc.，Bohemia，NY，USA)中的培养物初始体积为150L， 其中所述培养基使用与14-L种子发酵罐中的成分相同的成分制备。消毒后 的加入物包括葡萄糖-MgSO₄溶液(葡萄糖50重量％，MgSO₄七水合物1重 量％；1600g)、氨苄青霉素(25g/L)原液(3200mL)和硫胺素(3.3g/L) 原液(120mL)。溶解氧(DO)浓度控制在25％的空气饱和度。首先通过 叶轮搅拌(速率为200至450rpm)，随后通过透气(在标准条件下速率为 35至80L/min)来控制DO。将温度控制在35℃。将pH控制在6.8。 NH₄OH(29重量％)和H₂SO₄(200g/L)被用于pH控制。将塔顶压力保持 在0.50巴。将葡萄糖-MgSO₄溶液(葡萄糖(50重量％)和MgSO4七水合 物(1重量％)用于分批补料生长。当葡萄糖浓度下降到0.5g/L时给料葡萄 糖，开始速度为6.30g给料/分钟，逐渐提高到每小时分别为7.30、8.50、 9.8、11.40、13.30、15.40、17.2g/分钟；随后速率保持恒定。监测培养基中 的葡萄糖浓度，如果浓度超过0.1g/L，则降低进料速率或暂时停止进料。诱 导在OD_550nm的75(在26.7小时)通过加入180mL IPTG(0.5M)开始。 IPTG加入16小时后离心收集细胞。发酵在42.7小时终止，并且收获约 21kg湿细胞浆液，其具有3.4pNPA U/mg细胞干重的过水解酶比活性。

实施例3

制备那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)过水解酶

将细胞浆液(13kg；大肠杆菌KLP18/pSW196，如实施例2所述制备) 悬浮在pH 7.4的40L 50mM磷酸钠缓冲液中，使用APV 16.56匀化器(APV  Fluid Handling and Homogenizers，Delavan，WI，USA)在83MPa和室温条 件下将细胞悬浮液匀化，并将所得匀化产物加热到65℃，保持在这一温度 30分钟，然后冷却至室温。使用0.1微米的中空纤维膜滤芯(GE  Healthcare，Little Chalfont，United Kingdom)以从蛋白溶液中分离固体。澄 清的蛋白溶液然后用30,000NMWCO的中空纤维膜滤芯(GE Healthcare) 浓缩以获得14.7L的最终浓缩物，将其冷冻在-80℃。随后解冻这一材料并 进一步浓缩(30,000NMWCO)以提供7.5升溶液，所述溶液包含大约256 克蛋白(34.15g蛋白/L；使用Micro-BCA蛋白测定法(Sigma Life  Sciences，Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA)测定。向这一溶液中 加入500g Maltrin M100麦芽糖糊精、110g Maltrin M250玉米糖浆固体和 110g Maltrin M040麦芽糖糊精(全部得自Grain Processing Corporation (GPC)，Muscatine，IA，USA)。

将所得混合物(ca.7.9kg)喷雾干燥(入口温度＝225℃，出口温度＝76 ℃，进料速率＝60g/min)以制备总计786克固体(68％的产量)酶粉末： 93.2％的干重，20.3重量％蛋白，34.5pNPA U/mg蛋白。

