一种用于光动力治疗的纳米光敏剂给药系统及其制备方法

摘要

本发明涉及一种用于光动力治疗的纳米光敏剂给药系统及其制备方法，该给药系统由壳聚糖、二氢卟吩e6和单壁碳纳米管构成，所述的单壁碳纳米管通过非共价键结合的方式装载二氢卟吩e6，所得二氢卟吩e6-单壁碳纳米管复合物外层用壳聚糖包裹，所述的单壁碳纳米管和二氢卟吩e6的质量比为1∶(1.2-10)。与现有技术相比，本发明具有暗毒性低、进入细胞迅速、输送药量大等特点，对肿瘤细胞杀伤作用显著，为其实现低毒高效的肿瘤光动力治疗提供可能。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤光动力疗法领域的一种药物，更具体地讲，涉及一种新型纳 米光敏剂给药系统及其制备方法。

背景技术

光动力疗法利用光敏剂(photosensitizer，PS)经激光(或其它光源)激发后产生 光化学反应，反应产物如单线态氧、自由基等具有细胞杀伤作用。光动力疗法不 同于传统的手术、放疗和化疗三大治疗肿瘤手段，它的主要优点：选择性、不可逆 的毁坏疾病组织的同时，并不损害周围的正常细胞。应用光动力疗法 (Photodynamic therapy，PDT)治疗恶性肿瘤，特别是浅表肿瘤(如食道癌，膀胱 癌，口腔鳞癌，恶性黑色素瘤)，近年来愈来愈成为临床研究的热点。而现有的PDT 疗法中使用的光敏剂存在许多缺点，如在皮肤中滞留时间长、排泄慢、易产生副反 应、避光时间长、选择性差等。

叶绿素类光敏剂二氢卟吩e6是叶绿素a稳定的降解产物，是目前新一代光敏 剂研究的热点。二氢卟吩e6(Chlorin e6)是以天然叶绿素为原料，通过现代科技 手段精制、提炼和修饰而得的叶绿素降解产物，是一种性能优良的光敏剂。与目前 报导和使用的血卟啉醚类(HPD)、光敏素II(photofrin II)等卟啉类光敏剂相比， 具有分子结构明确、红外区吸收系数大、光动力反应能力强以及毒副作用小等优诸 多点，因此正在发展成为新一代理想的光动力治癌药物。但是，二氢卟吩e6不溶 于水，稳定性差，无法制成水溶液体系，即使先用有机溶剂溶解，然后分散在水溶 液中，也是以悬浊液形式存在，很难被细胞有效地摄取；而且，有机溶剂本身对细 胞也存在一定的毒性。因此，如何提高Ce6的亲水性和稳定性，使Ce6快速、有 效地进入细胞以提高PDT的疗效是目前研究的热点。

碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)自1991年被发现以来，以其独特的结构和性 能引起广泛人们关注，成为纳米材料领域的研究热点。由于碳纳米管具有独特的一 维结构，其外表面除了可以非共价力吸附各种分子，还可以键合多种化学基团以实 现增溶及靶向，其内部空间则可以包埋离子以及小分子，并且能以最小的毒性穿越 细胞膜，因此在生物医学，包括药物传递、分子影像、基因治疗等方面具有较好的 应用前景。同时，碳管能吸收特殊的激光以及射线进而转化成热量来破坏肿瘤细胞。 碳纳米管具有高纯度和尺寸一致等优点，在结构上表面积大，能装载大量药物，体 外活细胞以及动物活体实验的结果表明，碳管对癌细胞以及正常细胞的生长没有明 显的影响，对人体毒性较小，碳纳米管材料具备优良的细胞穿透性能。近年来，碳 纳米管应用在生物医学特别是在药物载体上的研究逐渐成为新热点。当前，大部分 研究集中在将碳纳米管作为一种有效的肿瘤细胞载体来传送造影剂、药物以及具生 物活性的分子，碳纳米管为纳米材料，其空腔管体还可容纳生物特异性分子及药物。

