一种抗流感及禽流感病毒药物帕拉米韦的合成方法

摘要

本发明属于有机药物合成技术领域，公开了一种抗流感及禽流感病毒药物帕拉米韦的合成方法。该方法是以(1R，4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮为原料，经过步骤I催化开环、氨基保护；II1，3-偶极环化加成；III用硼氢化钠和六水合氯化镍还原、N-乙酰化及步骤IV脱氨基保护、以盐酸氯甲脒为反应剂生成胍基和水解甲酯，制得帕拉米韦。本发明在氢化还原过程中使用硼氢化钠和氯化镍还原系统代替价格昂贵的二氧化鉑作还原剂，在上胍基化试剂的过程中使用自制的盐酸氯甲脒，降低了成本，简化了操作。该合成方法反应路线较短，反应条件温和，操作简便，成本低，适合工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于有机药物合成技术领域，具体地说，本发明涉及一种抗流感及 禽流感病毒药物及流感病毒神经氨酸酶抑制剂帕拉米韦的合成方法。

背景技术

流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，具有传 染性强，传播速度快，发病率和死亡率高等特点。

流感病毒的结构其实并不复杂，它是一个脂肪球，里面装有八段RNA链， 球表面有许多重要的蛋白，他们像“钉子”一样“钉”在表面，其结构示意图 见图1。这些“钉子”分为两类，一类是血凝素(HA)，作用是病毒感染宿主细 胞，另一类是神经氨酸酶(NA)，他们负责切断宿主细胞，决定了病毒传播的 效率。因此，神经氨酸酶在流感病毒传染宿主细胞的过程中起关键作用。

流感及禽流感病毒的神经氨酸酶又称唾液酸酶，是存在于流感病毒表面的 糖蛋白酶中，能够促进新生的流感病毒从宿主细胞的唾液酸残基释放，加速流 感病毒感染其它宿主细胞，在病毒的复制过程中起着关键的作用。因此，流感 病毒神经氨酸酶的发现为研究抗流感病毒药物提供了一个全新的靶点。

帕拉米韦，英文名称为Peramivir，化学名为(-)-(1S，2S，3R，4R)-2-羟基 -3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-胍基环戊-1-羧酸，结构式如式I所示，是美 国BioCryst制药公司开发的一种新型环戊烷衍生物类流感病毒神经氨酸酶(NA) 抑制剂，该药物能有效抑制各种流感病毒株的复制和传播过程，且具有耐受性 好、不良反应少且不易出现耐药性等优点。2009年10月美国FDA紧急批准该 药用于治疗H1N1型流感。2010年1月帕拉米韦在日本上市。

式I

帕拉米韦的合成方法文献报道较少，主要是美国BioCryst制药公司的专利 申请CN1282316A、CN1227466A、CN1358170A、CN1367776A等都公开了帕 拉米韦及其重要中间体的合成方法，其中CN1282316A、CN1227466A公开报道 了用作神经氨酸酶抑制剂的取代环戊烷衍生物化合物的合成方法，包括帕拉米 韦的合成方法的报道。CN1358170A公开报道了帕拉米韦中间体(-)-(1S，4R)-4- (叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯的手性拆分方法和合成方法。 CN1367776A公开报道了以文斯内酯和2-乙基丁醛为主要原料，经催化开环、 氨基保护、1，3-偶极环化加成，氢化还原、N-乙酰化、脱保护、上胍基和水解 甲酯等步骤合成了帕拉米韦。

BioCryst制药公司帕拉米韦的主要合成路线如下：

该合成路线是以(1R，4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮为为原料，经过九步 反应合成帕拉米韦，路线较长，收率低。在环化加成过程使用剧毒的苯和异氰 酸苯酯；且在氢化还原过程中，使用价格较昂贵的二氧化鉑作催化剂，需要氢 气还原，在安全操作上，要求较高；在上胍基化试剂的过程中使用了剧毒的氯 化汞，造成了环境污染，不适合工业化的生产。

