细菌β-内酰胺酶在体外诊断与体内成像、诊断和治疗中的应用

摘要

本发明申请提供了一系列成像方法以用于发现，诊断和影像致病菌或与致病菌相关的某病理生理状态，此方法利用荧光、发光或显色检测试剂，例如细菌酶的荧光性底物，笼状荧光素和荧光蛋白，荧光素酶和重组细菌表达的酶类。在与细菌共存的状况下，由荧光、发光或显色检测试剂发出的信号被用来与参照组比较，以检测和定位致病菌。本发明申请也提供了一种筛选方法以筛选用以治疗上述的病理生理状态的治疗性药物，此方法测量并比较在潜在的治疗药物的存在和不存在的情况下，检测试剂发出的荧光或冷光。另外，本发明申请提供了一种以PET和SPECT来检测致病菌的方法，此方法利用该致病菌的β-内酰胺酶、其他酶类或蛋白的放射正电子的底物或放射γ射线的底物来检测。另外，本发明申请提供了荧光性底物CNIR-7或CNIR7-TAT或者放射性标记的底物。

说明书

与相关专利申请文书的交互索引

根据U.S.C.35第119(e)条，本国际专利申请案要求享有以下申请 案的优先权：2008年12月24日递交的、现已放弃专利申请的美国临时 专利申请第61/203,605号和2008年8月6日递交的、现已放弃专利申请 的美国临时专利申请第61/188,112号，并且上述专利申请案的内容以引 用的方式合并于此。

发明背景

发明领域

本发明主要涉及医学、病原微生物学和成像技术。更具体地说，本 发明涉及有助于在个体的体内成像过程中发现和定位致病菌的化合物与 报告基因。

相关的背景知识的描述

很多细菌感染都能在全世界引发很高的发病率和死亡率，其中许多 最重要的细菌都是β-内酰胺酶阳性的，这种酶使它们对普通青霉素类抗 生素具有耐药力。多数感染和青霉素耐药性的诊断通常是困难的，而且 要求在敏感性检测前进行大量的诊断实验室培养。

例如，目前肺结核感染了近三分之一的世界人口，仍然是公众健康 的严重威胁。当人们意识到世界范围内持续出现难以治疗的、具有多重 耐药性和广泛耐药性的菌株时，对肺结核的关注大大增加了。目前实验 室中对结核分枝杆菌活性进行定量和评估的方法是细胞培养，而在动物 模型和人感染期间现有方法仅限于集落形成单位(CFU)的检测和/或组 织与唾液的显微镜观察。这些方法都非常费时，往往难于解释，而且相 对不敏感。大多数方法需要进行介入性操作，对动物和人而言这些操作 必须在死亡后进行。这些不足使得上述方法难以在动物模型和患者体内 跟踪疾病的发展，评价疫苗效力和治疗结果。光学成像技术可以直接观 察到感染期间结核分枝杆菌的活性，能够以非介入方式在患病活体动物 体内实时评价治疗效果并定位致病菌。

因此，有必要改进对细菌性疾病成像的方法。更具体地说，现有技 术在敏感性上存在不足，而特异性的β-内酰胺酶阳性菌实时光学成像方 法能够用于体外和活体个体的诊断与定位细菌感染，还可用于新型治疗 药物的快速筛选和新药物靶位的验证。本发明满足了本领域中长期存在 的需要和愿望。

发明概述

本发明涉及一种实时检测个体体内致病菌的方法。该方法包括向个 体体内或其生物样品中引入致病菌的β-内酰胺酶的荧光、发光或显色底 物，以及通过β-内酰胺酶作用于底物而生成的产物对个体或其样品成像。 因此，通过β-内酰胺酶产物所发出的波长信号可以检测个体体内的致病 菌。本发明涉及另一种相关方法，其方法包括通过β-内酰胺酶产物所发 出信号的三维重建来测定个体体内致病菌的位置。本发明还涉及另一种 相关方法，其方法包括与致病菌相关的病理生理状态的实时诊断，该方 法基于发出信号的强度大于测量的对照信号的强度。

本发明也涉及一种诊断与个体体内致病菌相关的病理生理状态的方 法。该方法包括对个体给药或使其生物样品与致病菌β-内酰胺酶的荧光 底物相接触，以及通过β-内酰胺酶作用于底物而生成的产物对个体成像。 在发射波长上实时检测这些产物所发出的荧光、发光或显色信号的强度， 发现这些产物所发出的荧光、发光或显色信号的强度大于对照组的信号 强度，因此可与病理生理状态的诊断相关联。本发明还涉及一种相关方 法，该方法包括通过信号的三维重建来测定病原微生物的位置。本发明 涉及另一种相关方法，其方法包括注射一种或多种治疗化合物以有效治 疗其病理生理状态。本发明还涉及另一种相关方法，其方法包括对个体 再次注射荧光化合物，并对个体进行再次成像或使其生物样品接触该荧 光底物；对个体或该生物样品成像以监测治疗化合物的功效，若发现发 射信号与诊断时信号相比有所降低，则表明所注射治疗化合物对病理生 理状态具有治疗作用。

本发明还涉及一种方法，其方法包括对能够有效治疗与个体中致病 菌相关病理生理状态的治疗化合物的筛选。该方法包括选择适于致病菌 潜在的治疗化合物，使细菌细胞与荧光、发光或显色检测试剂相接触， 以及使细菌细胞与潜在的治疗化合物相接触。在潜在治疗化合物存在或 不存在下检测细菌细胞所产生的荧光、发光或显色信号，与治疗化合物 不存在时的信号相比较，若发现注射治疗化合物存在下信号下降，则表 明该化合物具有抗致病菌的治疗作用。

本发明还涉及另一种对致病菌成像的方法。该方法包括使致病菌与 β-内酰胺酶的荧光底物接触，向致病菌施加β-内酰胺酶作用生成产物的 激发波长，然后得到上述产物所发出的荧光、发光或显色信号。从而通 过所获得信号的三维重建对致病菌成像。

本发明还涉及一种细菌β-内酰胺酶的荧光底物，该荧光底物为 CNIR-7或CNIR7-TAT。

本发明还涉及另一种实时检测个体中致病菌的方法。该方法包括在 个体体内引入一种以γ射线发射相关同位素进行放射性标记的底物，该 底物是致病菌特异的β-内酰胺酶或是其它酶或蛋白的底物。在酶作用于 底物的过程中，放射性标记底物发射γ射线，采集发出的γ射线产生的 信号，从而对个体成像。基于γ射线生成信号的强度对个体体内的放射 性标记物浓度进行三维重建，从而检测致病菌。本发明还涉及一种相关 方法，其包括基于上述检测方法实时诊断致病菌相关的病理生理状态。 本发明还涉及另一种相关方法，其包括注射一种或多种能够有效治疗病 理生理状态的治疗化合物。发明还涉及另一种相关方法，包括对个体再 次注射放射性标记底物，并对个体再次成像，以监测治疗化合物的功效； 若此时γ射线发射与诊断时相比有所下降，则表明该治疗化合物对病理 生理状态具有治疗作用。

本发明还涉及另一种细菌β-内酰胺酶的放射性标记底物，该放射性 标记底物适用于本文所描述的PET或SPET成像。

本发明其他以及更进一步的目的、特征和优势将在以下以公开为目 的的本发明优选实施例中逐渐明显。

附图说明

因此，结合以上对本发明的简要阐述，并参见附图中解释的某些实 施例，本发明的上述特征、优势和目的，以及会变得更清晰的其他方面， 将会更易于理解。这些附图是本发明的一部分。然而，应当了解，附图 是对本发明优选实施例的解释，因此不应认为是将本发明限制在其范围 内。

图1A至图1C是CC1和CC2(图1A)，以及CHPQ(图1B)和CR2 (图1C)被β-内酰胺酶水解前和水解后的结构图。

图2A至图2B是CNIR1、CNIR2、CNIR3、CNIR4及其被β-内酰胺 酶水解后的结构图(图2A)，以及CNIR9和CNIR10的结构图(图2B)。

图3A至图3C是制备近红外底物CNIR5的合成路线图(图3A)，在 β-内酰胺酶存在或不存在下CNIR5的荧光强度-波长图(图2B)，以及 CNIR5-QSY22的结构图(图1C)。

图4A至图4D是QSY 21(图4A)、QSY21二磺酸盐(图4B)和 QSY22二磺酸盐(图4C)的结构图，以及QSY22二磺酸盐的化学合成 图(图4D)。

图5A至图5B是CNIR7的结构图(图5A)及其化学合成路线图(图 5B)。

图6A至图6B是Bluco的化学合成路线图(图6A)，以及Bluco在 β-内酰胺酶的顺序报告基因生物发光法(SREL)成像中作用的示意图(图 6B)。

图7是以CNIR5检测大肠杆菌中Bla活性的示意图。对照组包含LB 培养基和CNIR5，未加入转化的大肠杆菌。

图8A至图8D是CNIR4(图8A)、CNIR5(图8B)、CNIR9(图8C) 和CNIR10(图8D)被Bla分解前和分解后10分钟时的发射光谱图。

图9A至图9B是大肠杆菌TEM-1型β-内酰胺酶和结核杆菌Bla-C 型β-内酰胺酶以CNIR4(图9A)和CNIR5(图9B)为底物的动力学图。

图10A至图10H是结核分枝杆菌单独培养在含有CNIR4(图10A、 图10E)、CNIR5(图10B、图10F)、CNIR9(图10C、图10G)或CNIR10 (图10D、图10H)的培养基中的荧光掺入率(图10A至图10D)与荧 光分配率的动力学图(图10E至图10H)。

图11A至图11H是结核分枝杆菌在CNIR4(图11A、图11E)、CNIR5 (图11B、图11F)、CNIR9(图11C、图11G)或CNIR10(图11D、图 11H)存在条件下感染巨噬细胞的荧光混合率(图11A至图11D)与荧光 分配率的动力学图(图11E至图11H)。

图12是CNIR4在细胞内掺入感染巨噬细胞的结核分枝杆菌的荧光 共聚焦显微图像。DAPI染色(蓝色)的是感染细胞的核，绿色荧光来自 标记结核杆菌的GFP，红色荧光来自分解的CNIR4。

图13是皮下接种CNIR4(图13A)、CNIR5(图13B)、CNIR9(图 13C)或CNIR10(图13D)并感染结核传分枝杆菌的小鼠的荧光图像， 接种浓度分别为10⁸(每只鼠的左下方)、10⁷(左上方)和10⁶(右上方)。 图13E是用于感染各个化合物在不同浓度下的信噪比图。

图14A至图14E是通过喷雾接种、肺脏已感染结核分枝杆菌的小鼠 的荧光图和CNIR4(图14A)、CNIR5(图14B)、CNIR9(图14C)和 CNIR10(图14D)的荧光信号图。在图8A至图8D中，每一排左边的小 鼠都是未感染的，左侧第二个小鼠感染的是含有突变blaC基因的菌株， 而每一排右侧的两个小鼠感染的是野生型的结核杆菌。成像前24小时， 每一排右侧的三个小鼠静脉注射CNIR4、CNIR5、CNIR9或CNIR10。 图14E是背部图像的肺脏区域中各个化合物的信噪比图。

图15A至图15F是在1小时(图15A)、18小时(图15B)、24小时 (图15C)和48小时(图15D)以底物CNIR5对喷雾感染结核分枝杆菌 的小鼠成像获得的荧光图。每一排的背部、腹部、右侧或左侧视图中， 左侧的小鼠是未感染的，右侧的小鼠是感染的。在上述时间点成像前所 有小鼠静脉注射CNIR5。图15F是对图15A最上排圈出的感兴趣区域的 荧光信号进行定量测定获得的荧光信号比图。

图16A至图16B是喷雾感染结核分枝杆菌的小鼠(图16A)和未感 染小鼠(图16B)的荧光图，采用透射法而不是反射法成像，以降低背 景信号。

图17A至图17D是对表达CNIR5(7nmol)的、左侧肩部异种移植 野生型C6胶质瘤、右侧肩部异种移植cmv-bla稳定转染的C6胶质瘤的 裸鼠体内的Bla成像获得的图像。图17A是图示时间点时的荧光图和明 场图。图17B是各个肿瘤平均密度-时间曲线图。图17C是切除的肿瘤 和器官的图像。图17D是对两种肿瘤提取物中Bla进行CC1检测的结果。

图18A至图18C是对表达CNIR6(7nmol)的、左侧肩部异种移植 野生型C6胶质瘤、右侧肩部异种移植cmv-bla稳定转染的C6胶质瘤的 裸鼠体内的Bla成像获得的图像。图18A是CNIR6的化学结构图。图18B 是图示时间点时的荧光图和明场图。图18C是各个肿瘤平均密度-时间 曲线图。