碳纳米管和二氢卟吩e6不溶于水，从而限制了它在药物载体领域的应用。壳 聚糖是甲壳质的一级衍生物。其化学结构为带阳离子的高分子碱性多糖聚合物，是 自然界唯一的带正电荷、阳离子的食用纤维；具有物理性能稳定、良好的溶解性、 亲水吸湿性、生物降解性、生物相容性等理化性能。而具有生物相容性的壳聚糖对 载药后碳纳米管的修饰则可改善其溶解性，并可提高其生物相容性，使碳纳米管在 药物载体领域得以应用。碳纳米管用作药物载体，药物的包埋主要有3种方法：吸 附、共价接枝和非共价包覆。非共价包覆是指将溶解于溶剂的药物分子或生物活性 分子与原始碳纳米管混合后超声/搅拌分散可在碳纳米管表面吸附药物分子，使所 包覆的碳纳米管在溶剂中可溶解，同时实现药物包埋。

目前，关于采用碳纳米管、二氢卟吩e6和壳聚糖制备纳米光敏剂药物方面的 研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有暗毒性 低、进入细胞迅速、输送药量大的用于光动力治疗的纳米光敏剂给药系统及其制备 方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于光动力治疗的纳米光敏 剂给药系统，其特征在于，该给药系统由壳聚糖(Chitosan)、二氢卟吩e6和单壁 碳纳米管(SWCNTs)构成，所述的单壁碳纳米管通过非共价键结合的方式装载二 氢卟吩e6，所得二氢卟吩e6-单壁碳纳米管复合物(Ce6-SWCNTs)外层用壳聚糖 包裹，所述的单壁碳纳米管和二氢卟吩e6的质量比为1∶(1.2-10)。

所述的壳聚糖的量为：2L/g二氢卟吩e6-单壁碳纳米管复合物。

所述的壳聚糖在0.05M的醋酸溶液中的浓度为1mg/ml。

一种用于光动力治疗的纳米光敏剂给药系统的制备方法，其特征在于，该方法 包括以下步骤：

(1)将单壁碳纳米管和二氢卟吩e6加入溶剂中，超声处理30min后，搅拌混 合12-24h，抽滤、洗涤、用滤膜收集后真空干燥得到二氢卟吩e6-单壁碳纳米管复 合物；

(2)将步骤(1)制得的二氢卟吩e6-单壁碳纳米管复合物，加入壳聚糖的水 溶液中，搅拌12-24h，抽滤、洗涤，用滤膜收集后在50℃真空干燥，即得产品 Chitosan-Ce6-SWCNTs。

步骤(1)所述的单壁碳纳米管纯化是将市售单壁碳纳米管采用浓硫酸和浓硝 酸进行清洗，除去无定型碳和重金属离子，所述的浓硫酸的质量百分比浓度为 70～95％，所述的浓硝酸的质量百分比浓度为65～90％。

步骤(1)所述的溶剂为二甲基甲酰胺，溶剂的加入量为2L/g单壁碳纳米管。

步骤(1)、(2)中所述的抽滤是采用直径为0.22μm的微孔滤膜抽滤，所述的 洗涤是采用电阻率为18.2MU的超纯水洗涤。

与现有技术相比，本发明用壳聚糖包裹来改善载药碳纳米管的亲水性和生物相 容性。将碳纳米管用作药物载体，主要是利用其细胞穿透能力，携带目标药物分子 ——光敏剂二氢卟吩e6进入细胞，通过低分子壳聚糖对其功能化修饰载药碳纳米 管则可改善其水溶解性和生物相容性。将碳纳米管有效的细胞穿透性、优良导热效 应、在肿瘤组织优先聚集的特点稳定性好、灵敏度高的光敏特性和有机地结合起来， 光敏剂在激光照射下，放出热量对碳管进行加热从而对肿瘤细胞进行破坏，成功地 杀灭肿瘤细胞，而对附近的正常细胞只造成了很少量的伤害，从而形成一种纳米光 敏剂药物输送系统，为疾病的光动力疗法治疗提供了新方法。具有暗毒性低、进入 细胞迅速、输送药量大等特点，对肿瘤细胞杀伤作用显著，为其实现低毒高效的肿 瘤光动力治疗提供可能。