该药国内尚未批准上市。本申请研究了一种新的帕拉米韦的合成工艺，降 低了生产成本，有利于产业化。抗禽流感药物是目前临床较稀缺的品种。该药 的生产具有良好的市场前景，并将产生良好的经济效益和社会效益。

发明内容

为克服现有帕拉米韦合成方法中的不足，本发明的首要目的在于提供一种 操作简便、成本较低、更适合工业化生产的抗流感及禽流感病毒药物帕拉米韦 的合成方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抗流感及禽流感病毒药物帕拉米韦的合成方法，该方法是以(1R，4S)-2- 氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(记为(1))为原料，包括以下步骤：

I、催化开环、氨基保护：(1R，4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(1)溶解在 无水甲醇溶液中，在氯化氢气体催化下反应，制得(1S，4R)-4-氨基-2-环戊烯-1- 羧酸甲酯盐酸盐(记为(2))；然后将(1S，4R)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯盐酸盐 (2)、保护剂与碱混合于正己烷中，滴加水后反应，制得(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基) 氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯(记为(3))；

II、1，3-偶极环化加成：(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧 酸甲酯(3)与2-乙基丁醛肟及次氯酸钠反应，得到(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基) 氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH-环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯(记为(4))；

III、氢化还原、N-乙酰化：在(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1- 乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH-环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯(4)的甲醇溶液中加入 六水合氯化镍和氢氧化钠，再分批加入硼氢化钠后反应制得(1S，2S，3R，4R)-2-羟 基-3-[(1S)-1-氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基环戊-1-羧酸甲酯(记为(5))；

将(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基环 戊-1-羧酸甲酯(5)加入二氯甲烷中，再依次加入乙酸酐和三乙胺，室温下反应， 得到(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基 环戊-1-羧酸甲酯(记为(6))；

IV、脱氨基保护、以氯脒为反应剂生成胍基和甲酯水解：(1S，2S，3R，4R)-2- 羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基环戊-1-羧酸甲酯(6)在 无水乙醚中，在氯化氢气体催化下反应得到(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰 胺基-2-乙基]丁基-4-氨基环戊-1-羧酸甲酯盐酸盐(记为(7))；

(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-氨基环戊-1-羧酸甲 酯盐酸盐(7)与盐酸氯甲脒反应，然后在碱性条件下水解，得到 (-)-(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-胍基环戊-1-羧酸， 即帕拉米韦。

本发明的帕拉米韦的合成路线如下：

上述帕拉米韦的合成方法中，所述步骤I及步骤IV中氯化氢气体的制备方 法如下：将25～30g氯化钠投入到反应瓶中，缓慢滴加30～40ml浓硫酸，将产生 的气体通过浓硫酸干燥后，得到氯化氢气体，将氯化氢气体直接通入反应溶液 中进行反应。所述浓硫酸的质量分数为98％。

所述步骤I中，(1S，4R)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯盐酸盐(2)的制备过程具 体为：将10～15g(1R，4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(1)溶于100～120ml干燥 的无水甲醇中，室温下搅拌同时通入氯化氢气体2.5～3h，在45～50℃下反应2～3h， 反应结束后，将反应液浓缩至干，得稠状物，加入100～120ml冰无水乙醚，搅 拌过夜，析出固体，过滤后用无水乙醚洗涤滤饼，干燥，即得(1S，4R)-4-氨基-2- 环戊烯-1-羧酸甲酯盐酸盐(2)。

优选地，所述保护剂是二碳酸二叔丁酯，所用的碱为碳酸钠；所述(1S，4R)-4- 氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯盐酸盐(2)、二碳酸二叔丁酯与碳酸钠的摩尔比为1∶ (1.2～1.5)∶(2.5～3)，所述正己烷的物质的量为(1S，4R)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧 酸甲酯盐酸盐(2)的30～40倍，即可保证反应的进行；水的体积比正己烷多 10～20ml。