实施例4

在聚乙烯醇的存在下用具有过水解酶活性的酶原位生成过乙酸

该实施例示出用在聚乙烯醇的存在下用具有过水解酶活性的酶原位生 成过乙酸。该反应用分离自那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)的过水解酶 进行。在配备有磁力搅拌棒的75mL玻璃瓶中放置12.3mL 0.2M碳酸氢钠缓 冲液(pH 7.2；44mM)、36.2mL去离子水、41.7mg TurpinalSL (Thermphos，Vlissingen，the Netherlands)、0.95mL甘油三乙酸酯 (90mM)和6.0g Elvanol51-04(20％水溶液，DuPont，Wilmington，DE， USA)并在室温下搅拌直至样品均匀。在这时加入0.51mL 30重量％的过氧 化氢(89mM)，紧接着加入在50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)中的 125μL 20mg/mL那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)过水解酶。使用硫酸铈 /硫代硫酸钠滴定分析法(Greenspan，F.P.；MacKeller，D.G.Anal. Chem.，20：1061-1063，1948)随时监控过氧化氢和过乙酸浓度。对照反应 用(12.3mL 0.2M碳酸氢钠缓冲液，pH 7.2，50mM；0.51mL 30％过氧化 氢，100mM；36.2mL去离子水；41.7mg TurpinalSL；0.95mL甘油三乙酸 酯，0.1M；在pH 7.2的50mM碳酸氢钠缓冲液中的125μL 20mg/mL那不勒 斯栖热袍菌(T.neapolitana)过水解酶(基于酶粉中的蛋白重量％))进 行，并且不加入酶(与上述无酶的对照条件相同)。经过30分钟后，用甘 油三乙酸酯和过氧化氢，在不加入酶的情况下进行对照反应，从甘油三乙酸 酯和过氧化氢的化学反应中生成114ppm的过乙酸。用甘油三乙酸酯和过氧 化氢，在加入酶的情况下进行对照反应，在1分钟内生成380ppm的过乙酸 并且经过30分钟增加到2280ppm。在聚乙烯醇的存在下原位酶促生成PAA 在1分钟内生成456ppm并且经过30分钟增加到1976ppm。表1示出在成膜 试剂的存在下原位酶促生成PAA生成的PAA。

表1

在聚乙烯醇的存在下酶促生成PAA

实施例5

在成膜组合物中用具有过水解酶活性的酶原位生成过乙酸

该实施例示出在成膜组合物与附加性能强化添加剂的存在下用具有过 水解酶活性的酶原位生成过乙酸。该反应用得自那不勒斯栖热袍菌(T. neapolitana)的过水解酶进行。在配备有磁力搅拌棒的75mL玻璃瓶中放置 12.3mL 0.2M碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2；44mM)，36.2mL去离子水， 41.7mg TurpinalSL(Thermphos，Vlissingen，the Netherlands)，0.95mL甘 油三乙酸酯(89mM)，6.0g Elvanol51-04(20重量％的水溶液，DuPont， Wilmington，DE，USA)，0.5g PEG-300(Dow，Midland，MI，USA)和 0.25g SilwetL-77(Setre Chemical Company，Memphis，TN，USA)并在室 温下搅拌直至样品均匀。在这时加入0.51mL的30％过氧化氢(88mM)， 紧接着在50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)中加入125μL的20mg/mL的那 不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)过水解酶(基于酶粉中的蛋白重量％)。 使用硫酸铈/硫代硫酸钠滴定测试(Greenspan，F.P.；MacKeller，D.G.Anal. Chem.，20：1061-1063，1948)随时监控过氧化氢和过乙酸浓度。对照反应 用(12.3mL 0.2M碳酸氢钠缓冲液，pH 7.2，50mM；0.51mL 30％过氧化 氢，100mM；36.2mL DI(去离子水)；41.7mg TurpinalSL；0.95mL甘油 三乙酸酯，0.1M；在pH 7.2的50mM碳酸氢钠缓冲液中的125μL 20mg/mL 那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)过水解酶(基于酶粉中的蛋白重量 ％))进行，并且不加入酶(与上述无酶的对照条件相同)。经过30分钟 后，用甘油三乙酸酯和过氧化氢，在不加入酶的情况下进行对照反应，从甘 油三乙酸酯和过氧化氢的化学反应中生成114ppm的过乙酸。用甘油三乙酸 酯和过氧化氢，在加入酶的情况下进行对照反应，在1分钟内生成380ppm 的过乙酸并且经过30分钟增加到2280ppm。在成膜组合物中原位酶促生成 PAA在1分钟内生成342ppm并且经过30分钟增加到1900ppm。表2示出 在成膜组合物与附加性能强化添加剂的存在下原位酶促生成的PAA浓度。

