对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质和免疫球蛋白结合性亲和配体

摘要

本发明解决的课题是：创造出比现有的修饰型蛋白A配体具有更好的抗体酸解离特性的新型修饰蛋白A配体，而且创造出具有高的耐碱性的新型修饰蛋白A配体。本发明提供对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其具有源自蛋白A的E、D、A、B和C结构域中的任意结构域的氨基酸序列中的1个以上的Gly被Ala以外的氨基酸取代而得到的氨基酸序列，并且，与具有将所述Gly取代为Ala而得到的氨基酸序列的蛋白质相比，其对免疫球蛋白的Fab区域的亲和性低。而且，本发明提供对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其与对应的结构域相比，在碱性条件下的化学稳定性提高。

说明书

技术领域

本发明涉及与抗体特异性结合的蛋白质，和以该蛋白质作为免疫球蛋白 结合性亲和配体的亲和分离基质，和使用该基质分离纯化或吸附去除抗体的 方法。

技术背景

抗体具有与被称为抗原的物质特异性结合的功能，以及与其他的生物体 分子或细胞协同，将具有抗原的因子无毒化、去除的功能。所谓抗体的名称， 是重视此类与抗原结合的功能的名字，作为物质则可称为“免疫球蛋白”。

近年来，伴随着基因工程学、蛋白质工程学和细胞工程学的发展，利用 具有抗体功能的医药制品——被称为抗体药物——的开发日渐盛行。与传统 药物相比，由于抗体药物针对目标分子特异性的作用，因此预期使得副作用 减轻，且获得更高的治疗效果，实际上有助于改善各种病况。

一方面，由于抗体药物是向生物体大量施用的，相比与其他的重组蛋白 质医药制品的情况下，可认为其纯度对质量产生极大的影响。因此，为了生 产高纯度的抗体，利用特异性结合抗体的分子作为配体的吸附材料，一般使 用亲和层析等手段。

抗体医药制品的开发，基本上是单克隆IgG抗体，利用重组培养细胞技 术等进行大量生产，利用对IgG抗体具有亲和性的蛋白质进行纯化。作为对 IgG抗体具有亲和性的免疫球蛋白结合性蛋白质，蛋白A是已经公知的。蛋 白A是由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生的一 种细胞壁蛋白质，由信号序列S、5个免疫球蛋白结合性结构域(E结构域、 D结构域、A结构域、B结构域、C结构域)以及作为细胞壁结合结构域的 XM区域组成(非专利文献1)。在抗体医药制品生产工艺的初期纯化工艺(捕 获工艺)中，蛋白A作为配体固定在水不溶性载体上的亲和层析柱(下文中 为蛋白A柱)是通常使用的(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3)。

为了改善蛋白A柱的功能，正进行各种技术的开发。配体方面的技术开 发也不断进步。最开始利用天然类型的蛋白A作为配体，随之加入了蛋白质 工程上的修饰而重组的蛋白A作为配体改善柱的功能的技术变得日渐多见。

代表性的重组蛋白A可以列举去除了没有免疫球蛋白结合活性的XM区 域的重组蛋白A(rProteinA Sepharose(商标)，GE HealthCare日本株式会社 生产)。以去除了XM区域的重组蛋白A作为配体的柱子，具有比传统产品 降低的非特异性吸附的优点，目前在产业上也广泛应用。

此外，有发明利用向蛋白A中突变导入1个Cys的重组蛋白A(专利文 献1)，以及突变导入了多个Lys的重组蛋白A(专利文献2)作为配体。导 入这类突变所获得的蛋白A在固定化于水不溶性载体方面表现出效果，具有 抗体对柱的结合容量和减少固定化配体的泄露的优点。

作为加入了修饰的重组蛋白A，将向B结构域中导入了突变的修饰结构 域(称为Z结构域)利用于配体的技术是广泛已知的(专利文献3、非专利 文献1、非专利文献4)。相对于B结构域，Z结构域是导入了这样的突变的 修饰结构域，其中29位Gly被Ala取代。需要说明的是，在Z结构域中同 时导入用Val取代B结构域1位的Ala的突变，这是为了基因工程上以简化 制备连接多个结构域的编码基因为目的的突变，对结构域的功能不产生影响 (例如，在专利文献4中，有使用突变体的实施例，其中Z结构域1位的 Val被Ala取代)。

已知Z结构域比B结构域的耐碱性更高，具有通过碱洗涤可反复使用的 优点。以Z结构域为基础，通过将Asn取代为其他的氨基酸，发明出赋予了 更加耐碱性的配体(专利文献5、专利文献6)，并还开始了产业应用。