图19A至图19B是4小时(图19A)和24小时(图19B)后7.5nmol 的CNIR5在不同组织内的生物分布。

图20A至图20B是以静脉注射的CNIR5作为显像剂对感染结核分枝 杆菌的小鼠(图20A)和未感染的对照组小鼠(图20B)体内成像获得 的图像。

图21A至图21C是CNIR探针用于SREL方法检测阈的示意图。图 21A是柱状图，该图表明β-内酰胺酶CNIR探针用于SREL成像方法能 够检测到少于100个的细菌。图21B至图21C是对未感染的活体小鼠(图 21B)和感染结核分枝杆菌的活体小鼠(图21C)体外成像获得的图像。

图22是IRDye800系列荧光团的结构图。

图23是头孢哌酮和拟合成的CNIR探针的结构图。

图24是建立Bluco底物小型偏倚文库的示意图。

图25是包含一个连接在3’-位的烯丙基键的新型指针的结构图。

图26是包含一个连接在3’-位的氨基甲酸酯的新型指针的结构图。

发明详述

本发明说明书中所使用的“一”或“一个”指一或多。本发明权利 要求中所使用的“一”或“一个”，当其与“包括”连接使用时，指一或 一以上。此处所使用的“另一个”或“另外一个”指其中至少还有第二 个或多个相同或不同的权利要求或组分。此外，除非上下文另有规定， 本说明书中所使用的单数术语应包括复数意义，反之亦然。

尽管本公开文本支持仅指另一个和“和/或”的释义，但除非明确指 出其仅指另一个或是指互斥的另一个，此处所使用的术语“或”指“和/ 或”。

此处所使用的术语“接触”指能够使适于PET或SPECT成像方法的 荧光化合物，荧光、发光或显色蛋白及放射性标记底物与致病菌(例如 但不限于结核分枝杆菌(Mbt)和牛型结核杆菌(M.bovis))接触的合适 方法。在体外或离体的条件下，这要通过将一个或多个细菌细胞在适宜 的培养基内暴露于荧光化合物，荧光、发光或显色蛋白下实现。细菌细 胞在由个体获得的样品中。上述样品包括但不限于胸膜液和其他可能含 有细菌的体液(包括血液、唾液、尿液和粪便)。如本文所描述，对于体 内应用，任何已知的注射荧光化合物，荧光、发光或显色蛋白及放射性 标记底物的方法均是适用。

此处所使用的“荧光底物”一词指适宜酶存在下，能够生成合适波 长激发下发出或产生荧光、发光或显色信号的产物的化合物、蛋白、肽 或其他生物活性分子。例如且不限于β-内酰胺酶或荧光素酶存在下能够 生成荧光、发光或显色产物的荧光底物。

此处所使用的“放射性标记底物”一词指以附着、连接或其他方式 与短寿命放射性同位素相连的，能够在正电子发射断层显像(PET)或γ 射线单光子发射计算机断层显像(SPECT)中发射正电子的化合物、蛋 白、肽或其他生物活性分子。

此处所使用的“β-内酰胺酶阳性菌”一词指在发病过程中天然分泌 β-内酰胺酶或能够获取β-内酰胺酶的致病菌。

此处所使用的术语“个体”指治疗的任何对象。该个体最好是哺乳 动物，更优选的是牛或人。

本发明的一个实施方案给出了一种在个体体内实时检测致病菌的方 法，其包括在个体体内或其生物样品中引入致病菌β-内酰胺酶的荧光、 发光或显色底物；以β-内酰胺酶作用于底物生成产物的激发波长对个体 或其样品成像；并采集β-内酰胺酶产物发射波长上的信号；从而检测个 体体内的致病菌。

进一步，该实施方案中的方法包括建立发射信号的三维重建以检测 致病菌在个体体内的位置。在另一个实施方案中，其给出的方法包括基 于发射信号强度大于测量的对照组信号来实时诊断致病菌相关的病理生 理状态。病理生理状态的一个例子是肺结核。

在本发明的一些实施方案中，荧光底物指荧光底物。其中，荧光底 物的例子有CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、 CNIR9、CNIR10、CNIR7-TAT、笼状荧光素、显色试剂或其衍生物。并 且，一些实施方案中的成像波长为约540nm至约730nm。此外，发射信 号为约300nm至约900nm。所有实施方案中的成像波长为约300nm至 约900nm。在一些实施方案中，显色指示指可通过人眼视觉识别的颜色 变化，或可通过仪器测量，以测定指定的数值。此外，致病菌包括拟杆 菌属、梭状芽孢杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、嗜血杆 菌属、军团菌属、分枝杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属 或李斯特菌属其中的菌种。

本发明的另一个实施方案给出了诊断与个体体内致病菌相关的病理 生理状态的方法，其包括向个体注射致病菌β-内酰胺酶的荧光底物；在 β-内酰胺酶作用生成的底物的激发波长上对个体或其样品成像；并实时 检测其产物发射波长上的荧光、发光或显色信号；其中，荧光、发光或 显色信号强度要大于病理生理状态诊断相关测量的对照信号。

进一步，该实施方案的方法包括建立信号的三维重建以检测病原微 生物的位置。在另一个实施方案中，其方法包括注射一种或多种能够有 效治疗病理生理状态的治疗化合物。该方法还包括向个体再次注射荧光 底物；并对个体再次成像以监测治疗化合物的功效；其中，若发射信号 与诊断时相比有下降，则表明治疗化合物对病理生理状态有治疗作用。 所有实施方案中的病理生理状态、致病菌、荧光底物以及激发和发射波 长均如前所述。

本发明的另一个实施方案给出了诊断与个体体内致病菌相关的病理 生理状态的方法，其包括使由上述个体获得的样品与致病菌的β-内酰胺 酶的显色底物相接触；其中，β-内酰胺酶作用于底物而生成的产物能够 引起裸眼可见的颜色变化，从而指示诊断结果。底物可以放置在纸带、 棉签、背景或其他目视指示器上。这种颜色变化是裸眼可见、可识别的， 无须任何设备确认或外部能量源的激发。

本发明的又一实施方案给出了筛选能够有效治疗与个体体内致病菌 相关的病理生理状态的治疗化合物的方法，其包括选择适用于致病菌的 潜在治疗化合物；使细菌细胞与荧光检测试剂、发光检测试剂或显色检 测试剂相接触；使细菌细胞与潜在治疗化合物相接触；并测量潜在治疗 化合物存在和不存在下细菌细胞产生的荧光、发光或显色信号；其中， 治疗化合物存在时与治疗化合物不存在时相比较，若信号下降，则表明 该化合物有抗致病菌的治疗作用。该实施方案中的病理生理状态和致病 菌均如前所述。

在该实施方案中的一方面中，致病菌可能是重组菌，其中使细菌与 荧光、发光或显色检测试剂相接触的步骤包括以包含荧光、发光或显色 检测试剂基因的表达载体转化野生菌。在该方面，荧光、发光或显色检 测试剂包括荧光蛋白。荧光蛋白的例子有mPlum、mKeima、Mcherry和 tdTomato。并且，在该方面中，表达载体包含β-半乳糖苷酶基因，其中 所述方法进一步包括使重组菌细胞与有效荧光团相接触，在β-半乳糖苷 酶存在下发出荧光信号。荧光团的例子有C2FDG、C12RG和DDAOG。 此外，在该方面中，表达载体包含荧光素酶基因，其中所述方法进一步 包括使重组菌细胞与D-荧光素相接触。荧光素酶的例子有萤火虫萤光素 酶、叩头虫红色荧光素酶和rLuc8。

在该实施方案的另一方面中，荧光检测试剂指细菌β-内酰胺酶的荧 光底物。在一个实施例中，致病菌在体内与荧光底物CNIR2、CNIR3、 CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR-TAT、 笼状荧光素、显色试剂或其衍生物相接触。在另一个实施例中，致病菌 在体外与荧光底物CC1、CC2、CHPQ、CR2、CNIR1或CNIR6相接触。

本发明的又一实施方案给出了对致病菌成像的方法，其包括使致病 菌与β-内酰胺酶的荧光底物相接触；向致病菌施加β-内酰胺酶作用于底 物而生成的产物的激发波长；采集生成产物发出的荧光、发光或显色信 号；并建立采集信号的三维重建，从而对致病菌成像。如上所述，在该 实施方案的各个方面中，致病菌能够在体内或体外与荧光或发光底物相 接触。并且，该实施方案所有方面中的致病菌以及激发和发射波长均如 上所述。

本发明的又一实施方案给出了细菌β-内酰胺酶的荧光底物，即 CNIR-7或CNIR7-TAT。

本发明的又一实施方案给出了在个体体内实时检测致病菌的方法， 其包括向个体体内引入以γ射线同位素进行放射性标记的底物；其中所 使用的底物是致病菌特异的β-内酰胺酶、其他酶或蛋白的底物；以放射 性标记底物在酶作用过程中发出的γ射线对个体成像；采集发出的γ射 线产生的信号；并基于γ射线产生的信号强度对个体体内的放射性标记 浓度进行三维重建；从而检测致病菌。

进一步，该实施方案的方法包括基于其检测对与致病菌相关的病理 生理状态进行实时诊断。在又一实施方案中，其方法包括注射一种或多 种能够有效治疗病理生理状态的治疗化合物。在又一实施方案中，其方 法包括向个体再次注射放射性标记底物；并对个体再次成像以监测治疗 化合物的功效；若与诊断时相比γ发射下降，则表明治疗化合物对病理 生理状态有治疗作用。在这些实施方案中，病理生理状态指肺结核。

在所有这些实施方案的一个方面中，放射性标记指正电子同位素， 且其能够通过正电子发射断层显像(PET)成像。在另一个方面中，放射 性标记指直接发射γ射线的同位素，且其能够通过单光子发射计算机断 层显像(SPECT)成像。上述实施方案所有方面中的其他酶或蛋白指β- 内酰胺酶类酶或青霉素结合蛋白。并且，所有实施方案中的细菌菌种均 如上所述。

本发明的又一实施方案给出了适宜PET或SPECT成像的β-内酰胺 酶的放射性标记底物。在该实施方案中，放射性标记物指氟-18、氮-13、 氧-18、碳-11、锝-99m、碘-123或铟-111。

此处给出的是优选的对细菌性疾病和/或感染成像的系统或方法。这 些系统和方法是对患病期间的细菌定量和定位以及实时体内分析抗菌药 物疗效的非常灵敏的工具。应考虑到，这些系统对于在单细胞水平检测 致病菌是有效的。这些体内成像(IVI)系统和方法能够在临床环境中直 接应用于患者。

此处的系统和方法适用于天然具有或获得β-内酰胺酶活性的细菌菌 种。不限于此，β-内酰胺酶阳性的细菌菌种的例子有拟杆菌、梭状芽孢 杆菌、链球菌、葡萄球菌、假单胞菌、军团菌、分枝杆菌、嗜血杆菌、 埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌和李斯特菌。尤其要考虑的是对分枝杆 菌属(如结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌)的诊断、定位和定量。尽管此 处所描述的系统和方法的优势是不需要对细菌菌株进行基因改造以使其 能够被检测，但应考虑到，提高β-内酰胺酶的表达水平、活性和/或分泌 均能够提高检测的灵敏度。正因如此，应考虑到，通过合适的方法向感 兴趣的细菌菌种中引入β-内酰胺酶使其能够被检测，其采用的方法应能 够使β-内酰胺酶的表达和分泌水平足够达到检测方法的灵敏度。这可以 通过在体外或体内使用已知或标准的传送方法来完成，包括使用适宜传 送到哺乳动物体内的噬菌体等传输体。

本发明的体内成像系统能够检测作为β-内酰胺酶活性底物的化合物 或报告基因产生的荧光、发光或显色信号。成像系统在本技术领域已为 人们所熟知，而且已商品化。例如，顺序报告基因-酶联荧光(SREF)系 统、顺序报告基因-酶联发光(SREL)系统或生物发光系统均可以用于检 测β-内酰胺酶活性的产物。。此外，采集的信号能够用于建立三维重建， 以定位病原菌。对于这些系统，成像技术领域的技术人员能够根据使用 的化合物和/或报告基因以及检测的信号类型来选择激发和发射波长。一 个例子是激发信号范围为约540nm至约730nm，发射波长范围为约650nm 至约800nm。应当考虑到，本发明的体内成像系统也能够检测其他信号， 如幅射所产生的信号以及β-内酰胺酶作用于适宜底物或其他检测试剂所 产生的可检测的或可读取的信号。

本发明中的β-内酰胺酶底物指化学物质或量子点物质。例如，通过 SREL或SREF成像的底物指荧光团、笼状荧光素及其他荧光、发光或显 色化合物、报告基因或其他能够给出应用所需最佳信号的检测试剂。该 底物在充分渗透到组织中并产生高信噪比时毒性较低或无毒性。该信号 指近红外、红外或红光信号，例如约650nm至约800nm。