表2

在成膜组合物中酶促生成PAA

实施例6

在包含第二生物杀灭剂和流变改性剂的成膜组合物中原位酶促生成过乙酸

该实施例示出在包含第二生物杀灭剂和流变改性剂的成膜组合物的存 在下用具有过水解酶活性的酶原位生成过乙酸。在配备有搅拌棒的100mL 玻璃瓶中放置25g 20重量％的Elvanol51-04水溶液，14g去离子水，0.8g RheovisFRC，0.5g PEG 300和0.15g BTC885，并在室温下搅拌直至样品 均匀。在这时加入1.09g甘油三乙酸酯(100mM)和0.67g 30重量％的过氧 化氢(100mM)并搅拌混合。加入8g 0.2M的碳酸氢钠缓冲液(32mM)将 pH调节到7.0以上。在pH调节后，加入125μL那不勒斯栖热袍菌(T. neapolitana)过水解酶(在50mM碳酸氢钠缓冲液中的20mg/mL溶液(基 于酶粉中的蛋白重量％))并开始计时。使用与上述条件相同的条件进行对 照反应，不同的是不使用酶。使用硫酸铈/硫代硫酸钠滴定测试在5分钟、 30分钟和1小时监控过乙酸浓度。经过1小时时段后，不加入酶的对照反 应从甘油三乙酸酯和过氧化氢的化学反应中生成487ppm的过乙酸。在成膜 组合物中原位酶促生成PAA在5分钟内生成2112ppm并且经过1小时增加 到2593ppm。表3示出在成膜组合物中酶促生成的PAA浓度。

表3

在包含第二生物杀灭剂和流变改性剂的成膜组合物中酶促生成的PAA

实施例7

可移除的抗微生物涂层组合物的剪切稀化指数

“假塑性指数”或“剪切稀化指数”(STI)提供对所述组合物的松垂 和滴落的抗性指示。常见的测量在两个不同的剪切速率测定粘度。在较低剪 切速率下记录的值除以在较高剪切速率下的值得到STI。一般来讲，涂覆材 料的STI越高，其对松垂和滴落的抗性将越高。本文使用的STI值通过测量 加入所述酶后30分钟的粘度来测定。在室温下使用带有RV系列锭子#6的 Brookfield Digital Viscometer Model DV-II(Brookfield Engineering  Laboratories，Middleboro，MA，USA)测量粘度。剪切稀化指数(STI)通 过用在1rpm测得的粘度除以在10rpm测得的粘度来计算。本发明的涂料组 合物A(参见表4的组合物)的STI在表5中给出。在1rpm的成膜组合物 A的粘度为12.8Pa·s并且在10rpm降至4.86Pa·s。该涂料组合物的剪切稀化 指数为2.74。

表4

用于酶促过酸生产的涂料组合物A

表5

粘度和剪切稀化指数

实施例8

克隆并表达来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的乙酰木聚糖酯酶

将编码来自海栖热袍菌(T.maritima)MSB8的乙酰基木聚糖酯酶的基 因(如在GENBANK中报道的登录号NP_227893.1，SEQ ID NO：8)进行 合成(DNA 2.0，Menlo Park，CA，USA)。随后通过PCR(94℃0.5分 钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用引物SEQ ID NO：22和 SEQ ID NO：23扩增该基因。所得核酸产物(SEQ ID NO：24)用限制性酶 PstI和XbaI酶切并亚克隆到pUC19中的PstI和XbaI酶切位点之间以生成质 粒pSW207。合成用于在大肠杆菌中表达的密码子优化版本的海栖热袍菌 (T.maritima)MSB8乙酰基木聚糖酯酶，并随后通过PCR(94℃0.5分 钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)利用引物SEQ ID NO：25和26 进行扩增。所得核酸产物(SEQ ID NO：27)用限制性酶EcoRI和PstI酶切 并亚克隆到pTrc99A(GENBANK登录号M22744)中的EcoRI和PstI位点 之间以生成质粒pSW228。使用质粒pSW207和pSW228转化大肠杆菌 KLP18(美国专利申请公开2008/0176299，以引用方式并入本文)以分别生 成菌株KLP18/pSW207和KLP18/pSW228。KLP18/pSW207和 KLP18/pSW228在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm 0.4-0.5，此时加 入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。离心收集细胞并进行SDS- PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的20-40％。

实施例9

构建在残基C277上的海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶突变体

使用寡核苷酸引物对(SEQ ID NO：28和29)将海栖热袍菌(T. maritima)乙酰木聚糖酯酶的C277(Cys277)位点变为Ser，所述引物对基 于质粒pSW228中的海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID  NO：30)的密码子优化序列进行设计。使用Quikchange(Stratagene，Cedar  Creek，TX，USA)根据制造商的说明书制造突变。用1U Dpnl在37℃处理 扩增质粒1小时。处理的质粒用于转化化学感受态大肠杆菌XL1-Blue (Stratagene)。将转化体划线接种到补充0.1mg氨苄青霉素/mL的LB琼脂 平板上并在37℃生长过夜。挑取最多五个单独的菌落，并对质粒DNA进行 测序，以确定预期的突变。