附图说明

图1.二氢卟吩e6(a)和壳聚糖(b)的分子结构式以及Chitosan-Ce6-SWCNTs 的制备原理(c)；

图2.纯化前的SWCNTs(a)和(b)和纯化后的SWCNTs(c)和(d)，的TEM 图像；

图3.纯化后的SWCNTs(a)，Ce6-SWCNTs(b)和Chitosan-Ce6-SWCNTs(c) 的TEM图像；

图4.纯化后的SWCNTs(a)，Ce6-SWCNTs(b)和Chitosan-Ce6-SWCNTs(c) 的SEM图像；

图5.常温放置30天以后，浓度均为1mg/mL的未纯化的SWCNTs(a)， Ce6-SWCNTs(b)和Chitosan-Ce6-SWCNTs(c)在水溶液中的分散性观察；

图6.二氢卟吩e6，Ce6-SWNTs，Chitosan-Ce6-SWNTs和壳聚糖的紫外可见吸 收光谱(a)和红外吸收光谱(b)；

图7.Chitosan-Ce6-SWCNTs对3T3细胞的暗毒性检测，传代后的3T3细胞， 用不同浓度(二氢卟吩e6的终浓度为5，10，20，50，100μg/mL)的 Chitosan-Ce6-SWCNTs溶液孵育1h后，再用无菌的PBS溶液冲洗，然后换上新鲜 的培养基(含10％FBS)继续孵育24h和48h；

图8.在温度为37℃时，经过(a)5min，(b)15min，(c)30min，(d)1h，用流式细 胞仪观察Hela细胞对Chitosan-Ce6-SWCNTs(二氢卟吩e6的终浓度为15μg/mL) 的内摄作用；

图9.Hela细胞经Chitosan-Ce6-SWCNTs(二氢卟吩e6的终浓度为50μg/mL) 孵育1h后的荧光显微镜图像；

图10.Chitosan-Ce6-SWCNTs对Hela细胞的IC50测定；

图11.纯化后的SWCNTs，二氢卟吩e6，Ce6-SWCNTs以及 Chitosan-Ce6-SWCNTs对Hela细胞的体外光动力作用。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明，但是实例的作用仅是解释而非限定本发 明。

下述实施例中采用的原材料和设备如下：

1、原材料：单壁碳纳米管的管径是1-2nm，长度＞50μm，纯度＞90％(中国 成都有机所)。二氢卟吩e6纯度＞95％((北京百灵威公司)。壳聚糖的乙酰化程度是 75-85％，平均分子量是16.0kDa(Sigma公司)。二甲基甲酰胺(DMF，分析纯AR)。 WST-1试剂盒(中国江苏海门市碧云天生物科技有限公公司)。PVDC微孔滤膜(上 海摩速有限公司)。DMEM干粉培养基(高糖)、胎牛血清、非必需氨基酸、青-链 霉素、0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液、四甲基偶氮哇蓝(MTT)，96孔板等 生物试剂及材料购自Corning Costar公司。

2、主要设备：透射电镜形貌分析在上海交大分析测试中心电镜室进行，电镜 型号为JEOL JEM-2010(日本JEOL公司)，CCD型号为Gatan 832型。FEI Siron 200 (20kV，1.0nm)场发射扫描电子显微镜(美国FEI公司)。紫外可见(UV/Vis)光 谱由Thermo公司生产的Evolution 300II型紫外-可见分光光度计测得，波长范围在 200-800nm。使用德国Bruker公司的EQUINOX 55型傅立叶变换红外光谱仪测定 FTIR光谱，样品扫描范围4000到400cm^-1，分辨率4cm^-1，扫描模式为透射谱。 流式细胞仪(BD FACSCalibur flow cytometer)和荧光显微镜(Zeiss，Axiovert 200)。 二氧化碳培养箱(SANYO MCO-17A，日本SL Shel LAB)，超净工作台(苏州净 化设备厂)。半导体激光器(PDT 630型激光肿瘤治疗仪，桂林市兴达光电医疗器 械有限公司)。

实施例1

1.纳米光敏剂的制备

将市售单壁碳纳米管采用质量百分比浓度为70～95％的浓硫酸和质量百分比浓 度为65～90％的浓硝酸进行清洗，除去无定型碳和重金属离子等杂质，得到纯化后 的单壁碳纳米管。

