交联透明质酸水凝胶中交联剂1,2,7,8-二环氧辛烷残留量的测定方法

摘要

本发明涉及一种交联透明质酸水凝胶中交联剂1，2，7，8-二环氧辛烷残留量的测定方法，用气相色谱顶空法测定1，2，7，8-二环氧辛烷的标准样溶液得到气相色谱图，积分得到标准样峰面积；称取样品置于顶空瓶中，密封后顶空瓶于95℃恒温40分钟后，取顶空气体进样检测，得到气相色谱图，积分得到样品峰面积；用外标法计算1，2，7，8-二环氧辛烷的残留量：1，2，7，8-二环氧辛烷残留量＝(样品峰面积×标准样浓度)÷标准样峰面积。本发明可准确地检测到残留量的1，2，7，8-二环氧辛烷。本发明操作简便，安全可靠，适用于使用1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)来用作为交联剂将透明质酸交联的反应。

说明书

技术领域

本发明涉及一种交联透明质酸中交联剂的残留量测定，具体为交联剂1，2，7，8-二环氧辛烷的残留量的测定方法，特别指的是用气相色谱顶空法测定1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)的残留量。 

背景技术

开发能应用与临床的皮肤填充剂，就必须对透明质酸进行一系列的化学修饰和处理过程。如果采用非交联的透明质酸作为皮肤填充剂，那么，在皮肤中天然存在的透明质酸酶与自由基就会一个一个的切断聚合起来的透明质酸分子，快速降解非交联的透明质酸。结果使得透明质酸在组织内的半衰期只有一天到两天，然后经过水的稀释，在肝脏内逐步降解为水和二氧化碳。这样，产品在注射的部位就会很快的失去效用(在一周内)，结果使得非交联的透明质酸在皮肤中的滞留时间受到了很大的限制。因此，非交联的透明质酸起不到一个作为皮肤填充剂应该起到的疗效。 

采用1，2，7，8-二环氧辛烷作为透明质酸的交联剂，将透明质酸的羟基和羧基都交联起来，提高了透明质酸分子的稳定性，有效地防止了透明质酸酶和自由基对透明质酸的降解作用，明显地提高了透明质酸在皮肤内的停留时间，具有量好的作为皮肤填充剂应有的疗效。但是，依据化学材料安全评估报告(Material Safety Data Sheets，简称MSDS)，1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)对皮肤具有刺激性甚至毒性。在透明质酸交联反应完全结束后，此交联剂必须被清除，以免残留的交联剂对皮肤造成不良的影响。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种交联透明质酸中交联剂1，2，7，8-二环氧辛烷残留量的。采用气相色谱顶空法测定交联透明质酸中1，2，7，8-二环氧辛烷的残留量，高温下将交联剂1，2，7，8-二环氧辛烷汽化至上层蒸汽中，趁热抽取蒸汽并进样，即可检测到蒸汽中1，2，7，8-二环氧辛烷的含量。以确保交联透明质酸产品的安全性。本发明操作简便，安全可靠，适用性强。 

本发明提供的交联透明质酸水凝胶中交联剂1，2，7，8-二环氧辛烷残留量的测定方法包括的步骤： 

1)标准样溶液的配置与气相色谱测试 

用微量注射器抽取2μL 1，2，7，8-二环氧辛烷置于中，加10mL纯化水溶解作为储备液。密封后顶空瓶于95℃恒温40分钟后，取顶空气体1mL，进样检测，得到色谱图，积分得到标准样峰面积。 

2)样品检测液的配置与气相测试 

精密称取样品2mL左右，置于顶空瓶中，加水8mL。密封后顶空瓶于95℃恒温40分钟后，取顶空气体1mL，进样检测，得到色谱图，积分得到样品峰面积。 

3)结果处理：用外标法计算1，2，7，8-二环氧辛烷的残留量。 

1，2，7，8-二环氧辛烷残留量＝(样品峰面积×标准样浓度)÷标准样峰面积。 

由附图可见，1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)标样在850.1s处出现了一个很强的吸收峰，而去除了1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)的交联透明质酸样品则没有在该处出现吸收峰，说明该样品中的1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)含量已经低于气相色谱的最低检出限，即低于0.1ppm，保证了该交联透明质酸样品的安全性。 