例如，底物指能够在体外或体内经β-内酰胺酶分解产生信号的荧光 底物或量子点物质。荧光底物包括FRET供体，例如吲哚花青绿染料， 如Cy5、Cy5.5或Cy7；FRET淬灭剂，如淬灭基团QSY21、QSY21二磺 酸盐、QSY22或QSY22二磺酸盐。此外，荧光底物还包括为提高细胞 渗透性和/或使其可以连接到小肽上的全乙酰化的D-葡糖胺，例如但不限 于TAT。此外，底物可以被修饰以提高其信号强度、组织渗透能力以及 在所有组织中均匀分布的特异性或性能。此外，应考虑到，其他对组织、 细胞或化合物的标记方法与这些底物相结合有助于提高对致病菌的检测 灵敏度。

具体地说，荧光底物能够检测细菌细胞培养基或体外单个培养的细 菌细胞中的β-内酰胺酶活性。化学荧光底物的例子有CC1、CC2、CHPQ、 CR2、CNIR1和CNIR6。对于体内成像的应用，可替换的荧光底物可以 是CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、 CNIR10或CNIR-TAT。这些荧光底物均可用于顺序报告基因-酶联荧光 (SREF)系统中。应考虑到，β-内酰胺酶的底物能够在体外或体内有效 检测单个细菌细胞。

对β-内酰胺酶的体内检测而言，荧光底物的另一个例子是笼状荧光 素，例如但不限于Bluco，Bluco2和Bluco3。这种底物包括D-荧光素、 萤火虫荧光素酶底物(Fluc)、β-内酰胺和β-内酰胺酶底物。β-内酰胺 经酶分解释放出D-荧光素，D-荧光素经Fluc氧化发光。笼状荧光素可用 于顺序报告基因生物发光(SREL)系统或其他生物发光成像系统。

荧光蛋白也可以用于致病菌的体内或体外检测。荧光蛋白(FP)，例 如mPlum、mKeima、Mcherry和tdTomato，均可克隆到表达载体中。以 荧光蛋白构建载体转化我们感兴趣的病原菌(如结核分枝杆菌)。通过细 菌表达荧光蛋白以产生成像时可检测的信号。其他成像系统能够利用转 化的重组菌来分泌其他酶，例如β-半乳糖苷酶，在有荧光团(如C2FDG、 C12RG和DDAOG)存在的条件下会产生荧光信号。另一些成像系统还 能够利用其他重组系统来表达其他荧光素酶，例如叩头虫红色荧光素酶 和rLuc8，它们在有D-荧光素的存在条件下会产生信号。

另一个选择是使用正电子发射断层显像(PET)或单光子发射计算机 断层显像(SPECT)成像系统。探针包括此处描述的致病菌的β-内酰胺 酶、β-内酰胺酶类酶或其它类似酶或蛋白。PET与SPECT成像技术在 本领域为人们所熟知。对PET成像而言，底物探针是正电子放射性同位 素标记的，例如但不限于氟-18、氧-18、碳-11或氮-13。对SPECT成像 而言，底物探针是γ射线放射性同位素标记的，例如但不限于锝-99m、 碘-123或铟-111。PET和SPECT探针使用众所周知的标准化学和放射化 学合成技术合成和标记。

应考虑到，通过使用小分子(如头孢哌酮)模拟β-内酰胺酶的酶口 袋能够最大化探针的设计和特异性。因此，使用这种高通量小分子系统 设计的底物对诊断目的最为敏感，适于产生能够从现有成像设备可以检 测到的深层组织中有效渗透出来的信号，并防止与其他细菌菌种的交叉 反应。并且，这些灵敏且特异的底物探针在单个细菌水平上也是有效的， 能够把采集的信号的量放大100至1000倍。除此之外，应考虑到，结核 分枝杆菌中的β-内酰胺酶类酶和青霉素结合蛋白(而不是β-内酰胺酶) 能够用于提高探针的特异性。

此处描述的系统和方法可以有效地实时检测、定位、定量并确定致 病菌的活性。体外成像在细胞培养基或单细胞培养中进行，临床样品或 切片的离体成像通过SREL或SREF进行，个体的体内成像通过已公开的 成像系统进行。体外试验中所使用的样品包括但不限于切片、胸膜液和 其他可能包含细菌的体液，包括血液、唾液尿液和粪便。因此，此处给 出的系统和方法能够有效诊断与细菌病原体相关的病理生理状态，例如 病症或感染。由于能够检测包括单个细菌的很少量的细菌，所以比当前 诊断方法能及时诊断并发现早期感染。此处所描述的系统和方法能够用 于有细菌感染风险的医护工作者的检测和定期检查。此外，该系统和方 法也能够用于设备、用具、工具、工作台表面、工作服和人员污染的检 查和检测。由于广泛耐药性结核(XDR-TB)工作人员感染现在已经达到 医护工作者的40％，而主要感染部位是鼻腔、手掌上过度清洗造成的创 口，所以本发明可作为医疗中心和医护工作者的检查致病菌的方法。如 需要，这些系统和方法也可以用于农业和动物学中对β-内酰胺酶的检测。

并且，在当前成像技术范围内信号强度与细菌量的相关性良好。因 此，能够实时监控化合物、药物、药物组合或其他治疗试剂的功效。因 而此处描述的系统和方法给出了抗菌药物的高通量筛选系统。由于对β- 内酰胺酶的检测要求细菌具有活性，所以在一种或多种治疗试剂存在的 条件下酶的水平提供了一种抗菌活性的测量手段。使用适合特定细菌的 底物能够快速测量β-内酰胺酶水平的变化，并几乎立即确定治疗试剂的 有效性。该系统能够检测单个样品，也能够一次检测微孔板中的数千个 样品。

以下给出的实施例是为了解释本发明的具体实施方式，而不是以任 何方式限制本发明。

实施例1

在培养基中检测结核分枝杆菌中的Bla

以对数早期的全细胞和全细胞裂解液检测结核分枝杆菌中的Bla，对 适合该方法的潜在化合物和已知化合物(包括头孢硝噻吩(Calbiochem)、 CENTA Bla底物(Calbiochem)、Fluorocillin Green(Molecular Probes)、 CCF2-AM(Invitrogen)和CCF4-AM(Invitrogen))进行比较。检测所 有样品的稀释液以测定发出显著信号的最小细菌数量或裂解液体积。在 对完整细胞进行检测前后及裂解前，对其进行滴度测定以检测实际使用 的CFU。将96孔板孵育在37℃的细菌培养基中15-120min，用分光光 度法测量四次以评价其灵敏性和重复性。开始时，以生产商推荐的浓度 使用化合物，例如，CNIR5在体内成像中的推荐浓度为2nM。在培养基 中，对大部分灵敏的、可重复的化合物的不同浓度进行评价，以测定获 得最大信号所需要的最小浓度。上述实验的对照组包括阳性对照，耻垢 分枝杆菌和商用的Bla(Sigma)；以及阴性对照，Bla缺失的Mtb blaC突 变体(罗切斯特大学的M.Pavelka博士提供的PM638)(1)。对BCG的 Bla产量进行评价，因为某些情况下BCG会被用BL2实验室中进行的IVI， 该实验室中有各种可供使用的成像设备。

评价blaC突变型结核分枝杆菌和野生型结核分枝杆菌中的重组Bla构建载体

利用两个多拷贝载体与两个单拷贝载体在结核分枝杆菌中表达Bla。 多拷贝载体基于携带pMV262来源的hsp60启动子(Phsp60)的pJDC89， 已经证明，pMV262可中等量表达基因。该载体还携带潮霉素抗性，包含 Phsp60下游的一个多接头、一个大肠杆菌复制起始位点和分枝杆菌 pAL5000的复制起始位点。为了增加该载体的表达量，用L5启动子(PL5) 替代Phsp60，其表达基因较Phsp60高50-100倍。两种启动子都是相对 保守的，并且能够在大部分细菌体内表达。除非明确提到，大部分克隆 都是采用In-Fusion 2.0 PCR克隆系统(Clontech)进行的，该系统允许 利用感兴趣区域PCR所用引物的15bp最小同源区域直接克隆基因片段 到线性构建载体中。

通过克隆包含ccdB基因及启动子下游左右两侧Gateway重组序列的 PCR片段，将两种构建载体改进为Gateway(Invitrogen)供体载体。携 带该区域的载体必须保存在允许ccdB区域存活的ccdB存活菌株里；而 在其他大肠杆菌中该区域是致死的，在克隆期间这一性质被用来阻止非 重组载体的存活。将上述启动子和相关的Gateway区域克隆到pYUB412 载体中，pYUB412载体具有潮霉素抗性，包含大肠杆菌复制起始位点、 L5噬菌体结合位点(attP)和L5重组酶，因此该菌株可以整合到结核分 枝杆菌染色体的attB位点，以单拷贝存在于结核分枝杆菌中。利用携带 Gateway重组序列的引物，通过Gateway BP反应(Invitrogen)将Mtb的 Bla基因克隆到上述载体中。如前所述，通过电穿孔法将上述载体转化到 Mtb和blaC突变体中。利用所述内源Bla体外检测法对得到的Mtb菌株 进行评价，将其信号强度与阴性对照blaC突变体和仅携带适宜的载体主 干部分的野生型菌株的信号强度相比较。

尽管CNIR5是高度膜透性的，但是通过将Bla定位到较细菌本身具 有更大表面积的宿主细胞膜上从而有助于报告基因与化合物接触，提高 信号强度。由于结核分枝杆菌的吞噬小体不是静止的，其与几种脂和受 体循环通路相互作用，也有几种标记物出现在循环溶酶体中的，所以合 适的靶向蛋白应该可以通过分枝杆菌吞噬小体进入宿主细胞中。Mtb的 Bla借助其氨基端的TAT信号从细菌中分泌出来，而添加的羧基端标签 使其定位于细胞膜上。磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，如能够在巨噬细胞 表面很好地表达的CD14，通过羧基端信号序列定位于细胞膜上。

构建含有CD14的GPI锚定蛋白信号序列羧基端24个氨基酸和Mtb 来源的Bla的融合蛋白(Bla::GPI)。利用Gateway系统将融合蛋白克隆 到Mtb的四种表达系统中，并转化到野生型Mtb和blaC突变体中。得到 的菌株能够表达Bla::GPI融合蛋白，以blaC突变体作为阴性对照，利用 胞内检测法评价原始Bla和感染的巨噬细胞表面的Bla水平。对完整的感 染巨噬细胞和以0.1％的triton裂解的巨噬细胞进行检测。

底物水解前后的荧光光谱

在1ml浓度为1μM的PBS中采集底物的激发和发射光谱。向溶液 中加入10nM纯化的Bla，再次采集其激发和发射光谱，直至光谱不再变 化为止。通过比较发射波长峰值690nm处的发射强度来估计Bla水解后 探针荧光信号的增强。

以探针作为Bla底物的体外酶动力学

以在约690nm处荧光强度的增长率(v)表示探针的水解速率。在 Mtb的Bla浓度为1nM的条件下，分别测定探针浓度为5、10、20、50、 80μM时的水解速率(v)。以底物水解速率(1/v)对底物浓度(1/[探针]) 作双倒数图来计算Bla水解探针的k_cat和K_m。

底物的生物稳定性

以约690nm处荧光强度的增长率来估计底物在生理条件下自发水解 的速率。因此，室温孵育1小时后对其进行荧光定量，以评价底物在水 溶液和血清中的稳定性。

对培养细胞中表达的Bla成像

以Bla(cmv-bla)转染的和野生型的人外周血白血病T细胞系Jurkat 和C6小鼠神经胶质瘤细胞系对底物进行测试，使用已发表的成像条件(3) 以荧光显微镜对其进行成像。

mRNA与NIRF信号的线性相关

野生型的和cmv-bla转染的人外周血白血病T细胞Jurkat以不同比例 混合(cmv-bla转染细胞比例分别为10％、20％、40％、60％和80％)，细 胞密度为5×10⁵/ml。在细胞混合物中加入5μM底物，孵育30分钟，所 有样品以预冷PBS洗涤，离心并裂解。对最终上清液进行荧光检测。以 northern分析对mRNA水平和Bla表达水平进行定量。mRNA浓度-Cy5.5 荧光强度曲线反映了二者之间是否存在线性关系。

培养基中结核分枝杆菌β-内酰胺酶的定位与调控

Mtb接种时O.D.为0.05，在整个生长曲线以qRT-PCR检测Bla的转 录，直至平台期(O.D.＝2)。通过每天从培养基中分离RNA以评价转录 其水平，且所有培养物均有三个重复。如前所述进行RNA分离(4)以 及使用SYBR Green的qRT-PCR(5)。在生长曲线的一个或两个关键点 以Northern杂交确认RNA水平。将上述数据与相同条件下对全细胞和全 细胞裂解液进行的、以头孢硝基噻吩进行的Bla活检测相比较。