实施例10

在大肠杆菌KLP18中表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶C277S突变体

具有确认的乙酰木聚糖酯酶C277S突变体的质粒用于转化大肠杆菌 KLP18(实施例1)以生成菌株KLP18/pSW228/C277S。转化体在37℃在 LB培养基中振荡培养至OD_600nm 0.4-0.5，此时加入IPTG至最终浓度为 1mM并继续孵育2-3小时。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定乙酰木 聚糖酯酶C277S突变体的表达量占可溶性总蛋白的20-40％。

实施例11

制备喷雾干燥的海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖酯酶野生型突变体C277S

用于培养大肠杆菌KLP18/pSW228(用于制备栖热袍菌(T.maritima) 乙酰木聚糖酯酶)或大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(用于制备栖热袍菌 (T.maritima)乙酰木聚糖酯酶C277S突变体)的发酵规程类似于在实施例 2中描述的规程，不同的是它在10-L的规模下进行。通过在5,000×g离心 15分钟收获细胞浆液，并冻存在-80℃以备日后使用。

将细胞浆液样品重悬(200g/L)在pH 7.0的50mM磷酸盐缓冲液中， 其补充了1.0mM的二硫苏糖醇(DTT)。使得重悬细胞两次通过French细 胞压榨机以确保＞95％的细胞裂解。将裂解的细胞以12,000×g离心30分 钟，将上清液在75℃下加热20分钟，然后在冰浴中骤冷2分钟。通过 11,000×g离心10分钟移除沉淀的蛋白质。SDS-PAGE指示CE-7酶在制剂 中包含大约85-90％的总蛋白。

使用如上所述制备的细胞浆液重复类似于实施例3中所述的方法。所 得海栖热袍菌(T.maritima)过水解酶的喷雾干燥酶粉为：95.5％干重， 27.8重量％蛋白，86.1pNPA U/mg蛋白。所得海栖热袍菌(T.maritima) C277S过水解酶的喷雾干燥酶粉为：95.5％干重，25.5重量％蛋白， 129.5pNPA U/mg蛋白。

实施例12

在成膜组合物中使用多种过水解酶原位酶促生成过乙酸

在该实施例中示出使用不同的适用过水解酶在成膜组合物中原位酶促 生成PAA和在制剂中使用第二生物杀灭活性物质和流变改性剂的能力。

使用如上所述的相同方法制备类似于实施例6中所述的涂料组合物， 不同的是使用表6中列出的重量％的成分和组合物。涂料组合物B使用 TAED和过碳酸钠在无酶的情况下在成膜组合物中生成PAA，并且仅用于 比较。涂料组合物C缺乏酶并用作与含酶组合物D、E和F的对照物。每个 酶反应混合物的初始pH为约7.0。TAED反应混合物的初始pH为约8.0。

反应混合物中PAA的浓度的测定根据Karst等人(Anal.Chem.，69： 3623-3627，1997)描述的方法进行。在期望的时间点(1分钟，5分钟 等)，除去反应混合物的等分试样(大约25-50mg)并按重量计用5mM磷 酸稀释以终止反应。典型的稀释液对PAA浓度大于2000ppm的样品为 1∶35，对PAA浓度约1000ppm的样品为1∶25，并且对PAA浓度低于 200ppm的样品为1∶10。将大约200μL(或足以完全充满过滤杯)的稀释等 分试样转移到非无菌的10,000NMWL(标称分子量范围)过滤单位 (Nanosep 10K Omega，PALL Life Sciences，East Hills，NY，USA)中并通 过在12,000rpm离心7分钟进行过滤。将所得滤液的等分试样(100μL)转 移到1.8-mL螺帽HPLC小瓶(1.8mL ROBO Autosampler Vial，VWR  International，West Chester，PA，USA)中，其中包含300μL去离子水，然 后加入在乙腈中的100μL 20mM MTS(对甲基硫甲苯)，将小瓶封端，略 微混合下内容物，然后在约25℃避光孵育10分钟。然后向每个小瓶加入 400μL的乙腈和在乙腈中的100μL的三苯基膦溶液(120mM)，将小瓶在 封端，混合所得溶液并在25℃避光孵育30分钟。然后向每个小瓶加入 100μL的2.5mM N，N-二乙基间甲苯酰胺(DEET；HPLC外标)和如上所述 通过HPLC分析的所得溶液。