所述(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯(3)的制备过程具 体为：将(1S，4R)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯盐酸盐加入到正己烷中，然后依次 加入碳酸钠和二碳酸二叔丁酯，搅拌下滴加水；滴加完毕后室温下反应8～10h， 反应束后，分出有机层，经过洗涤、干燥、浓缩至干、过色谱柱后冷冻，得到 (1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯。所述洗涤是依次用水及 饱和氯化钠溶液洗涤；所述干燥是用无水硫酸钠干燥4～6h；所述过色谱柱是将 干燥所得物质以按体积比8∶1混合的石油醚/乙酸乙酯为流动相，过硅胶色谱柱。

本发明提供的一种抗流感及禽流感病毒药物帕拉米韦的合成方法中，所述 步骤II的1，3-偶极环化加成过程中，(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯 基-1-羧酸甲酯(3)与2-乙基丁醛肟、次氯酸钠反应，得到分子式分别如式II-1、 式II-2、式II-3和式II-4所示的四种立体异构体化合物，其中如式II-1所示的 化合物(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH- 环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯(记为(4))为主要产物。

式II-1    式II-2

式II-3    式II-4

以上反应过程中，反应温度较低，2-乙基丁醛肟在次氯酸钠的作用下生成中 间体氧化腈，其结构式为：该物质在控制温度的条件下与反应底 物发生1，3-偶极环加成，得到以上四种立体异构体化合物。

所述2-乙基丁醛肟是2-乙基丁醛与盐酸羟胺反应制得，反应路线如下：

所述2-乙基丁醛肟的制备过程为：将9～12g盐酸羟胺与12～18g碳酸钠溶于 80～100ml水中，反应至不再产生气泡后，在0～5℃下滴加含12～17g2-乙基丁醛 的乙醇溶液60～80ml，滴加完毕后，室温下反应过夜，反应结束后，用冰水稀释 至800～1000ml，用乙醚萃取后合并有机相，依次进行洗涤、干燥、浓缩至干后 过色谱柱，得到2-乙基丁醛肟。

所述(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢 -3aH-环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯(4)的具体制备过程为：在-5～10℃下，向含有 (1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯(3)与2-乙基丁醛肟的二氯 甲烷溶液中，缓慢滴加次氯酸钠溶液，使反应液温度不超过0～5℃，滴加完后 在0～5℃下继续反应30min～1h，然后在室温下反应18～20h，反应结束后， 分离出有机层，经洗涤、干燥、浓缩至干、过色谱柱后干燥，得到 (3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH-环戊基 [d]异噁唑-6-羧酸甲酯(4)。所述次氯酸钠溶液的有效氯的质量含量为10％。

优选地，所述(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯(3)与 二乙基丁醛肟、次氯酸钠的反应摩尔比为1∶(3～3.5)∶(10～15)，所述二氯甲 烷的物质的量为(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯(3)的物质 的的25～30倍，可保证反应的进行。

本发明提供的一种抗流感及禽流感病毒药物帕拉米韦的合成方法中，所述 步骤III的氢化还原、N-乙酰化的操作中，优选地，所述(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁 氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH-环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯(4) 与硼氢化钠、六水合氯化镍、氢氧化钠的摩尔比为1∶(2～2.5)∶(1～1.2)∶0.05； 为保证还原充分，所述六水合氯化镍的物质的量至少为(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁 氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH-环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯(4) 物质的量的1倍。

所述制备(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基) 氨基环戊-1-羧酸甲酯(5)的反应是在N₂保护条件下进行，所述缓慢分批加入硼氢 化钠的过程中，硼氢化钠在10～15min内加完，并控制反应温度不超过0～5℃， 加完后在0～-5℃反应2～3h，反应产物经过分离纯化后得到(1S，2S，3R，4R)-2-羟 基-3-[(1S)-1-氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基环戊-1-羧酸甲酯(5)。

所述分离纯化需要用到亚硝酸钠和氯化铵，分离纯化的具体过程为：当反 应物(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH-环 戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯的用量为4.9～7.5g时，将反应产物浓缩至干，加入亚 硝酸钠1～2g、氯化铵3～5g与氨水100～120ml，室温下搅拌16～18h，抽滤后 将所得固体干燥，得到(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁 氧羰基)氨基环戊-1-羧酸甲酯(5)。所述氨水的质量浓度为25～28％。