检测β-内酰胺诱导blaC的能力。在β-内酰胺存在和不存在下，在 整个生长曲线以相同方式对RNA转录进行分析。羧苄青霉素可以杀死 Bla阴性的Mtb。将50、250和500μg/ml的羧苄青霉素与对数早期的Mtb 共孵育2小时，并对BlaC的转录水平和全细胞和全细胞裂解液中的Bla 活性进行检测。使用商用的Bla(Sigma)建立标准曲线以对Bla表达水 平进行定量，以相同方法培养的Mtb的blaC突变体作为Bla活性检测的 阴性对照。

巨噬细胞中Bla的检测

基本上，将小鼠巨噬细胞株J774A.1以1×10⁴细胞/孔接种在96 孔平底培养板中，37℃培养过夜。向对数早期的Mtb单细胞悬液加入不 同感染比率(1000至0.001个细菌每细胞)的细菌，37℃孵育30分钟。 然后以PBS洗涤孔两次，加入含有200μg/ml的丁胺卡那霉素的新鲜培 养基，37℃孵育2小时以杀死胞外细菌。再以PBS洗涤孔，在分光光度 计检测信号前在含有不同浓度的试验化合物的新鲜培养基中孵育60-180 分钟。在加入化合物以评价宿主细胞透性在检测方法中的作用前，向复 孔加入0.1％的Triton X-100裂解细胞。

在所有时间点，对四个未处理的孔进行检测以测定与细胞相关的 CFU数值。通过荧光显微镜确认最有效化合物的信号的定位。以相似方 式对其进行显微镜分析，但使用八孔腔室培养玻片来定位信号，通过阳 性信号测定细菌的百分比并评价已定位的信号的强度。

生物测试及药代动力学研究

注射后(每个时间点注射三只小鼠)，在不同时间间隔(30分钟、 240分钟、12小时、24小时、48小时和72小时)以颈椎脱臼法处死麻 醉小鼠。心脏穿刺采集血样，并迅速摘取组织(肿瘤、心脏、肾脏、肝 脏、膀胱、胃、大脑、胰腺、小肠、大肠、肺脏和脾脏)用荧光仪测量 近红外荧光。数据以每克组织的荧光单位(FU)[FU/(g组织)]表示。

β-内酰胺酶活性测定

异种移植肿瘤中Bla的酶浓度按照以下操作流程测定：以预冷PBS 洗涤摘取的肿瘤组织两次；加入Promega的裂解缓冲液(4ml/g组织)， 并匀质组织溶液；将组织匀浆冻融三次，然后离心收集上清；用荧光底 物CC1测定Bla活性。根据Qiagen Inc.的RNA提取流程对cmv-bla转染 的肿瘤中Bla的mRNA进行确认并进行RT-PCR分析。cmv-bla转染的肿 瘤中观察到的近红外信号与Bla活性相关，说明上述测量方法是有效的。

检测体内Bla的RNA表达

根据结核分枝杆菌RNA标准提取方案(6)提取体内表达的Bla RNA， 并运行以组成型rRNA基因为对照的qRT-PCR。上述检测提供了评价Bla 在所有组织中表达水平的一种方法，其获得的结果可与观察到的IVI信 号水平相比较。收集的RNA水平应该低于RT-PCR检测到的水平，否则 组织中还存在可定量的CFU。RT-PCR前用以线性高保真度扩增DNA的 phi29聚合酶(Fidelity Systems)扩增cDNA，以使扩增后的模板水平能 够被定量。

体内Bla菌株的表达、稳定性和毒力

八组Balb/c小鼠(每组4只)以100-1000cfu/肺进行喷雾感染。将 细菌菌株从-80℃贮存解冻，通过27G注射针头2x产生单细胞悬液用于 喷雾感染。喷雾感染在威斯康星大学构建的可以向肺泡腔内直接传送飞 沫核(7-10)的“Madison”室中进行。使用设计用来处理毒性结核杆菌 菌株的ABSL3工具实施Mtb感染。解剖前，感染的小鼠置于比较医学中 心的ABSL3容器中饲养。在所有时间点(1、14、28和72天)，对每种 菌株(blaC和WT)感染的一组小鼠(每组4只)进行解剖以测定肺脏 和脾脏中的CFU、blaC的RNA水平和Bla活性。如此处所述，以头孢 硝基噻吩测定RNA转录水平和Bla活性。

对两种有望用于IVI的重组菌株在体内表达的重组Bla的稳定性及对 毒力的影响进行检测。如上所述，以100-1000cfu/肺的喷雾感染12组 Balb/c小鼠(每组4只)。在所有时间点(1、14、28和72天)，将每种 细菌菌株(野生型、构建载体1和构建载体2)一组小鼠(每组4只)进 行解剖以测定肺脏和脾脏中的CFU，对其进行组织病理学研究，并检测 相应构建载体的存在及Bla活性。在CFU滴度板上对至少20个单个菌落 进行Bla检测以测定携带构建载体的细菌数量百分比。检测组织匀浆的 Bla活性以评价剩余Bla的总水平。如此处所述，以头孢硝基噻吩测定 Bla活性。

实施例2

采用细胞移植模型的活体显微成像法

将全能受体Tr、CD8⁺ T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞移 植到感染BCG的同系小鼠体内，采用体内发光成像法(BLI)和图像引 导的活体显微术(IVM)对上述细胞随时间的分布成像。一种体内以β- 肌动蛋白启动子产生荧光素酶的转基因小鼠提供了能够在非转基因动物 体内发光的组织和细胞的来源(11-12)。这种小鼠品系(L2G85)具有较 强的萤火虫荧光素酶(Fluc)生物发光，但GFP荧光较弱，所以将其与 另一个淋巴细胞中有较高GFP表达和较强GFP荧光的小鼠品系交配。因 此，当受体体内全能细胞干细胞和其他细胞扩散、重新分布或清除时， 我们采用BLI对其空间分布进行跟踪，并且随后能够利用GFP通过IVM 使检测到的细胞可视化。

在FVB背景下构建L2G85小鼠，所以以FVB/NJ(Jackson实验室) 野生型小鼠作为L2G85细胞的受体，以预防移植细胞的排斥反应。80只 FVB/NJ小鼠以含有10⁴CFU的BCG的20μl生理盐水滴鼻感染。24小 时时处死4只小鼠，以测定感染后肺脏中的初始CFU。感染后14天后再 处死4只小鼠进行组织病理学研究以测定肺脏和脾脏中的CFU。感染后 14天时将剩余的72只小鼠分为4只一组，分别经尾静脉注射L2G85 Tr 细胞、CD8⁺ T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，未注射细胞的 小鼠作为对照组。在28天、42天和56天时按照所述方法(12)在D- 荧光素存在下对包括对照组在内的六组小鼠(每组4只)成像。

成像后，利用光纤共焦显微镜(Cell-viZio，Mauna Kea)通过活体显 微术(IVM)对明显病变进行更详细的检查。IVM使用由成千上万条光 纤组成的柔性微探头。实施全身麻醉，然后通过能够快速愈合的小切口 探测该部位，以避免手术后需要处死动物，并实现细胞水平上的可视化。

成像后处死对照组小鼠，以测定注射细胞的小鼠体内观察到信号的 肺脏和其他器官中的CFU。采集背部、腹部和两侧图像以更好地测定光 子发射的来源。通过解剖组织、在D-荧光素中孵育新鲜组织并在没有重 叠组织的条件下对其成像，上述结果在另一组动物中得到进一步的确认。 通过荧光显微镜观察表达GFP的移植细胞，并进行苏木精-伊红染色和 抗酸染色以鉴定组织中的细菌和细胞，以对所有明显感染的组织进行详 细的组织病理学研究。

肉芽肿形成期间对单个细菌和免疫细胞在的体内成像

在移植模型下，选用两种使肉芽肿形成可视化的最佳的细胞类型在 活体小鼠中观察细菌和宿主细胞。选取三个时间点，分别是病变刚好可 见、病变完全形成以及能观察到移植细胞信号的最晚时间点。32只 FVB/NJ小鼠以含有10⁴CFU的表达IVI报告基因(如tdTomato)的BCG 的20μl生理盐水滴鼻感染。另一组4只对照小鼠是未感染的。24小时 时处死4只实验小鼠，以测定感染后肺脏中的初始CFU。感染后14天 时再处死4只实验小鼠，进行组织病理学研究以测定肺脏和脾脏中的 CFU。感染后14天时将剩余的24只小鼠分为4只一组，其中12只小鼠 经由尾静脉注射能使肉芽肿形成可视化的L2G85细胞，另外未注射细胞 的12只小鼠作为对照。在三个时间点，根据所述该当(12)，在D-荧光 素存在下，对两组(每组4只)小鼠(注射细胞的与未注射细胞的)成 像。

成像后，利用光纤共聚焦显微镜(Cell-viZio，Mauna Kea)通过活体 显微术(IVM)对明显病变进行更详细的检查。实施全身麻醉，并通过 小切口探测该部位。成像后处死对照组小鼠，以测定注射细胞的小鼠体 内观察到信号的肺脏和其他器官中的CFU。通过解剖组织、在D-荧光素 中孵育新鲜组织并在没有重叠组织的条件下对其成像，上述结果在另一 组动物中得到进一步的确认。滤波片组用于检测组织中移植细胞和细菌 报告基因的信号。通过荧光显微镜观察表达GFP的移植细胞，并进行苏 木精-伊红染色和抗酸染色以鉴定组织中的细菌和细胞，以对所有明显 感染的组织进行详细的组织病理学研究。

成像分析

利用Xenogen Inc的商用软件——Living Image——在PC计算机上处 理采集到的图像。在全身荧光图像的肿瘤上标出了感兴趣区(ROI)。IVIS 成像系统的一个关键特征是该系统以美国国家标准技术研究所(National  Institute of Standards and Technology，NIST)的可追踪光谱辐射源进行标 定。通过考虑通过光学器件和光圈(f/stop)的衰减、成像时间和像素合 并，这种标定提供了将CCD摄像机计数转化为个体表面的辐射的方法。 因此，所得到的图像以表面辐射的物理单位(photons/sec/cm²/sr)表示。 对感染小鼠、对照小鼠和正常组织的ROI综合信号(在1photons/sec单 位)进行比较(感染小鼠：对照小鼠：正常组织的比率)。利用GraphPad  Prism 3.0(GraphPad Software，San Diego，CA)进行统计分析。显著性水 平设为P＜0.05。

实施例3

β-内酰胺酶荧光底物的检测

CC1、CC2、CHPQ和CR2

荧光化合物CC1、CC2、CHPQ和CR2对于在体外的或单个培养细 胞中检测Bla活性是有效的。这些探针在被Bla水解前不发出荧光，在 Bla反应后发出荧光(图1A-1B)。根据需要，一系列不同的荧光发射可 以选择用于检测Bla：CC1和CC2的蓝色、CHPQ的绿色以及CR2的红 色。这些新型荧光底物比CCF2小，易于制备，使用简单，对检测Bla 活性具有高灵敏度，且利于不同的生物样品中Bla活性的检测。

在内酰胺的3’碳原子和离去基团之间插入烯烃基团有助于提高Bla 水解的动力学效率。例如，对CC1而言，k_cat值为174s^-1，但其未插入双 键的衍生物的k_cat值仅为35s^-1。催化效率约提高了5倍。应考虑到，这 一设计可以作为生成各种各样的Bla荧光底物的一般策略，包括用于整 体动物荧光成像的近红外底物。

也应考虑到，新型猝灭剂QC-1和近红外荧光团IRDye 800CW可以 改进探针。此外，基于IRDye的探针可以通过磺酸基团加成进行修饰。

CNIR1、CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR 5、CNIR9和CNIR10

近红外/红外荧光底物有利于对整体荧光成像的活体动物中Bla的表 达成像，因为红外/近红外线比可见光具有更好的组织穿透能力且光散射 更少，被血红蛋白吸收更少(13)。化合物CNIR1、CNIR2、CNIR3、CNIR4、 CNIR 5、CNIR9和CNIR10是用于对培养细胞中Bla的表达成像(图 2A-2B)一系列的近红外荧光底物。这些底物化合物可以作为构建细胞可 透过性的Bla近红外荧光底物的参照标准，并能用于检测电荷对细菌细 胞内或动物体内探针的可用性的影响。

对Bla活性的检测建立在荧光共振能量转移(FRET)基础之上。探 针包含FRET供体和FRET猝灭剂。为了用于在体成像，荧光团在理想 的情况下应该具有大于650nm的发射波长和较低的毒性。吲哚菁染料 (Cy5、Cy5.5和Cy7)的发射波长为650nm到800nm，并已经用于成 千上万患者的诊断和治疗中，而且据报道副作用极小。因此，选择Cy5 作为FRET的供体。研究证明，猝灭基团QSY21本身不发出荧光，但吸 收光谱较宽(540nm至730nm，峰值位于660nm)，是Cy5发射波长的 有效猝灭剂。