表7给出了经过一段时间后的PAA浓度。在开始相应的化学反应后0.5 和2小时之间观察到所有包含酶以及包含TAED的组合物的最大PAA浓 度。在已达到最大浓度之后，浓度随时间下降，这能够通过指数衰减函数进 行数学上的近似表达，函数形式为c(t)＝k·exp[-t/(ln(2)·τ)]，其中c (t)描述PAA浓度作为反应时间t的函数。参数k和τ是每个组合物可不 同的常数，τ表示近似的半衰期，即，PAA浓度已下降到其最大值一半的时 间。通过将随时间变化的PAA浓度数据与介于2和120小时的时间通过上 述指数衰减函数用最小二乘法进行配比来计算近似半衰期。表7也给出了半 衰期τ。可看出，酶促生成PAA的半衰期是相似的并且介于约27和29小时 之间。作为对照物，涂料组合物B的非酶促生成PAA的半衰期要缩短大于 7小时。因此，酶促生成的组合物在液体涂料组合物中使得PAA浓度随时 间下降的较慢。这在其中期望特定的最小PAA浓度存在较长时间的情况下 可能是有益的。

表7

使用多种过水解酶在成膜组合物中酶促制备的PAA

n.d表示“不确定的”

实施例13

成膜抗微生物组合物G对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的功效

成膜组合物G(表8)的抗微生物特性使用NFC测试方法并用金黄色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 6538)作为测试微生物进行测 试。表8给出以重量％表示的组合物G。混合后的组合试剂为100重量％。 每个试块均匀施用体积为0.05mL的涂料组合物。暴露五分钟后，观察到或 5.6个对数或更多的菌落形成单位数(CFU)减少，这等同于CFU数量减少 至少99.999％。

表8

组合物G对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗微生物NFC测试

实施例14

成膜抗微生物组合物H对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的功效

成膜组合物H(表9)的抗微生物特性使用RSS测试方法并用金黄色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 6538)作为测试微生物进行测 试。表9给出以重量％表示的组合物H。所有组合试剂等于100重量％。每 个试块均匀施用体积为0.05mL的涂料组合物。如表9所示，组合物H达到 CFU的3.1个数量级减少，这等同于CFU数量减少至少99.9％。

表9

组合物H对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗微生物RSS测试

实施例15

比较可商购获得的PAA溶液和膜中原位生成的PAA

该实施例比较了加入成膜组合物Pack A的可商购获得的平衡PAA溶液 和在成膜组合物中原位生成的PAA经过一段时间后膜中的PAA浓度。

表10给出了以重量％表示的成膜组合物H和#141B。将所有成分混合 产生100重量％的抗微生物涂层组合物。就组合物#141B而言，将可商购获 得的PAA(90μL的32重量％溶液)加入Pack A中以代替原位生成。

表10

成膜组合物H和#141B

在将组合物的所有组分混合到一起后，用8-通道湿膜施用装置(膜厚5 密耳，No.15型，Paul N.Gardner Co.Inc.，Pompano Beach，FL，USA)巴 膜施用于塑料板。当膜干燥时每隔一段时间隔监控膜中的PAA浓度。在一 个典型的实验中，膜在30分钟内摸起来是发粘的，并且经过一个小时完全 干燥。反应混合物中PAA的浓度的测定根据Karst等人(Anal.Chem.，69： 3623-3627，1997)所述的方法进行。详见实施例12。

观察到涂料混合物H中的PAA浓度从1分钟时的1925ppm PAA提高 到10分钟时的最高2599ppm PAA，在一小时内下降到732ppm PAA，而在 组合物#141B中的PAA浓度在一小时中稳定地从一分钟时的最高2849ppm PAA下降至一小时时的22ppm PAA。该实施例突出显示本发明的成膜组合 物的有益效果，其中PAA原位生成而不是预先制备。

表11

涂层膜中随时间变化的PAA浓度组合物H和#141B

实施例16

涂料组合物H的施用和移除

将涂料组合物H(表9)施用到铝板，该施用利用8-通道湿膜施用装置 (膜厚5密耳，No.15型，Paul N.Gardner Co.Inc.，Pompano Beach，FL， USA)。干燥后所得的涂层具有优异的外观，其特征在于不存在涂层缺陷如 下陷、泡沫或气泡、坑或未覆盖的区域。干燥膜易于通过用30-32℃自来水 冲洗所述板来移除。在铝板上无可见的残余留下，说明该膜良好的去除特 征。