所述(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基) 氨基环戊-1-羧酸甲酯(6)的制备过程中，(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-氨基-2- 乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基环戊-1-羧酸甲酯(5)的用量为2～4.8g，乙酸酐的 用量为1.0～2.5ml，三乙胺的用量为1～2ml；所述二氯甲烷的用量为10～60ml。

所述加入乙酸酐、三乙胺后，室温下反应的时间为6～8h，反应结束后，将 反应液浓缩至干，加入少量水配制为溶液，经二氯甲烷萃取后合并有机相，然 后经洗涤、干燥、浓缩至干后过色谱柱，再干燥后，得到(1S，2S，3R，4R)-2-羟基 -3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基环戊-1-羧酸甲酯(6)。

本发明提供的一种抗流感及禽流感病毒药物帕拉米韦的合成方法中，所述 步骤IV的脱保护、上胍基和水解甲酯的过程具体包括脱氨基保护、以氯脒为反 应剂生成胍基和甲酯水解的反应过程，该步骤中，所述盐酸氯甲脒是单氰胺水 溶液在乙醚中与浓盐酸在低温下反应制得，反应路线如下：

盐酸氯甲脒的具体制备过程为：将质量浓度为50％的单氰胺水溶液5～10g 加入到20～40ml乙醚中，0～5℃下加入浓盐酸30～50ml，使反应液温度不超过 5℃，加完后，于室温下反应2～3h；反应结束后，将反应液中乙醚浓缩至干， 冷冻后析出白色晶体，经抽滤、无水乙醚洗涤和干燥，得到盐酸氯甲脒。所述 浓盐酸为质量分数为36～38％的盐酸。

所述(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-氨基环戊-1-羧 酸甲酯盐酸盐(7)的制备过程具体为：将(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基 -2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基环戊-1-羧酸甲酯(6)4～8.4g溶于80～120ml干 燥的无水乙醚中，室温下通入干燥的氯化氢气体1～2h，不再通入氯化氢气体， 通入氯化氢气体时立即有白色固体析出；然后于室温下反应10～12h，反应结束 后后，抽滤，用无水乙醚洗涤滤饼，所得固体经过干燥，得到(1S，2S，3R，4R)-2- 羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-氨基环戊-1-羧酸甲酯盐酸盐(7)。

然后将(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-氨基环戊-1- 羧酸甲酯盐酸盐(7)1.2～2g与盐酸氯甲脒1.23～4g溶于N，N-二甲基甲酰胺20～ 30ml中，加入三乙胺1.8～2.3ml，室温下反应过夜，过滤，向滤液中加入10～ 12ml水和2N NaOH溶液9～15ml，室温下搅拌反应6～8h，反应结束后，蒸出 溶剂，加入少量水，所得水溶液经过离子交换树脂处理并收集洗脱液，洗脱液 浓缩后得到固体，用体积比为1∶9的水/甲醇溶剂重结晶，再经干燥，得到 (1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-胍基环戊-1-羧酸，即帕 拉米韦。

所述离子交换树脂处理的过程中，所用强酸性阳离子交换树脂，将水溶液 上样至树脂后，用水将强酸性的阳离子交换树脂水洗至中性，然后用质量浓度 为8～10％的氨水洗脱，收集洗脱液，浓缩至干；所述干燥为在40℃真空干燥4～ 6h。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

1.在对现有合成方法的深入研究基础上，通过大量的实验发明了帕拉米韦的 改进合成路线，该路线以(1R，4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮为原料，经过7 步反应制得帕拉米韦，总收率为36.4％；该合成路线较短，反应条件温和，操作 简便，适合工业化生产。