CNIR1基本上不发出荧光，但经Bla处理后将生成在660nm波长处 发射强度提高57倍的强荧光产物(14)。然而，CNIR1本身不是细胞通 透性的，因而不能用于Bla的在体成像。为了提高CNIR1的细胞膜通透 性，将CNIR1与全乙酰化的D-葡糖胺偶联生成CNIR3，CNIR3具有较 好的细胞可透过性并且能够用于对单细胞中Bla的表达成像。为提高其 可溶性，将两个磺酸基团加成到QSY21上，即生成CNIR4。

CNIR5和CNIR6

CNIR1至CNIR4均以Cy5为基础。对于体内动物成像而言，Cy5.5 因其发射波长更长而成为首选。因此，我们采用Cy5.5替代了Cy5，并且 合成了CNIR5(图3A)。最终产物经HPLC纯化并以质谱表征(计算出 的C₁₂₂H₁₂₃N₁₁O₃₉S₁质量：2687.98；MALDI-MS观测到[M+H]⁺的质量： 2687.68)。CNIR5一旦被激发，其本身在690nm处发出微弱荧光，但经 Bla处理后，其荧光强度增加9倍以上(图3B)。其Bla水解动力学在pH 值为7.1的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中测定：催化 常数k_cat＝0.62±0.2s^-1，米氏常数K_m＝4.6±1.2μM(上述数值由水解速率 对底物浓度的双倒数图作加权最小二乘拟合获得)。其催化效率(k_cat/k_m) 为1.36×10⁵M^-1s^-1。CNIR5在PBS中非常稳定，自发性水解速率为1.75 ×10^-7s^-1。CNIR5在小鼠血清中也是非常稳定的，即使孵育12小时之后 也几乎没有观察到荧光的增强。CNIR6是CNIR5的去全乙酰化D-葡萄糖 的衍生物，用作对照。

CNIR5也可以通过以QSY22替代QSY21来合成(图3C)。这种合 成与CNIR5的合成很相似，并没有什么问题。QSY22的合成将在下文讨 论。

CNIR7

CNIR7是对CNIR5的修饰，提高了其对Bla在体成像的灵敏度。用 于CNIR5的猝灭基团QSY21二磺酸盐，其最大吸收为675nm，但Cy5.5 发射峰值位于690nm。因此，与CNIR5一样，猝灭效率只有90％，其中 大部分构成了可观察到的背景荧光。在QSY21和Cy5(CNIR1)的FRET 供体-受体对中，由于QSY21和Cy5之间光谱重叠较好，其猝灭效率超 过98％。因此，能够吸收690nm波长光线的猝灭基团能够更好地猝灭 Cy5.5，降低背景信号。据报道，对于QSY21而言，当二氢吲哚被四氢 喹啉取代的时候，其吸收最大值红移14nm。

因此，通过用四氢喹啉取代QSY21的二氢吲哚基团合成了新结构的 QSY21二磺酸盐(图4A-4D)，其最大吸收同样红移14nm。由于两者唯 一的结构差异是QSY22包含六元稠环的四氢喹啉，而QSY21包含五元 的二氢吲哚，因此可以使用磺化化学方法使其在苯环的相同磺化位置(对 位)上磺化。因此，QSY22二磺酸盐应该能够更有效地猝灭Cy5.5，降 低背景信号。

第二，CNIR5的k_cat值约为0.6s^-1，较CC1和CCF2小得多。在猝灭 剂和Cy5.5之间插入双键也可以使k_cat增大。第三，减小FRET供体Cy5.5 和猝灭剂QSY22二磺酸盐之间的距离以提高能量转移效率。CNIR5具有 较长的包含与转运体相连的半胱氨酸的连接基团。在新型的CNIR7中， 转运体与Cy5.5的其他偶联部位相连，因此不再需要较长的连接基团。 此外，用2-氨基苯硫酚取代CNIR5中的4-氨基苯硫酚，可以进一步缩短 Cy5.5和猝灭剂之间的距离。图5A-5B显示的是NIR底物的最终设计、 CNIR7及其化学合成。该合成能够以更短的路线完成，较CNIR5的合成 更加简单。

CNIR7也可能包括阳离子短肽，例如取代全乙酰化的D-葡糖胺的 TAT序列。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸可以避免肽酶水解。研究证明， 阳离子短肽(如触足蛋白同源域的第三个螺旋(15-16)、HIV-1 Rev蛋白 和HTLV-1 Rex蛋白的基本域以及HIV-1 Tat的碱性结构域)能够透过细 胞质膜。

用于结核分枝杆菌中Bla成像的笼状Bla底物

Bla笼状底物(Bluco)的结构(图6A)包括D-荧光素、萤火虫荧光 素酶底物(Fluc)和β-内酰胺及β-内酰胺酶底物。D-荧光素的酚羟基基 团对其被Fluc氧化至关重要。当酚羟基基团直接通过醚键与头孢菌素的 3’位置偶联时，所得到的复合物是Fluc专一性较差的底物，但仍然是Bla 的底物。Bla切开的β-内酰胺环的开口会触发自发断裂，从而导致3’位 醚键的断裂并释放在发光作用中能够被Fluc氧化的游离的D-荧光素。

为提高复合物的稳定性，头孢菌素的硫化物被氧化成亚砜，从而给 出最终结构——Bluco。Bluco的制备能够通过多步有机合成来完成(图 6B)。由于Bluco较CNIR系列的探针小得多，因此它能够更好地透过结 核分枝杆菌的细胞壁。7位氨基位置上已知的取代可以用来设计用于对 TB中Bla进行SREL成像的TB特异性的笼状荧光底物。通过插入双键 (Bluco2)可以获得具有较高K_cat值的Bluco，也可以通过使用氨基甲酸 酯连接(Bluco3)来实现。

实施例4

CNIR4、CNIR5、CNIR9和CNIR10的FRET与荧光掺入动力学体外FRET

以CNIR5检测大肠杆菌中的Bla活性

进行初步实验以测试CNIR5是否能够检测活菌中的Bla活性。以氨 苄青霉素抗性质粒转化大肠杆菌，30℃培养过夜。收集细胞并用LB培养 基洗涤两次，然后加入500nM的CNIR5。每隔一段时间采集荧光光谱(激 发波长：640nm)，其数据如图7所示。在测量的最后(t＝160分钟)，加 入纯化的Bla溶液以证明CNIR5被完全水解。结果表明CNIR5能够检测 大肠杆菌中的Bla。与之相比，在同样的条件下使用Invitrogen公司的荧 光底物CCF2/AM时，未检测到LB培养基中大肠杆菌的Bla。

FRET光谱

图8B-8E是探针CNIR4、CNIR5、CNIR9和CNIR10被Bla分解前 和分解后10分钟时的FRET发射光谱。

大肠杆菌TEM-1和结核分枝杆菌Bla-C以CNIR4和CNIR5为底物的动力学

表1比较了大肠杆菌TEM-1型β-内酰胺酶和结核分枝杆菌Bla-C型 β-内酰胺酶以CNIR4和CNIR5为底物的动力学(图9A-9B)。

表1

使用这些CNIR探针检测荧光掺入结核分枝杆菌的动力学。图 10A-10H是CNIR4探针和CNIR5探针作为结核杆菌底物的掺入率和分 配率，是图11A-11H其作为感染巨噬细胞的结核杆菌底物的掺入率和分 配率。

CNIR4掺入结核分枝杆菌

荧光共聚焦显微镜结果证明，感染巨噬细胞的结核杆菌从细胞内掺 入了CNIR4(图12)。DAPI染色(蓝色)的是受感染细胞的细胞核，绿 色荧光来自标记结核分枝杆菌的GFP，红色荧光来自分解的CNIR4。应 注意到，CNIR4发出的荧光来自受感染细胞内，而未受感染的细胞则不 会发出荧光。

体内检测CNIR探针的荧光信号

以不同浓度的结核分枝杆菌皮内感染小鼠。左下象限有10⁸个细菌， 左上象限有10⁷个细菌，右上象限有10⁶个细菌。在CNIR4、CNIR5、 CNIR9或CNIR10探针存在时检测其荧光(图13A-13D)。CNIR5的荧光 信号最强，且其信号随着接种物浓度的增加而增强，按照荧光信号强度 然后依次为CNIR10和CNIR9。CNIR4的荧光并未增强。并且，检测经 肺脏喷雾接种野生型的结核分枝杆菌或blaC基因突变的结核分枝杆菌的 小鼠体内的CNIR4、CNIR5、CNIR9和CNIR10探针的荧光(图 14A-14D)。CNIR10总荧光强度最高，然后依次是CNIR9、CNIR5和 CNIR4(图14E)。

以CNIR5为底物对荧光掺入率成像，并对对照组小鼠和喷雾感染结 核分枝杆菌的小鼠的动力学随时间作图，同时对其成像。在1小时、18 小时、24小时、48小时和96小时对对照组小鼠和感染小鼠成像(图 15A-15E)。喷雾感染后48小时CNIR5的掺入率出现峰值(图15E)。图 16A和图16B分别是未感染小鼠和喷雾感染结核分枝杆菌的小鼠的荧光 图像，为降低背景信号采用透射法而不是反射法成像。

实施例5

CNIR5的在体成像

小鼠肿瘤模型中的CNIR5

向裸鼠的左肩注射约1×10⁶个大鼠C6胶质瘤细胞，并向同一裸鼠 的右肩注射数量相同的cmv-bla稳定转染的大鼠C6胶质瘤细胞。当肿瘤 直径达到约6mm的时候，麻醉下经由尾静脉向小鼠注射7.0nmol的 CNIR5。注射后不同时间点，用IVIS 200成像仪以Cy5.5滤光片组(激 发波长：615-665nm；发射波长：695-770nm)对小鼠进行扫描，扫描时 间为1秒。

图17A是注射前和注射后2小时、4小时、12小时、48小时、72小 时的典型图像。注射后的前两个小时，cmv-bla肿瘤的荧光强度较野生型 (wt)C6肿瘤更高。这种对比度在24小时达到最高值1.6，然后开始下 降，在48小时和72小时时约为1.3(图17B)。成像结束时，处死小鼠 以摘取体外成像和生物分布研究中使用的器官和肿瘤，用于确证上述成 像数据。图17C是从注射CNIR5后24小时的处死小鼠摘取到肿瘤和器 官的荧光图像，其与在体成像数据一致，表明切除的cmv-bla肿瘤的Cy5.5 发射较野生型C6肿瘤更高。为验证Bla在cmv-bla肿瘤中的表达，对从 注射CNIR5的小鼠切除的肿瘤进行CC1检验(图17D)；结果表明cmv-bla 肿瘤具有高水平的酶表达，而野生型肿瘤中几乎没有Bla活性。

为进一步证明观察到的反差是由肿瘤中表达的Bla活化CNIR5造成 的，制备去全乙酰化的D-葡糖胺的CNIR5的衍生物——CNIR6作为对照 (图18A)。CNIR6与CNIR5一样，在体外可以有效地被Bla水解，但 是是非细胞通透性的，因而CNIR6不能用于Bla的在体成像。图18B和 18C中，cmv-bla肿瘤与对照组肿瘤在整个成像期间没有任何显著的反差。 这明确表明CNIR5进入了靶细胞并被Bla活化。这一结果也证明了D- 葡糖胺基团在CNIR5对Bla在体成像中的重要性。

静脉接种后的小鼠体内的CNIR5的生物分布和药代动力学

经由静脉向Balb/c小鼠注射CNIR5。处死各组小鼠以进行器官的摘 取和处理。在CNIR5存在下随时间检测每个器官中的荧光强度。图19A 和19B分别是在注射后4小时和24小时的CNIR5信号。在所有组织中 观察到的稳定信号表明，在24小时期间CNIR5是全身性分布的并在这 时间内没有显著降解。

以Bla进行在体成像以定位小鼠体内的结核分枝杆菌感染

如实施例1所述，六组Balb/c小鼠(每组4只)分别被100-1000cfu/ 肺之间的喷雾感染。一组小鼠(每组4只)在所有时间点均进行成像， 在每个时间点处死另一组小鼠(每组4只)进行组织病理学以测定肺脏 和脾脏中的cfu。24小时、7天、14天、28天和72天时，在同样的ABSL3 房间中用Xenogen IVIS200影像工作站进行成像。对照组的4只动物未被 细菌感染，但注射了检测试剂，对其进行成像以控制未分解化合物的背 景荧光。在暗室中用异氟醚麻醉动物，在640nm激发下对动物成像，在 690nm采集图像。经由尾静脉注入5nmol的CNIR5，研究表明这个量对 IVI是足够的。在化合物注射前和注射后1小时、2小时、4小时后采集 图像。如果在上述任一时间点观察到信号，随后在24小时、48小时、72 小时对动物成像以跟踪信号衰减。