在装有磁力搅拌子的50ml单颈圆底烧瓶中，加入20mlDMF，10mg纯化后的 单壁碳纳米管，100mgce6，超声处理30min，搅拌过夜(12-24h)，用直径0.22μm 的微孔滤膜抽虑。先用超纯水(18.2MU)洗涤，再用滤膜收集，真空干燥。

称取10mg二氢卟吩-碳管复合物，加入20ml壳聚糖(0.05M醋酸)的水溶液，搅 拌过夜(12-24h)，用直径0.22μm的微孔滤膜抽滤。先用超纯水(18.2MU)洗涤， 再用滤膜收集，50℃真空干燥。

载药量和载药率的公式定义为：

载药量(wt％)＝(吸附药物的重量/载体的重量)×100％

载药率(％)＝(吸附药物的重量/药物的总量)×100％

2.细胞培养

3T3细胞系、Hela细胞系均培养在有10％胎牛血清的DMEM培养液(含200 u/mL青霉素、链霉素)中。复苏的细胞按常规培养操作置于37℃、5％CO₂(相对 湿度90％)培养箱中培养，约2至3天更换一次培养液。分别取对数生长期的细 胞接种于6孔培养板或96孔培养板，培养24小时，待细胞贴壁后，通过流式细胞 仪测细胞荧光强度实验。

3.二氢卟酚纳米光敏剂的细胞内摄作用

3.1流式细胞仪观察细胞内摄作用

a.传代48小时的Hela细胞生长铺满培养瓶底后，分别用0.25％胰蛋白酶消化， 制成细胞悬液，调整细胞密度为5×10⁵个/mL。

b.Hela细胞以每孔5×10⁵个细胞接种于6孔培养板中。37℃、5％CO₂孵育箱 中培养24小时，观察细胞贴壁后使用。

c.吸弃孔内培养基，每孔加入1mL含二氢卟酚e6浓度为15μg/mL的游离ce6 或纳米光敏剂(以无血清DMEM培养基配药)。

d.37℃、5％CO₂孵育箱中分别培养5min，15min，30h和1h后，吸出孔内 液体，每孔加入PBS液2mL，洗涤3次，5分钟/次。

e.每孔加入胰酶0.1mL消化细胞，倒置显微镜下观察消化细胞，待胞质回缩， 细胞之间不再连接成片，加入0.9mL PBS溶液中和；用滴管将已经消化细胞吹打 成细胞悬液将细胞悬液吸入5mL离心管中。

f.平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/min离心5min。加入2mL 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

g.弃去上清液，加入0.5mL冰PBS溶液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液， 放入冰中待用。

h.移至流式管中，控制细胞数为1×10⁴个，用BD FACSCalibur型流式细胞仪 和CELLQuest软件检测细胞内荧光强度。

3.2荧光显微镜观察细胞内摄作用

a.传代48小时的Hela细胞以每孔3×10⁵个细胞接种于6孔培养板中。37℃、 5％CO₂孵育箱中培养24小时，观察细胞贴壁后使用。

c.吸弃孔内培养基，每孔加入1mL含二氢卟酚e6浓度为50μg/mL的游离ce6 或纳米光敏剂(以无血清DMEM培养基配药)。

d.37℃、5％CO₂孵育箱中分别培养5min，15min，30h和1h后，吸出孔内 液体，每孔加入PBS液2mL，洗涤3次，5分钟/次。

e.用荧光显微镜观察细胞内荧光强度。

4.二氢卟酚纳米光敏剂的体外暗毒性作用

a.实验分组：分为实验组及空白对照组。实验组为光敏剂处理组，空白组设 立不加光敏剂的单纯对照组。根据光敏剂的不同，实验组又分为二氢卟酚e6和 HPEE-ce6纳米光敏剂两个组。根据预实验，含ce6浓度分别选为：