2.在氢化还原过程中，使用硼氢化钠和氯化镍还原系统代替价格昂贵的二氧 化鉑作还原剂，降低了成本，简化了操作，安全性较高。

3.在上胍基化试剂的过程中，使用自制的盐酸氯甲脒代替国内无厂家生产的 N，N-二叔丁氧羰基-S-甲基异硫脲，避免了剧毒试剂氯化汞的使用，降低了成本， 避免了重金属废液的产生，避免了污染环境，适合工业的生产。

4.本发明中在帕拉米韦的纯化方法上有所改进，通过多次试验发现使用强酸 性的阳离子交换树脂，能够纯化帕拉米韦。

附图说明

图1为流感病毒的结构示意图。

图2为(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯的1H NMR 图谱。

图3为(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯的13C NMR 图谱。

图4为(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢 -3aH-环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯的1H NMR图谱。

图5为(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢 -3aH-环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯的13C NMR图谱。

图6为(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基) 氨基环戊-1-羧酸甲酯的1H NMR图谱。

图7为(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基) 氨基环戊-1-羧酸甲酯的13C NMR图谱。

图8为(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-胍基环戊-1- 羧酸的1H NMR图谱。

图9为(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-胍基环戊-1- 羧酸的13C NMR图谱。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

以下是帕拉米韦的制备实施例，包括以下9个部分：

1、(1S，4R)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯盐酸盐的制备

将10g(1R，4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶于120ml干燥的无水甲醇中， 于室温下搅拌通入干燥的氯化氢气体3h，不再通入氯化氢气体；在50℃下反应 2h，TLC监测。反应结束后，将反应液浓缩至干得黑色粘稠状液体，向该稠状 物中加入120ml冰的无水乙醚，室温下搅拌过夜，析出白色固体，抽滤，用无 水乙醚洗涤滤饼，得白色固体；40℃真空干燥6h，得到白色固体15.6g，即为 (1S，4R)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯盐酸盐；收率96％。

其中氯化氢气体的制备方法如下：将30g氯化钠投入250ml三口瓶中，常温 下通过恒压滴液漏斗缓慢滴加40ml质量分数为98％的浓硫酸到氯化钠中，用橡 胶塞将瓶口塞紧，将反应产生的氯化氢用导管通入浓硫酸中进行干燥，然后用导 管通入反应瓶中进行反应，整个装置的密闭性良好，并且连接防倒吸装置。

2、(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯的制备

将(1S，4R)-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯盐酸盐5g(28mmol)加入到60ml 正己烷溶液中，然后依次加入碳酸钠8.9g(84mmol)、二碳酸二叔丁酯7.3g (34mmol)，在搅拌下滴加水80ml；滴加完毕后在室温下反应8h，TLC监测。 反应结束后，分出有机层，水层以乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，依次用水 洗及饱和氯化钠溶液洗，然后用无水硫酸钠干燥6h，浓缩至干得淡黄色油状物； 将此淡黄色油状物以按体积比8∶1配制的石油醚/乙酸乙酯溶剂为流动相，快速 过硅胶色谱柱得无色油状液体，冷冻后制得白色固体6.4g，即为(1S，4R)-4-(叔 丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯；熔点35.4-36.9；收率94％。

(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯的1H NMR图谱如图 2所示，¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ5.74(m，2H)，4.95-4.97(d，1H)，4.65(m，1H)， 3.58(s，3H)，3.35-3.37(m，1H)，2.34-2.38(ddd，1H)，1.71-1.77(ddd，1H)，1.32(s，9H)。

(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯的13C NMR图谱如 图3所示，¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ175.06，155.26，134.97，131.21，79.40，55.89， 52.27，49.27，34.66，28.52。

3、2-乙基丁醛肟的制备

将盐酸羟胺12g(172mmol)、碳酸钠18g(170mmol)溶于100ml水中，反 应至不再产生气泡后，在0℃下滴加2-乙基丁醛17g(148mmol)的乙醇溶液80ml， 滴加完毕后，室温下反应过夜，TLC监测。反应结束后，用冰水稀释至1000ml， 用乙醚萃取三次，合并有机相，依次进行水洗，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸 钠干燥6h，浓缩至干得无色油状液体；将此无色油状液体以按体积比10∶1配制 的石油醚/乙酸乙酯溶剂为流动相，快速过硅胶色谱柱，得无色油状液体17.5g， 即为2-乙基丁醛肟，收率90％。