图20A是感染野生型结核分枝杆菌小鼠的在体成像图，图20B是对 照组小鼠的在体成像图。在成像之前，两种小鼠均静脉注射了CNIR5。 该图像显示，被感染的小鼠有来自肺脏的信号。对该信号的三维重建证 明，平均信号的位置在肺脏。由于信号平均分布并且小鼠有两个肺脏， 我们预期该位置为最大的点源。因此，化合物CNIR5可以用于测定结核 分枝杆菌在活体哺乳动物中的定位。采用Xenogen/Caliper IVIS Spectrum 成像系统捕获图像。

测定以Bla检测小鼠体内结核分枝杆菌的检测阈

β-内酰胺酶的CNIR探针通过小鼠的SREL成像能够实时检测100 个或更少的结核分枝杆菌(图21A)。对未受感染的活小鼠(图21B)进 行SREL成像，作为对照；对结核分枝杆菌感染的活体小鼠(图21C)进 行SREL成像。彩色直方柱是620nm激发后在680nm处的发射水平。 颜色表明结核分枝杆菌感染的肺脏有强烈的信号，这证明了对感染的特 异性定位。我们还测定了假单胞菌、葡萄球菌和军团菌的检测阈。

以Bla对豚鼠中的结核分枝杆菌感染进行在体成像

除以下几点不同外，采用前述小鼠感染和成像的相同方法对六组(每 组4只)豚鼠进行感染和成像。第一，由于我们预期豚鼠在稍晚的时间 点开始出现显著死亡，注射后检测时间点只达到28天。第二，豚鼠需要 小鼠所需检测试剂的20倍(对CNIR5而言约100nmol)以获取相同血 清浓度，且化合物经由外跖背静脉注射。在ABSL3装置中，喷雾感染豚 鼠，并且在成像前保持其受遏制。在注射后24小时、7天、14天、28天 和72天时，在ABSL3房间中用Xenogen IVIS200影像工作站进行成像。 对照组的4只动物未被细菌感染，但注射了检测试剂，对其进行成像来 抑制未分解化合物的背景荧光。

在成像之前，经由尾静脉注射100nmol的CNIR5，研究表明这个量 对IVI是足够的。在化合物注射前和注射后1小时、2小时、4小时采集 图像。如果在上述任一时间点观察到信号，随后的24小时、48小时、72 小时对动物进行成像以跟踪信号衰减。

实施例6

以CNIR7进行体内成像

CNIR7在小鼠组织中的生物分布

体内成像前对CNIR7在小鼠组织中的生物分布进行评价。向3只小 鼠静脉注射CNIR7(剂量为10nmol，溶于100μL生理盐水缓冲液中)。 在注射后的不同时间间隔(30分钟、240分钟、12小时、24小时、48小 时和72小时)，以颈椎脱臼法处死麻醉小鼠(每个时间点3只小鼠)。通 过心脏穿刺采集血样并迅速摘取组织(心脏、肾脏、肝脏、膀胱、胃、 大脑、胰腺、小肠、大肠、肺脏和脾脏)，以荧光计测量其近红外荧光。 数据用每克组织的荧光单位(FU)[FU/(g组织)]表示，这些数据表示上 述组织器官中酶解CNIR7产物的数量。

以小鼠模型体内的CNIR7进行体内成像

向裸鼠异种移植C6神经胶质瘤，用于CNIR7成像。以1L/min的低 速率，向100％氧气中加入2％异氟醚，使小鼠吸入麻醉。10nmol的CNIR7 溶于100μL的PBS缓冲液中，注射入小鼠尾静脉。以小动物体内荧光成 像系统——IVIS200光学CCD系统(Xenogen Inc)对三只小鼠成像。该 系统适用于生物发光和荧光的体内成像，并能够对小型啮齿类动物进行 快速扫描以获得单面投影，如短到1秒的荧光成像。可视化的全部软件 工具同样可用于该系统。对于以Cy5.5进行的NIRF成像，使用激发波长 为640±25nm和发射波长为695-770nm的滤光片组。使用对红光具有高 灵敏度并装有C-mount接口镜头的单色CCD相机采集荧光图像。处死小 鼠以进行生物分布研究。部分肿瘤组织样品用于Bla活性的评价。

实施例7

荧光蛋白

评价荧光蛋白用于IVI的前景

荧光蛋白(FP)mPlum具有最长的发射波长(649nm)以及很好的 Stokes位移(59nm)，这意味着它既能很好地穿透组织又具有较好的信 噪比。mPlum虽然不如EGFP明亮，但却具有相似的光稳定性，尽管它 在体外试验中表现不好，但是其波长和Stokes位移应该足够弥补IVI过 程中的这一差距。另一种具有较长发射波长(620nm)的FP是mKeima， 它比mPlum具有更好的Stokes位移——180nm，由于重叠，此位移上几 乎不必担心背景会出现在激发波长中。然而，mKeima与mPlum的亮度 相似，这使得哪种FP在IVI过程中的表现更好并不清楚。另一种具有较 长发射波长(610nm)的FP是mCherry，它比mKeima和mPlum亮4 倍。mCherry的Stokes位移只有23nm，所以尽管有更高的亮度，其信噪 比可能还是一个问题。FP tdTomato的发射波长最短(581nm)，但比 mKeima和mPlum亮20倍，是三者中最亮的。

以Gateway PCR克隆将mPlum、mKeima、mCherry和tdTomato四 种FP基因克隆到表达载体中。将上述各个构建载体转化到结核分枝杆菌 中，并以96孔板法对其进行体外评价。标准生长条件下，在培养基中以 胞内生长法对上述菌株进行评价。用分光光度计对所有构建的载体进行 评价，并以8孔腔室培养玻片对所有菌株进行显微镜观察。用分光光度 法对各个构建载体的最佳激发波长和最佳发射波长进行评价。将EGFP 作为较长波长发射时的阴性对照，将空载体作为评价细菌和巨噬细胞自 身的自体荧光效应的阴性对照。通过计算细菌种群中的荧光百分比，显 微镜观察可以评价信号强度的变化以及不同载体在培养基中生长的稳定 性。

FP的体外评价试验

以培养稳定性、转录与翻译的效率、检测的限制和异烟肼治疗期间/ 后的信号来评价FP构建载体。最初，每种FP构建载体至少选取两个转 化株用于评价，因为先前我们已经观察到个体FP转化株中信号强度和构 建载体稳定性的变异性。体内研究中对于每种FP则选取单个最优菌株。

观察各个菌株在选择压力存在或不存在下的生长情况，并检测生长 30天后仍发出荧光的细菌的百分比，以评价其在培养基中的稳定性。在 抗生素存在或不存在下，以平板稀释分离法评价培养基中携带从质粒获 得的选择性标记的细菌的百分比来确认上述结果。转录和翻译效率的研 究使我们能够了解，各个构建的载体中启动子的功能正常与否及密码子 的使用对翻译的影响是否达到了影响信号强度的程度。通过携带各种FP 构建载体的结核分枝杆菌的RT-PCR来比较利用不同的启动子及单拷贝 或多拷贝载体的叠加效应，使这种效应与表达其他报告基因的构建载体 相关，以评价上述结果。不论表达的报告基因如何，这些比率应该是可 比的。

以分光光度计和蛋白印迹分析分别对每个菌株的荧光强度和蛋白水 平进行检测和比较。不论表达的报告基因或RNA转录物的水平如何，蛋 白∶RNA∶荧光信号的比率应该是可比的。如果某些报告基因未被有效翻 译，其蛋白∶RNA转录物的比率可能会随着RNA表达水平的上升而下 降。上述观察是修正FP密码子的使用以提高翻译效率的需要。然而，这 也可能是蛋白不稳定或由于过表达而富集在包涵体中的结果。

通过评价平行制备的培养基的有限稀释的荧光来测定检测限。相对 于CFU，通过荧光显微镜定量确认所获得的与荧光直接相关的活菌数量， 以评价上述数据。向96孔板法中已经评价过CFU和荧光的培养基中加 入1μg/ml的异烟肼，以评价异烟肼(INH)治疗的效果。用分光光度计 在37℃的培养室内实时跟踪CFU和荧光，在加入INH后立即取样，滴 加到滴定板上以测定CFU，并在加入INH后至48小时的不同时间点重 复上述操作。这使我们能够了解各个构建载体经抗菌治疗后的信号强度、 稳定性和信号持续时间。

最优重组荧光蛋白的稳定性及其对毒力的影响

在毒力研究中，所有菌株均与野生型菌株进行平行比较。如实施例1 所述，以100-1000cfu/肺的喷雾感染20组Balb/c小鼠(每组4只)。在 各个时间点(1、14、28和72天)，每个细菌菌株(野生型、FP1、FP2、 FP3和FP4)解剖1组小鼠(每组4只)以测定CFU，对其进行组织病 理学检查，并检测肺脏和脾脏中相应构建载体的存在与否及其中的荧光 水平。对CFU滴度板上至少20个单菌落进行荧光显微镜观察以测定携 带构建载体的细菌数量的百分比。测量组织匀浆中的荧光水平以评价剩 余荧光蛋白的总水平。

喷雾感染的小鼠体内的荧光蛋白

将携带mPlum、mKeima、mCherry和tdTomato的构建载体以及仅携 带载体主干部分的各个细菌菌株以100-1000cfu/肺喷雾感染6组Balb/c 小鼠(每组4只，总计30组)。如实施例1所述，将细菌菌株解冻用于 喷雾感染。在各个时间点，对5组小鼠(每组4只，分别对应携带各个 FP的菌株和携带空载体的菌株)成像，并在每个时间点处死并解剖另外 五组小鼠(每组4只)进行组织病理学检查以测定肺脏和脾脏中的CFU。 在1天、14天、28天和72天时，在同一个ABSL3实验室中使用Xenogen  IVIS200影像工作站以各个FP的最佳激发波长和发射波长进行成像。当 FP要求在IVIS中使用不同的滤光片组时，各个动物群体中的载体也以同 样的滤光片组单独进行成像，以控制自体荧光。因此，每种用于IVI的 FP以及该系统的灵敏度都是有效的，这是因为在实验过程中细菌负荷会 随着在注射后时间从低(100cfu/肺)到高(＞10⁵cfu/肺)变化。空载体 对照组作为自体荧光以及由于FP存在而带来的毒力的潜在差异的对照。

实施例8

用于检测培养基中结核分枝杆菌的叩头虫红色荧光素酶(CBR)

利用已经引入的Gateway的重组位点将CBR基因克隆到所述的用于 Bla的所有四种构建载体中。上述载体均可以在L5和hsp60启动子调控 下表达。利用多功能酶标仪中的96孔板，在生长培养基中对各个菌株在 D-荧光素存在下发光的能力进行比较。该酶标仪具有发光检测能力，具 装有注射器，能够在加入D-荧光素酶时测量瞬间发射，也能够检测持续 的信号衰减的动力学。所有试验均以细菌的有限稀释进行4次，并测定 其CFU，发现活菌数目与其产生的信号相关。在无选择压力下生长7天， 随后对其进行分光光度计检查和荧光显微镜观察以评价构建载体的稳定 性。将上述数据与CFU关联以测定信号/活菌，而显微镜观察被用来计算 产生阳性信号的细菌的百分比。上述试验中，通过比较携带这些构建的 载体的菌株与携带空载体的菌株的生长曲线来评价载体对细菌活性的影 响。

评价小鼠体内CBR的表达、稳定性和毒力

对于有望用于IVI的两个菌株，检测重组CBR的稳定性及其对毒力 的影响。在毒力研究中，所有菌株均与野生型菌株进行平行比较。如实 施例1所述，以100-1000cfu/肺喷雾感染12组Balb/c小鼠(每组4只)。

在各个时间点(1天、14天、28天和72天)，每个菌株(野生型、 CBR1和CBR2)解剖1组小鼠(每组4只)以测定CFU，进行组织病理 学检查，检测肺脏和脾脏中相应构建载体的出现及发光水平。对CFU滴 定板上至少20个单菌落进行荧光显微镜观察以测定携带构建载体的细菌 数量的百分比。测量组织匀浆的发光水平以评价剩余CBR的总水平。

对小鼠体内表达CBR的结核分枝杆菌和BCG菌株成像

如实施例1所述，将携带RLuc8和仅携带载体主干部分的细菌菌株 以100-1000cfu/肺分别喷雾感染6组小鼠(每组4只，总计12组)。在 各个时间点，对2组小鼠(每组4只，分别对应携带RLuc8的菌株和仅 携带载体主干部分的菌株)成像，并在每个时间点，处死另外两组小鼠 并解剖以测定肺脏和脾脏中的CFU。在24小时、7天、14天、28天和 72天，在同一个ABSL3实验室中使用Xenogen IVIS 200影像工作站进行 成像。在成像前，由尾静脉向小鼠注射1-5μmol的D-荧光素酶，已经证 明该剂量对于IVI是足够的。