游离ce6：5，10，20，50，100μg/mL

纳米光敏剂：5，10，20，50，100μg/mL

b.传代48小时的小鼠成纤维细胞株3T3细胞生长铺满培养瓶底后，用0.25％ 胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为4×10⁴个/mL。

c.以每孔8000个细胞接种于96孔培养板中。37℃、5％CO₂孵育箱中培养24 小时，观察细胞贴壁后使用。

d.在严格避光的条件下，将配制好的光敏剂溶液包括空白对照PBS(50μL) 加入96孔板内，使孔内含ce6浓度梯度为(5，10，20，50，100μg/mL)，并分别设5 个重复孔。

e.37℃、5％CO₂孵育箱中分别培养24小时后，每孔加人5mg/mL的MTT液 20μL(用PBS配制)，继续孵育4小时。

f.用WST-1方法检测。选择450nm波长，在酶标仪上检测各孔的光密度值 (Optical density.OD)，以不加细胞只加培养液的空白孔调零，记录OD值。OD 值越高，说明3T3细胞的增殖越强。根据以下公式计算细胞存活率。每次实验重 复3次，取平均值。

细胞存活率＝实验组OD值/空白组OD值×100％

绘制杀伤曲线，计算各组的细胞存活率，最后作出不同光敏剂对不同细胞生长 曲线，以此为依据进行比较。

5.二氢卟酚-碳管纳米光敏剂介导的光动力作用(PDT)

5.1 Chitosan-Ce6-SWCNTs光敏剂对Hela细胞的IC50测定

a.传代48小时的Hela细胞生长铺满培养瓶底后，用0.25％胰蛋白酶消化，制 成细胞悬液，调整细胞密度为4×10⁴个/mL。

b.以每孔8000个细胞接种于96孔培养板中。37℃、5％CO₂孵育箱中培养24 小时，观察细胞贴壁后使用。

c在严格避光的条件下，将配制好的chitosan-Ce6-SWCNTs光敏剂溶液包括空 白对照PBS(50μL)加入96孔板内，使孔内含Ce6浓度梯度为(5，10，20，50，100 μg/mL)，并分别设5个复孔。

d.37℃、5％CO₂孵育箱中分别培养4小时后，吸弃孔内液体，用PBS小心清 洗后，每孔重新置入200μL培养液。

e.细胞的照光处理：

采用波长630nm的半导体激光进行照射，调整功率密度为150mW/cm²，能 量密度为20J/cm²，使光束均匀地垂直照射到96孔培养板上，照射时间为600s， 同时每块96孔培养板均设既不加光敏剂又不照光的完全空白对照组。用WST-1方 法检测。选择450nm波长，在酶标仪上检测各孔的光密度值(Optical density.OD)。

5.2对Hela细胞的体外光动力实验比较

a.传代48小时的Hela细胞生长铺满培养瓶底后，用0.25％胰蛋白酶消化，制 成细胞悬液，调整细胞密度为4×10⁴个/mL。

b.以每孔8000个细胞接种于96孔培养板中。37℃、5％CO₂孵育箱中培养24 小时，观察细胞贴壁后使用。

c在严格避光的条件下，将配制好的溶液包括空白对照PBS、纯化的50μg/mL  SWCNTs、50μg/mL Ce6、50μg/mL Ce6-SWCNTs(含Ce6的终浓度为50μg/mL)、 50μg/mL chitosan-Ce6-SWCNTs(含Ce6的终浓度为50μg/mL)加入96孔板内，，并 分别设5个复孔。

d.37℃、5％CO₂孵育箱中分别培养4小时后，吸弃孔内液体，用PBS小心清 洗后，每孔重新置入200μL培养液。

e.细胞的照光处理：

采用波长630nm的半导体激光进行照射，调整功率密度为150mW/cm²，能 量密度为20J/cm²照射。用WST-1方法检测。

5.统计学处理

数据采用SAS 6.12软件包对数据进行ANOVA方差分析；WST-1法检测的细 胞毒性之间的比较采用t检验。当数据P＜0.05时，差异有统计学意义。

三、实验结果和讨论

商业购买的SWCNTs里混有的金属催化剂颗粒可能导致细胞内活性氧的水平 升高，致使的凋亡，为了消除金属催化剂对细胞的影响，在载药之前必须首先对 SWCNTs进行纯化处理。图2为SWCNTs纯化前后的TEM照片，从图2-a和2-b 可见纯化之前样品表面布满了金属催化剂和无定形碳颗粒，从图2-c可见纯化之后 样品光滑，表面残留的金属催化剂和无定形碳已基本去除，从图2-d中可以看到相 对光滑并且结构比较致密的SWCNTs管壁。