本发明提供的交联剂1，2，7，8-二环氧辛烷的残留量的测定方法，可准确地检测到残留量的1，2，7，8-二环氧辛烷。本发明操作简便，安全可靠，适用于使用1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)来用作为交联剂将透明质酸交联的反应。 

附图说明

图1为DEO标样的顶空法气相色谱图。 

图2为去除DEO后的交联透明质酸的顶空法气相色谱图。 

具体实施方式

实施例1：标准样溶液的配置与气相测试 

用微量注射器抽取2μL 1，2，7，8-二环氧辛烷置于顶空瓶中，加10mL纯化水溶解作为储备液。密封后顶空瓶于95℃恒温40分钟后，取顶空气体1mL，进样检测，得到色谱图，积分得到标准样峰面积。 

实施例2：样品检测液的配置与气相测试 

交联剂透明质酸水凝胶的制备 

将0.5g氢氧化钠溶解于20ml水中，加入5g透明质酸钠(山东福瑞达生物技术有限公司出品)，搅拌12-14h，搅拌至透明质酸钠完全溶解后，再向反应体系中加入5g 1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)，迅速搅拌均匀，在25℃下反应24小时。反应用2mol/L盐酸终止，调至pH＝5左右，同时在40℃，13.3Kpa的真空度条件下蒸馏去除反应体系中的水，当蒸馏出的水达到50mL时停止减压蒸馏。分3次用200mL pH＝8-9的含30％乙醇的氢氧化钠溶液浸泡，中和凝胶的盐酸。将中和后的凝胶转入真空干燥箱中，于60℃，40Kpa的条件下干燥10h使凝胶固化定型，凝胶吸水率为45倍。所得凝胶在90℃，13.3Kpa真空干燥至衡重，得交联透明质酸微颗粒。 

将交联透明质酸微颗粒按照25mg/mL的浓度配成水凝胶，用盐酸调整pH值至7-8，放置滚床上滚动20h，至达到透明质酸吸水平衡，得到交联透明质酸水凝胶。 

精密称取采用1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)为交联剂的交联透明质酸水凝胶2mL左右， 置于顶空瓶中，加水8mL。密封后顶空瓶于95℃恒温40分钟后，取顶空气体1mL，进样检测，得到色谱图，积分得到样品峰面积。 

本发明采用岛津GC-9A型气相色谱仪作为检测仪器，采用顶空法作为实验方法，测定交联透明质酸中1，2，7，8-二环氧辛烷的残留量。以下是气相色谱的具体色谱条件与试剂： 

气相色谱仪：岛津GC-9A 

色谱条件： 

色谱柱：SE-54，30m×0.25μm×0.53mm； 

载气：氦气或氮气； 

载气纯度：99.99％； 

检测器：FID； 

柱流量：1.0mL/min； 

炉温：35℃，保持2分钟； 

以20℃/分钟升温至200℃，保持3分钟； 

进样口温度：180℃； 

检测器温度：300℃； 

进样量：1mL； 

分流比：5∶1； 

标准样品：1，2，7，8-二环氧辛烷(含量≥97％)； 

样品：以1，2，7，8-二环氧辛烷为交联剂的交联透明质酸凝胶； 

样品取样：2mL； 

样品浓度：20mg/mL； 

顶空烤箱温度：95℃。 

结果处理： 

用外标法计算1，2，7，8-二环氧辛烷的残留量。 

1，2，7，8-二环氧辛烷残留量＝(样品峰面积×标准样浓度)÷标准样峰面积。 

由附图可见，1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)标样在850.1s处出现了一个很强的吸收峰，而去除了1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)的交联透明质酸样品则没有在该处出现吸收峰，说明该样品中的1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)含量已经低于气相色谱的最低检出限，即低于0.1ppm，保证了该交联透明质酸样品的安全性。