在注射化合物前及注射后1小时、2小时和4小时采集图像。如果在 上述任一时间点观察到信号，随后就在24小时、48小时和72小时对 这些动物成像以跟踪信号的衰减。在暗室中，使用Matrix系统(Xenogen) 以100％氧气中含有2％异氟醚麻醉动物，并以3至5分钟的积分时间和 10像素合并进行成像。这可以验证CBR对于IVI的用途，也验证了该系 统的灵敏度，这是因为在实验过程中细菌负荷会随着注射后时间从低 (100cfu/肺)到高(＞10⁵cfu/肺)变化。空载体对照组作为自体荧光以 及由于FP存在而带来的毒力的潜在差异的对照。

实施例9

评价其他荧光素酶系统用于IVI的前景

利用Gateway PCR克隆将RLuc8荧光素酶基因克隆到所述的分枝杆 菌表达系统中。将构建载体转化到Mtb中，以全细胞检测其在细菌培养 基中的发光。完整的细菌应产生与CBR可比的光，从而胞内细菌体系能 够与小鼠体内的CBR相比较。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的荧光素酶 系统均具有产生自身底物的优势。利用酶切将操纵子从当前载体中移出， 再与Gateway接头连接，进行Gateway重组克隆，将其克隆到表达系统 中。检测用于细菌培养基中Mtb发光的构建载体。除将在分光光度计上 以发光设定测定发光外，其余所有对生物发光的分析均在所述的用于Bla 系统的96孔板中进行。通过对所有样品平行进行有限稀释和CFU测定 来评价其灵敏度，因此相对于CFU，发光是能够计算的。

以荧光素酶检测巨噬细胞中的结核分枝杆菌

在巨噬细胞中检测分泌和定位到细胞膜上对荧光素酶活性的影响。 通过向其加入Mtb BlaC(BlaSS)来源的氨基端TAT信号序列，并将该融合 蛋白基因置于Mtb中优化表达CBR的构建载体上，实现其从分枝杆菌中 向外分泌。通过分析对数早期的携带CBR、BlaSS::CBR和空载体的Mtb 菌株的培养滤液和全细胞来验证其分泌。BlaSS::CBR菌株的培养滤液应 较CBR表达菌株有更强的发光，且其全细胞应具有与CBR表达菌株同 等的或较弱的发光。将用于Bla的CD14来源的羧基端GPI锚定蛋白加 入BlaSS::CBR上以产生融合蛋白BlaSS::CBR::GPI。

利用胞内巨噬细胞分析对表达BlaSS::CBR::GPI的Mtb的发光进行评 价，将其与表达CBR和BlaSS::RLuc8的菌株进行比较。将J774A.1小鼠 巨噬细胞置于96孔板中，以检测细菌的滴度及化合物的不同浓度。如对 Bla所述，所有分析均以同样方法进行四次。以0.1％的Triton X-100裂解 复孔中的细胞，再加入D-荧光素以评价宿主细胞通透性在已获得的测量 中的作用。在各个时间点，将4个未处理孔用于检测与细胞相关的CFU 数值。真核细胞的通透性和分枝杆菌的D-荧光素囊泡均对CBR的胞内测 量有影响，因此对巨噬细胞中细菌测量的灵敏度的评价非常重要。然而， 细菌荧光素系统可能不会受到胞内细菌生长的很大影响。

利用胞内分析对各个细菌荧光素系统和RLuc8的发光进行确认。以 0.1％的Triton X-100裂解复孔中的细胞，再加入腔肠素以评价宿主细胞通 透性在已获得的RLuc8的测量中的作用。通过那些已证明是最有效的构 建载体来确认信号的定位。使用八孔腔室培养玻片，以相似方法进行上 述分析。显微镜观察观察可以定位、测定发出阳性信号的细菌百分比并 测定已定位信号的强度。

实施例10

以用于IVI的化合物检测Bgal

通过酶切并使其与Gateway接头相连接，将前述(17)无启动子的 Bgal基因克隆到分枝杆菌表达载体上。如前所述，将该载体转化到Mtb 中，利用分枝杆菌通透性的荧光试剂5-乙酰氨基-荧光素二-β-D-吡喃半 乳糖苷(C2FDG)在96孔板(18)中对细菌培养基中的载体进行评价。 该化合物在Bgal分解后才能发出荧光，激发波长为460nm，发射波长为 520nm。用产生最强荧光信号的载体构建另一个能够实现Bgal分泌和宿 主细胞定位的融合蛋白。

要测定分枝杆菌通透性对不同化合物检测Bgal的能力是否起作用， Bgal的分泌十分重要。为使Bgal能够分泌，向其加入Mtb BlaC(BlaSS) 来源的氨基端TAT信号序列，并将该融合蛋白基因转化到Mtb优化表达 Bgal的构建载体中。通过对对数早期携带Bgal、BlaSS::Bgal和空载体的 Mtb表达菌株的培养滤液和全细胞进行分析以确认其分泌。向BlaSS::Bgal 加入用于Bla的CD14来源的羧基端GPI锚定蛋白以产生融合蛋白 BlaSS::Bgal::GPI。

以C2FDG、5-十二烷基氨试卤灵二-β-D-吡喃半乳糖苷(C12RG) 和9氢-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7基)β-D-吡喃半乳糖苷 (DDAOG)评价所有Bgal构建载体用于荧光检测的灵敏度。所有化合 物均购自Invitrogen的子公司——Molecular Probes。因为已知C2FDG能 够进入Mtb并有效检测其中的Bgal，所以尽管其发射波长用于IVI没有 优势，但是该化合物仍然为我们提供了阳性对照。C12RG能够进入真核 细胞，并具有较长的发射波长(590nm)，但其类似的化合物C12FDG不 能检测Mtb中的Bgal，这说明该化合物不能穿透细菌细胞膜。

为了确认通透性和定位对发出信号的影响，在完整细胞和全细胞裂 解液中检测所有菌株和化合物的Bgal活性。结果表明，化合物DDAOG 对于IVI是有效的，因为它能够穿透真核细胞膜，被Bgal分解后具有较 长的发射波长(660nm)。应考虑到，DDAOG将是进一步实验的最优化 合物，它应该能够很好地检测Bgal活性。

小鼠体内Bgal的表达、稳定性及毒力

对于有望用于IVI的两株菌株，检测重组Bgal的稳定性及其对毒力 的影响。在毒力实验中，所有菌株均与野生型菌株作平行比较。如实施 例1所述，以100-100cfu/肺对12组Balb/c小鼠(每组4只)进行喷雾 感染。在各个时间点(1天、14天、28天和72天)，每种菌株(野生型、 Bgal1和Bgal2)选取1组小鼠(每组4只)进行解剖，进行组织病理学 检查，并以C2FDG检测肺脏和脾脏中相应构建载体的出现及其中的 CFU。以C2FDG对CFU滴定板上至少20个单菌落进行Bgal分析，以 检测携带构建载体的细菌数量的百分比。在组织匀浆中测定Bgal水平以 评价在每个时间点剩余Bgal的总水平。

对小鼠体内的表达Bgal的结核分枝杆菌成像

由于所有L2G85小鼠来源的细胞能够在ACTB启动子调控下表达 Fluc，所以用表达Bgal的Mtb菌株感染L2G85骨髓来源的巨噬细胞，并 与携带空载体的相同菌株相比较。如在J774A.1小鼠巨噬细胞中进行的其 他胞内生长试验一样，以L2G85小鼠骨髓来源的巨噬细胞进行巨噬细胞 感染。以加入0.1％的Triton X-100裂解复孔中的细胞，再加入Lugal以 评价宿主细胞通透性在已获得的测量中的作用。在各个时间点，将4个 未处理孔用于测定与细胞相关的CFU数值。通过已证实的最有效构建载 体的显微镜观察来确认信号的定位。使用八孔腔室培养玻片，以相似方 法进行上述分析。显微镜观察可以定位、测定发出阳性信号的细菌百分 比并测定已定位信号的强度。除以Lugal替代荧光素外，以如对CBR所 述的操作流程在小鼠体内进行IVI研究。

实施例11

基于β-内酰胺酶和其他蛋白晶体结构的探针设计

BlaC催化口袋的模拟

用小分子模拟结核分枝杆菌β-内酰胺酶(BlaC)的催化口袋，以改 善探针的设计及其特异性。小分子的高通量筛选(如小分子文库)用于 识别结合BlaC的活性中心狭缝的化合物及从中获得的晶体结构。体外合 成并测试候选探针。

β-内酰胺酶类酶和青霉素结合蛋白

对结核分枝杆菌中两种主要的β-内酰胺酶类蛋白(BlaX)和两种主 要的青霉素结合蛋白(PBP)进行克隆、过表达和提纯。以头孢哌酮、青 霉素和环丙沙星测定BlaX和PBP的K_m与结合常数。阐明候选蛋白的晶 体结构并以其设计具有改善的探针活性的特异性探针。

Mtb酶与TEM-1型大肠杆菌β-内酰胺酶之间的构效关系

阐明BlaC及TEM-1和头孢哌酮共结晶的晶体结构。模拟、设计并 合成基于头孢哌酮的探针。候选探针用于测定BlaC和TEM-1的K_m。

实施例12

以新型猝灭剂和染料提高REF的灵敏度

REF成像中使用的最初底物能够用于对小鼠肺部结核分枝杆菌感染 的成像，这表明这种策略有很大潜力。然而，由于其在肺脏的检测阈大 于10000个细菌，所以通过提高REF探针的灵敏度来改进检测是有帮助 的。近来，LiCor开发出了在800nm范围内作用的新型染料和猝灭剂， 这给了我们改进化合物的希望。这种被称为IRDye 800CW的新型染料较 Cy5.5亮近10倍，且由于其较长的发射波长较Cy5.5能够更好地穿透哺 乳动物组织。基于该染料及其匹配的被称为QC-1的猝灭剂设计化合物。 基于该染料及其猝灭剂的一种化合物能够显著改进当前的REF系统。此 外，我们研究了两种IRDye800染料——IRDye800RS和IRDye800CW(图 22)作为FRET供体应用于体内成像的可能性。二者荧光光谱相同，激 发波长为780nm，发射波长为820nm，但IRDye800CW较IRDye800RS 含有更多的磺酸基团。这种差异可能导致它们的体内分布差异，这样我 们就研究了上述两种差异。IRDye800相应的具有高猝灭效率的染料—— IRDye QC-1，在荧光探针中被用作FRET受体(图22)。如前所述，如同 在NHS酯和胺基之间以偶联化学制备CNIR5，将上述分子掺入探针。首 先，以TEM-1的Bla和Mtb的BlaC对由IRDye800染料组成的CNIR探 针的水解速率进行表征，并评价其应用于对皮下和肺部感染的Mtb体内 成像的可能性。

首先对基于IRDye 800CW的化合物进行体外检测，随后进行胞内研 究和动物模型研究以验证其在皮下和肺部感染中的有效性。以IVIS成像 系统在整个动物水平上观察感染部位的荧光掺入，并以荧光计检测组织 匀浆确认上述结果，同时利用组织切片、荧光共聚焦显微镜和活体显微 镜观察感染组织在细胞层面确认上述结果。将上述技术组合应用于所有 探针，在感染的小鼠模型中对探针进行检测以详细对感染组织的标记特 征及探针在感染的宿主细胞中的掺入进行表征。

以对探针的结构修饰提高SREL和REF的灵敏度

目前的探针能够检测并对Mtb的Blac活性成像，但其对Mtb的BlaC 的活性并不是最理想的。具有对Mtb的BlaC改善的酶动力学的探针能够 为检测和成像提供更高的灵敏度。Mtb的BlaC的晶体结构与其他家族的 β-内酰胺酶相比有一个主要差异，即Mtb的BlaC具有较大的活性中心 口袋。这种结构差异表明了为Mtb的BlaC设计具有改善的动力学的探针 的可能性。通过对化合物的有限文库及离去基团修饰的筛选，我们采取 了三种主要的方法修饰基于头孢哌酮的BlaC探针以改进其结构。通过 Mtb的体外分析、胞内细菌法及经皮下与肺部途径的小鼠体内感染，我 们对适合的化合物进行了进一步的表征。

基于头孢哌酮结构的理性方法。

TEM-1的Bla和Mtb的BlaC分解CINR5的动力学分析：

对于TEM-1的Bla，k_cat＝0.33s^-1，K_m＝1.9μM，k_cat/K_m＝1.74×10⁵s^-1M^-1；

对于Mtb的BlaC，k_cat＝0.07s^-1，K_m＝5.9μM，k_cat/K_m＝1.2×10⁴s^-1M^-1。

动力学数据表明CNIR5是TEM-1的Bla的优选底物，但不是Mtb 的BlaC的优选底物。为了鉴定Mtb的BlaC特异活性所需的结构元件， 以TEM-1的Bla和Mtb的BlaC测定了许多内酰胺类抗生素头孢霉素(头 孢哌酮、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢他啶、头孢西丁、头孢孟多、头孢 噻肟和头孢氨苄)的动力学。结果显示(图23)，与TEM-1的Bla相比， 头孢哌酮是Mtb的BlaC的优选底物。