4、(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH- 环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯的制备

将(1S，4R)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-环戊烯基-1-羧酸甲酯5g(20.7mmol) 与2-乙基丁醛肟7.2g(62.1mmol)加入到二氯甲烷60ml中，在-10℃下缓慢滴 加次氯酸钠(有效氯浓度Cl％＝10％)74ml(207mmol)溶液，使反应液温度不 超过0～5℃，滴加完毕后在5℃下继续反应1小时，然后在室温下反应20h，反 应液由淡绿色变为绿色在变为淡绿色，TLC监测。反应结束后，分出有机层， 水层用二氯甲烷萃取三次，合并有机层，依次水洗，饱和氯化钠溶液洗，无水 硫酸钠干燥6h，浓缩至干得淡黄色油状液体；将此淡黄色油状液体以按体积比 9∶1配制的石油醚/乙酸乙酯溶剂为流动相，过硅胶色谱柱，得白色絮状固体；40℃ 真空干燥6h，得白色絮状固体4.94g，即为(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨 基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH-环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯；熔点 108.5-110.2，收率67.6％。

(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH-环 戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯的1H NMR图谱见图4，¹H NMR(300MHz，CDCl₃) δ5.57-5.59(d，1H)，5.17-5.20(d，1H)，4.19(m，1H)，3.73(s，3H)，3.54-3.57(d，1H)， 3.16(d，1H)，2.48(m，1H)，1.97-2.06(m，2H)，1.61-1.63(m，4H)，1.41(s，9H)， 0.83-0.93(tt，6H)。

(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH- 环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯的13C NMR图谱见图5，¹³C NMR(75MHz，CDCl₃) δ175.18，161.22，155.03，87.11，79.58，63.51，55.65，52.60，52.18，40.55，33.44， 28.43，25.70，24.03，11.12，10.84。

5、(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基环 戊-1-羧酸甲酯的制备

将(3aR，4R，6S，6aS)-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1-乙基丙基)-4，5，6，6a-四氢-3aH- 环戊基[d]异噁唑-6-羧酸甲酯4.9g(13.8mmol)、六水合氯化镍3.3g(14mmol) 与氢氧化钠0.028g(0.69mmol)加入到无水甲醇60ml中，在N₂保护和-5℃条 件下，通过干燥加样管缓慢分批加入硼氢化钠1.3g(34.5mmol)，在10min内加 完硼氢化钠，使反应温度不得超过5℃，反应溶液由绿色变为黑色，不断有气体 放出，加完后在0℃反应2h，TLC监测。反应结束后，将反应液浓缩至干得黑 色物质，向其中加入亚硝酸钠1g(14mmol)、氯化铵3g(56mmol)与质量浓度 为28％的氨水120ml，于室温下搅拌16h，溶液中有灰白色絮状物析出，溶液变 为蓝色溶液，抽滤，得灰白色絮状物；40℃真空干燥6h，得到灰白色絮状物4.2g， 即为(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基环戊 -1-羧酸甲酯；收率84.8％，将此灰白色絮状物直接用于下一步反应。

6、(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨 基环戊-1-羧酸甲酯的制备

将干燥完备的(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧 羰基)氨基环戊-1-羧酸甲酯2.7g(7.5mmol)加入到干燥的二氯甲烷30ml中，在 依次加入乙酸酐1.4ml(15mmol)、三乙胺1.0ml(7.5mmol)，于室温下反应6h， TLC监测。反应结束后，将反应液浓缩至干，向其中加入少量的水，用二氯甲 烷萃取三次，合并有机相，依次水洗，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥6h， 浓缩至干得淡黑色液体；将此淡黑色液体以按体积比3∶1配制的石油醚/丙酮溶 剂为流动相，快速过硅胶色谱柱，得白色固体；40℃真空干燥6h，得到白色固 体2.75g，即为(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰 基)氨基环戊-1-羧酸甲酯；其熔点为121.6-123.1；收率92％。