Ce6通过π-π共轭作用或其他非共价相互作用吸附到SWCNTs表面，从图3-a 中可见SWCNTs光滑的管壁，而在图3-b中，SWCNTs的管壁已不再光滑而是布 满了相对比较松散Ce6，所以管壁相对图3-a比较粗糙。壳聚糖可以通过疏水相互 作用或者范德华力缠绕包覆到SWCNTs表面，在图3-c中由于壳聚糖的包覆和遮 盖，已经很难辨认出SWCNTs的管壁。这些TEM照片给出了药物和壳聚糖糖能够 包覆SWCNTs的直接证据。

图4为纯化后及药物和多糖修饰后的SWCNTs的SEM照片，进一步证明了药 物和壳聚糖对SWCNTs的成功修饰。经过药物修饰后的SWCNTs表面变得粗糙， 而经过壳聚糖修饰后的SWCNTs表面更加的粗糙，水溶性也有所改善，这点从图 5可以看到，在壳聚糖修饰之后，SWCNTs的分散性和稳定性都大大提升。

Chitosan-Ce6-SWCNT和ce6在DMF中的吸收光谱见图6(a)，虽然不同二氢 卟酚e6衍生物的吸收强度有所不同，但它们的吸收峰形基本相同，在300～700nm 之间都有三个吸收峰，最大吸收峰均位于404nm左右处，在500nm左右处均有 一个小吸收峰。Ce6在663m左右处有一个相对较强的吸收峰，而 chitosan-Ce6-SWCNT在669nm左右处有一个相对较强的吸收峰。 chitosan-Ce6-SWCNT纳米光敏剂在红光区(669nm)的吸收峰比ce6在红光区 (663m)吸收峰红移了6nm。这是因为SWCNTs与Ce6非共价相互作用的结果， SWCNTs具有富电子的大π键结构，而Ce6分子的卟啉环也是π键结构，所以他 们可以产生π-π共轭现象。另外，以Ce6在404nm的峰为对照，通过紫外标准曲 线的方法测定平均载药量为144％，结果大于120％。

FTIR光谱是鉴别功能基团的重要方法，因此，我们用FTIR来分析 Chitosan-Ce6-SWCNT纳米光敏剂表面基团的改变。图6(b)是通过红外光谱测定 纳米光敏剂的结构特征，1092cm^-1是壳聚糖上的吡喃环的典型吸收峰，2877cm^-1是苯环上的c-c骨架振动，3430cm^-1是-OH的峰，3296cm^-1是卟吩的N-H峰。 ²⁴以上结果说明药物成功接枝，壳聚糖成功修饰。

评选优良光敏剂的条件之一是光敏剂的暗毒性小而光毒性大。光敏剂的暗毒性 越小，说明光敏剂用于临床越安全；光毒性越大，则光敏剂的杀伤效应越强。暗毒 性即在严格避光条件下，光敏剂本身对细胞的杀伤作用，这种杀伤效应是没有选择 性的，在杀死肿瘤细胞的同时也会造成对正常细胞、组织及系统的损害。而理想的 光敏剂则应避免对正常细胞、组织及系统有损害，即光敏剂的暗毒性越小越好。本 研究采用WST-1方法从细胞水平探讨了Chitosan-Ce6-SWCNTs纳米光敏剂的细胞 暗毒性作用和光动力杀伤效应，并与游离ce6进行比较。图7是 Chitosan-Ce6-SWCNTs对3T3细胞的暗毒性检测。此实验提示 Chitosan-Ce6-SWCNTs纳米光敏剂本身对细胞的内在毒性大小，并在实验条件相同 的情况下与游离Ce6进行比较。在无光条件下，3T3细胞的存活率随光敏剂浓度增 加而逐渐下降，并且可以看到Chitosan-Ce6-SWCNTs纳米光敏剂和ce6即使浓度升 高至100μg/mL，作用24h后，细胞存活率仍均高于85％。