对于TEM-1的Bla，k_cat＝0.26s^-1，K_m＝262μM，k_cat/K_m＝1×10³s^-1M^-1；

对于Mtb的BlaC，k_cat＝2.01s^-1，K_m＝76μM，k_cat/K_m＝2.6×10⁴s^-1M^-1。

Mtb的BlaC的K_cat/K_m值(2.6×10⁴s^-1M^-1)好于CNIR5(1.2×10⁴s^-1M^-1)，但TEM-1的Bla的K_cat/K_m值(1×10³s^-1M^-1)较CNIR5(1.74×10⁵s^-1M^-1)小100倍。我们假设与这种选择性相关的主要结构基团是头孢哌 酮7位胺基上连接的庞大基团，Mtb的BlaC的X射线结构的发现似乎支 持这种假设——BlaC在7位具有较大的底物结合口袋。

因此，将头孢哌酮7位的基团掺入CNIR5，产生的Mtb的BlaC探针 应该表现出改善的酶动力学(图23)。首先在体外检测该探针：1)在缓 冲液和小鼠血清中的稳定性，2)在纯化的Mtb存在下及在Mtb胞内的动 力学，3)在纯化的TEM-1的Bla存在下的动力学。将其细胞膜通透性与 CNIR5相比较以评价其是否表现出可比的或改善的细胞膜运输，以及是 否保留我们以前使用探针的特性。然后通过皮下和喷雾感染进行动物研 究，随后以Mtb进行成像。

为了更好地理解头孢哌酮CNIR探针的构效关系(SAR)，对其与BlaC 的结合进行计算机模拟。平行地，将探针与BlaC共结晶以解析复杂结构。 获得的结构信息用于改善探针的理性设计。

快速的有限结构文库分析验证具有改善灵敏度的探针

在合成并测试头孢哌酮CNIR探针后，以X射线结构研究明确了 SAR，同时我们试图用文库方法提高其选择性。

由于制备Bluco较CNIR探针更容易，因此利用基于Bluco的底物为 酶动力学提供简单快速的判读。以Bluco作为模板构建头孢哌酮衍生物 的小型偏倚文库。为建立该文库并产生多样性，利用所有商品化的8代 哌嗪2，3-二酮(A)和6代苯甘氨酰甲酯(B)。共获得48种化合物。

文库中的化合物再与Bluco前体(C)反应最终生成48种Bluco的 衍生物。通过D-荧光素的羟基基团固相制备文库。在制备文库中所有这 些化合物之前，基于BlaC的X射线结构对每个化合物进行计算机模拟研 究以确认所有化合物均能与BlaC的活性中心口袋结合。

利用化学发光酶标仪通过高通量筛选方法对文库进行筛选。在进行 动力学筛选前，首先对化合物在缓冲液中的稳定性进行筛选。与原始 Bluco底物的发光水平进行比较以评价其动力学，并以荧光素作为共孵育 早期的阳性对照。具有有利动力学的化合物会快速分解并释放出荧光素， 在几分钟内产生较高的发光水平；而原始Bluco分子共孵育几个小时后 才能表现出最大发光水平。上述研究给出的新型化合物可以作为对BlaC 具有改进动力学并对光学成像有更好灵敏度的CNIR和Bluco底物的基 础。

修饰离去基团以改善动力学

3’位的烯丙基

先前已经证明，在酚醚中插入双键能够增加苯酚基团的释放动力学 [JACS，2003，125，11146-11147]。例如，苯酚离去基团的k_cat可以增加5 倍，达到54s^-1。据此，我们向CNIR探针插入了双键。例如，对于图22 所示的结构，插入双键后的结构如图25所示。虽然在前面的实施例中双 键为顺式构型，但是我们希望此处的构型由于较大的烯丙基基团而变为 反式构型。相似地，向Bluco中插入双键得到Bluco2，我们期望其较Bluco 有更好的动力学(图24)。

3’位的氨基甲酸酯

3’位的另一种键使水解后断裂更快，因而灵敏度更高。该设计利用了 氨基甲酸酯键和D-荧光素的氨基衍生物——氨基D-荧光素。作为优良的 离去基团，氨基甲酸酯键被广泛用于前药设计。Bla分解释放氨基甲酸酯， 随后氨基甲酸酯分解为二氧化碳和游离的荧光素酶底物——氨基D-荧 光素(图26)。

通过评价组织分布提高SREL和REF的灵敏度

利用CNIR底物的荧光测定其浓度以进行组织分布研究。由于分解 增强了荧光，所以在BlaC存在下孵育并测量其荧光以检测未分解底物的 分布，而分解底物浓度则通过直接荧光评价检测。尽管该方法接近组织 中底物的浓度，但由于组织样品的自体荧光、潜在抑制剂的存在及底物 的自然分解均对数据有影响，所以这并不是确定的。通过放射性标记探 针的检测获得更详细的组织分布数据。将CNIR5以放射性碘同位素(如 I125)标记，这样我们才能够容易地跟踪这些探针在体内的分布。根据标 记蛋白中酪氨酸的操作流程对CNIR5的芳香基团进行类似的碘化。将标 记的探针注射入小鼠体内，并进行动态SPECT成像。在不同的时间间隔， 处死小鼠以摘取器官对其放射性强度进行计数。平行地，以高效液相直 接评价解剖后获得的探针的可溶性碎片。利用低温探针和可溶部分，通 过高效液相对组织匀浆(全部及可溶部分)进行荧光评价，随后通过闪 烁计数器检测高温探针的碎片。当开发出新型Mtb特异性探针并验证其 有望用于改善组织分布时，对其进行同样的实验。

通过利用β-半乳糖苷酶提高SREL和REF的灵敏度

由于具有更好的酶动力学或底物，不同的SREL/SEF酶系统很可能 对于检测BlaC各有明显优势，因此将β-半乳糖苷酶(lacZ)与荧光底物 (DDAOG)或发光底物(Lugal)相结合用于Mtb的SREL/REF。DDAOG 和Lugal均能够用于体外成像，且Lugal还能够用于小鼠皮下感染成像。 尽管DDAOG在体外成像中结果较好，但我们还没有在体内成像中对其 进行评价。DDAOG在体内成像中是否与Lugal同样灵敏对我们而言很重 要，因为荧光底物比需要同时传送荧光素酶的发光底物具有更大的优势。 该系统与Bluco有相似的问题。DDAOG或基于DDAOG的改进型化合物 可能是最灵敏的系统之一，且有很多显色报告基因系统已经被许多研究 者所使用，这使得该系统在结核病群体中具有更直接的价值，我们应该 成功将其用于对活体动物体内结核分枝杆菌感染的成像。

实施例13

利用大环内酰胺提高SREL和REF的探针特异性

将开发较高灵敏度探针的相似策略用来开发对Mtb的BlaC具有选择 性，而不识别其他菌种中存在的β-内酰胺酶的探针。β-内酰胺酶中研究 最清楚的是大肠杆菌的TEM-1，它可以用于许多动力学分析，已经是真 核表达系统中有价值的报告基因。用于比较提高灵敏度方法的主要区别 是，其最关注的是化合物对于Mtb的BlaC和大肠杆菌的TEM-1的动力 学有最大差别。尽管大部分β-内酰胺显示出较好的TEM-1酶动力学，但 已经鉴定出三种β-内酰胺，它们显示出了比TEM-1动力学更好的Mtb 的BlaC动力学。它们是头孢哌酮、头孢噻肟和头孢噻吩。这些化合物的 动力学具有显著差异，但头孢哌酮显示出比TEM-1酶动力学快10-100 倍的Mtb酶动力学，这表明它是开发特异于这种酶的探针的优良候选化 合物。以头孢哌酮为基础制备CNIR化合物，以纯化的BlaC和TEM-1 在96孔板中对其荧光读数，测定其酶动力学参数，以检测其特异性。

利用有限结构文库提高SREL和REF探针的特异性

将实施例12中开发的化合物文库用于提高SREL和REF探针的特异 性，但使用的改进的高通量筛选将关注特异性而不是酶动力学。如上所 述，各个化合物基本上都是作为基于Bluco的底物来合成的，并在纯化 的BlaC和TEM-1的存在下通过高通量发光分析对化合物进行评价。以 BlaC对所有化合物进行筛选以鉴定特异性提高的化合物，以TEM-1型 Bla鉴定那些其他酶的较差的底物。此外，在37℃水中对所有化合物的 稳定性进行提前筛选，以确保只有稳定的化合物才会进入下一步试验。 平行进行试验，并且所有结果以BlaC对TEM-1发光的比率表示。开始 时，我们设定的检测阈是该分子反应30分钟后显示出10倍以上更快的 BlaC酶动力学。将各个化合物对BlaC和TEM-1的晶体结构计算机模拟， 以建立稳定的构效关系(SAR)。通过比较基于CNIR和Bluco的头孢哌 酮探针的活性，我们首先确认能够上述发现用于适于REF的CNIR底物。 根据现有数据，已经鉴定出具有较好特异性的、能够进一步开发成为在 REF探针的内酰胺，并在Mtb在巨噬细胞内生长时以及皮下接种和喷雾 接种后小鼠的感染期间，对其体外检测Mtb的能力进行评价。

实施例14

评价用于活鼠成像的CBR

我们的初始研究已经发现，叩头虫红色荧光素酶(CBR)用作体外 和组织培养细胞中Mtb的报告基因是非常好的。我们发现CBR可以与萤 火虫萤光素酶(FFlux)在产生信号和体外检测阈方面是可比的。然而， 在对小鼠进行皮下感染和肺脏感染期间，CBR的检测阈明显好于FFlux。 这种初步观察可能是由于接种物的差异、体内细菌代谢的影响或发光动 力学造成的。对各个参数进行检测，仔细分析CBR作为检测肺脏感染和 皮下感染期间Mtb活性的报告基因的功用。通过对同一动物不同部位皮 下接种结合对生物发光信号的光谱分解，对CBR的发光动力学进行评价， 并直接与FFlux比较，以证明CBR报告基因是可靠的。以可比数量的杆 菌平行感染成对的小鼠来独立评价肺脏感染。通过体外检测低氧条件对 信号强度的影响，了解缺氧性病变中CBR的潜在灵敏度。体内检测可能 遇到的其他压力，如低pH、ROS和RNS的存在。

分析用于疗效评价CBR成像

因为CBR荧光信号依赖ATP的存在，所以这一成像系统为快速评价 治疗对细菌活性的影响提供了独特的机会。该系统相关的一些主要问题 是，如何快速获取信号中可测量的差异，以及如何准确使用它来检测 MIC。以异烟肼和利福平利用上述方法测定对Mtb的MIC。将试验所测 定的MIC与基于OD和CFU分析得到的结果进行比较。以完整Mtb分 析和巨噬细胞胞内分析在0.5×、1×和5×的抗生素MIC的存在下评 价信号衰减的动力学。一旦在体外测定其动力学，并以CFU比较活性的 不同，就可以对治疗后细菌的生长能力及CFU与发光间是否存在较好的 相关关系进行评价。一旦测定了体外生长的细菌CFU与发光间的相关关 系，就可以检测小鼠体内皮下感染和肺部感染期间治疗对发光影响的动 力学。采用两种接种途径是因为我们预期细菌在肺脏和皮下环境中可及 性存在差异，这使信号衰减的动力学也可能是不同的。上述研究使我们 了解了将CBR应用于小鼠治疗的快速评价的功用。上述试验关注了感染 的急性期以快速获得结果，但后续试验将需要在小鼠感染的慢性期进行， 以评价该系统在细菌不能快速复制时是否能够用于评价治疗。

开发双重CBR-REF光学成像系统

CBR系统由于能够快速判读细菌活性而具有优势，但在某些情况下 这种系统并不是最理想的。在细菌代谢速率不足以产生最大发光的情况 下，基于荧光素酶的系统不能像在最佳代谢条件下那样灵敏。利用CBR 评价治疗的影响，并对不同组织中的杆菌进行定量，以REF测定其细胞 定位。为获得上述两种系统对于评价不同环境中细菌数量的潜在应用价 值，小鼠肺部皮下感染后测定CBR和REF的信号衰减的动力学。在传送 抗生素后荧光立即下降，而REF信号需要长达24小时才能观察到信号的 衰减。CBR和REF对代谢活性灵敏度的不同提供了实时监测与代谢状态 相关的细菌数量的潜在应用价值。这是一个亟需开发的重要系统，因为 哺乳动物Mtb感染期间所有细菌的代谢状态仍然是不清晰的。这一成像 系统首次提供了通过实时信号的存在与否来间接观察活体动物中向不同 环境运动的途径。这种能力可能对评评治疗尤其重要，因为在某些环境 中治疗可以杀菌而在其他环境中则不能，这是继续临床前研究的重要考 虑因素。

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