(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基 环戊-1-羧酸甲酯的1H NMR图谱见图6，¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ7.53-7.56(d， 1H)，4.75-4.78(d，1H)，4.24-4.25(d，1H)，4.11-4.18(m，1H)，4.00-4.06(m，1H)，3.72(s， 3H)，2.81-2.86(m，1H)，2.48-2.52(ddd，1H)，2.09(s，3H)，2.01(m，1H)， 1.66-1.75(ddd，1H)，1.35-1.45(m，15H)，0.84-0.89(t，3H)，0.78-0.82(t，3H)。

(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁氧羰基)氨基 环戊-1-羧酸甲酯的13C NMR图谱见图7，¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ175.62， 171.73，156.15，80.19，77.88，52.26，52.19，50.48，49.04，48.19，43.66，33.45，28.51， 23.42，22.03，21.42，10.70，10.17。

7、(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-氨基环戊-1-羧酸 甲酯盐酸盐的制备

将干燥完备的(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-(叔丁 氧羰基)氨基环戊-1-羧酸甲酯8.4g溶于120ml干燥的无水乙醚中，在室温下通入 干燥的氯化氢气体2h，不再通入氯化氢气体，通入氯化氢气体立即有白色固体 析出；于室温下剧烈搅拌反应12h，TLC监测。反应结束后后，抽滤，用无水乙 醚洗涤滤饼，得白色固体；40℃真空干燥6h，得到白色固体6.9g，即为 (1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-氨基环戊-1-羧酸甲酯盐 酸盐；收率98％。氯化氢气体的制备与1相同。

8、盐酸氯甲脒的制备

将50％单氰胺水溶液5g(含60mmol单氰胺)加入到20ml乙醚溶液中，在 0℃下滴加入质量分数为38％的浓盐酸30ml(360mmol)，使反应液温度不超过 5℃，加完后，于室温下反应2h。反应结束后，将反应液中乙醚浓缩至干，冷冻 析出白色晶体；抽率，用无水乙醚洗涤滤饼，得白色晶体；40℃真空干燥6h。 得白色晶体5.6g，即得盐酸氯甲脒；收率82％。

9、(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-胍基环戊-1-羧酸 的制备

将(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-氨基环戊-1-羧酸 甲酯盐酸盐1.2g(3.6mmol)与盐酸氯甲脒1.23g(10.8mmol)溶于干燥的N，N-二 甲基甲酰胺20ml中，在加入三乙胺2.3ml，于室温下反应过夜。过滤，向滤液中 加入10ml水，在加入2N NaOH溶液9ml，室温下搅拌6h，反应结束后，减压 蒸出大部分溶剂，加入少量的水，将此溶液上样至已处理好的强酸性阳离子交 换树脂，用水洗至中性，然后用质量浓度为10％的氨水洗脱。收集洗脱液，浓 缩得白色固体。将此白色固体用按体积比1∶9配制的水/甲醇溶剂重结晶，得白 色固体；40℃真空干燥6h，得到白色固体0.91g，即为(1S，2S，3R，4R)-2-羟基 -3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-胍基环戊-1-羧酸；收率78％。

(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-胍基环戊-1-羧酸 的1H NMR图谱见图8，¹H NMR(600MHz，D₂O)δ4.29-4.31(m，2H)，3.76-3.80(m， 1H)，2.65-2.67(m，1H)，2.46-2.51(ddd，1H)，2.13-2.16(m，1H)，1.90(s，3H)， 1.72-1.76(m，1H)，1.35-1.44(m，3H)，0.92-0.97(m，2H)，0.86-0.89(t，3H)，0.81-0.83(t， 3H)。

(1S，2S，3R，4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基]丁基-4-胍基环戊-1-羧酸的 13C NMR图谱见图9，¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ181.67，173.70，155.63，75.41， 55.23，54.12，50.35，49.96，43.43，34.04，22.83，21.92，20.96，12.15，11.30。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。