为了评价chitosan-Ce6-SWCNTs纳米光敏剂的细胞内摄作用，我们采用流式细 胞仪对细胞内平均荧光强度进行检测。图8为在温度为37℃时，用流式细胞仪观 察Hela细胞对chitosan-Ce6-SWCNTs(Ce6的终浓度为15μg/mL)的内摄作用。结 果证明经光敏剂预处理的细胞内平均荧光强度比未经处理组明显升高，这些显著的 荧光信号与细胞摄入光敏剂有关。平均荧光强度随着光敏剂处理细胞的时间延长而 增加，表明平均荧光强度越高，光敏剂在细胞内量越多。并且随时间的延长，细胞 内的荧光强度逐渐增强，从图中可以看出1h的荧光强度大于5min的荧光强度。 从图9的荧光显微镜图片进一步验证了这一结果。

为了考察chitosan-Ce6-SWCNTs纳米光敏剂对细胞的光动力杀伤效应，我们在 同样的实验条件下与游离Ce6进行了比较。图10为chitosan-Ce6-SWCNTs对Hela 细胞的IC50测定。实验结果表明，Hela细胞的存活率均随光敏剂浓度增加而逐渐 下降，chitosan-Ce6-SWCNTs纳米光敏剂和ce6的斜率均较陡直，可以看出纳米光 敏剂对肿瘤细胞的光动力杀伤效应较强。在相同浓度时，chitosan-Ce6-SWCNTs纳 米光敏剂的细胞杀伤效率明显高于ce6(P＜0.05)。通过实验结果计算得出，单纯 的Ce6的IC50值是8.80μg/mL，chitosan-Ce6-SWCNTs纳米光敏剂的IC50值是5.98 μg/mL。

图11.纯化后的SWCNTs，Ce6，Ce6-SWCNTs以及chitosan-Ce6-SWCNTs对 Hela细胞的体外光动力作用。结果表明，在相同浓度时，chitosan-Ce6-SWCNTs纳 米光敏剂的细胞杀伤效率明显高于Ce6(P＜0.05)。

光动力效应的强弱受光源、组织氧浓度、光敏剂种类、光敏剂浓度、光源能量 密度等诸多因素的影响，本实验之所以选择用12J/cm²能量密度，是根据文献报道 二氢卟酚类光敏剂所用的能量密度比卟啉类光敏剂小，一般在10～20J/cm²已足够 ²⁵。根据预出试验提示，选用12J/cm²这一较小的光剂量较为合适，可以避免由于 光剂量不足而引起的光动力杀伤效应的减小。

在光动力治疗中，当光敏剂治疗区吸收峰与激发波长相匹配时，才能获得最佳 光动力效应，并可以实施非热效应PDT治疗。值得注意的是，本实验中我们所选 择的激发光源是630nm半导体激光器，而根据前期吸收光谱测定，显示此纳米光 敏剂在669nm处有一个较强吸收峰，尽管我们所用的激发波长与光敏剂吸收峰都 在红光范围内，但并不完全匹配。因此，若选用绝对匹配的激发波长，此纳米光敏 剂的光动力效应可能更强，在临床应用中可能用极小的光敏剂剂量就可以达到很好 的光动力效应，其本身的光毒副反应也将随之降低。

四、结论

Chitosan-Ce6-SWCNTs纳米光敏剂给药系统可以通过细胞的胞吞作用有效进 入细胞；暗毒性小，且有明显的光动力杀伤作用；chitosan-Ce6-SWCNTs对Hela 细胞的体外光动力杀伤效率明显高于Ce6，由此推测，chitosan-Ce6-SWCNTs纳米 光敏剂在以后开展PDT治疗浅表肿瘤或癌前病变中有着相当大的应用潜力。

本发明中二氢卟吩e6的装载量(定义为二氢卟吩e6与单壁碳纳米管的质量比) 大于120％，可以达到1000％。与单纯的二氢卟吩e6相比，本纳米光敏剂给药系 统具有进入细胞迅速、输送药量大等特点，对肿瘤细胞杀伤作用显著。