Z结构域的另一个特征可例举为，与免疫球蛋白的Fab区域的结合力变 弱(非专利文献5)。由于该特征，在将结合了的抗体用酸解离的工艺中，具 有易于解离抗体的优点(非专利文献1、专利文献7)。

除源自B结构域的Z结构域之外，作为高耐碱性的修饰蛋白A配体，也 在不断进行以蛋白A的C结构域为基础的研究(专利文献4)。这类配体以 发挥野生型C结构域本来具有的高耐碱性为特征，作为替代Z结构域的新的 基础结构域而受到瞩目。然而，我们根据关于C结构域的验证结果，明确了 在用酸解离与C结构域结合了的抗体的工艺中，存在抗体难以解离的缺点。 在非专利文献2或专利文献4中，C结构域表现出与免疫球蛋白的Fab区域 强的结合力，推测该特征可能是难以用酸解离抗体的原因。为了改善这一缺 点，使用导入了以Ala取代29位的Gly的突变的C结构域，检验抗体的酸 解离特性，虽然观察到了相比野生型C结构域的改善，但仍然是不充分的。 根据蛋白质水平上的分子间相互作用解析的结果可知，就导入了用Ala取代 29位的Gly的突变的C结构域而言，与免疫球蛋白的Fab区域的结合力降 低不充分是其的原因。

如上所述，对于蛋白A的免疫球蛋白结合性结构域(E、D、A、B和C 结构域)而言，导入用Ala取代29位的Gly的突变的有效性是已经公知的。 实际上，自从1987年该“G29A”突变公开以来，即使在涉及之后开发的修 饰蛋白A的现有技术中，也导入了该“G29A”的突变(专利文献2、专利 文献4、专利文献6)。

但是，在蛋白A的免疫球蛋白结合性结构域的29位上已知的突变，仅 仅是将29位的Gly取代为Ala的“G29A”，尚无对该位置导入Ala以外的 氨基酸残基的突变的教导。G29A是基于考虑到应该使得立体结构上变化最 小，仅次于Gly的侧链小的Ala最适合而导入的突变，迄今为止，尚未考虑 过用具有更大侧链的氨基酸进行取代(非专利文献4)。因此，立体结构上的 变化变大，可能会破坏原来的功能(与免疫球蛋白的结合能力等)，将29位 的Gly取代为比Ala侧链更大的氨基酸的突变，是否能表现出比Ala取代的 突变更优秀的效果是不清楚的。尽管在1987年就公开了将29位的Gly取代 为Ala的突变(非专利文献4)，迄今为止也没有导入用Ala以外的氨基酸取 代的突变。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第6399750号公报

专利文献2：特开2007-252368号公报

专利文献3：美国专利第5143844号公报

专利文献4：特开2006-304633号公报

专利文献5：欧洲专利第1123389号公报

专利文献6：国际公开第WO03/080655号公报

专利文献7：美国公开第2006/0194950号公报

非专利文献

非专利文献1：Hober S.等著，J.Chromatogr：B，2007年，848卷。40-47 页

非专利文献2：Low D.等著，J Chromatogr：B，2007年，848卷，48-63 页

非专利文献3：Roque A.C.A.等著，J.Chromatogr.A，2007年，1160卷， 44-55页

非专利文献4：Nilsson B.等著，Protein Engineering，1987年，1卷，107-113 页

非专利文献5：Jansson B.等著，FEMS Immunology and Medical  Microbiology，1998年，20卷，69-78页

发明概述

发明解决的技术问题

本发明要解决的课题是开发这样的的修饰技术，所述技术创造出具有比 现有的修饰型蛋白A配体更好的抗体酸解离特性的新型修饰蛋白A配体。 此外，还以创造出具有高的耐碱性的新型修饰蛋白A配体作为课题。

为了解决课题的手段

本发明人为了解决上述课题，分子设计了多个重组的蛋白A变体，利用 蛋白质工程的手段和基因工程的手段，从转化体获得了所述变体，通过比较 研究所获得的上述变体的性质，完成本发明。

换言之，本发明涉及对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其具有的氨基 酸序列是在源自序列号1-5记载的蛋白A的E、D、A、B或C结构域中的 任意结构域的氨基酸序列中，1个以上的Gly被Ala以外的氨基酸取代的序 列，并且，其特征是与具有所述Gly被Ala取代了的氨基酸序列的蛋白质相 比，该蛋白质对免疫球蛋白Fab区域的亲和性降低。

上述Gly优选是与保存在蛋白A的E、D、A、B或C结构域中的C结 构域的29位相对应的Gly。

上述与C结构域的29位相对应的Gly优选是E结构域的27位的Gly、 D结构域的32位的Gly、A结构域的29位的Gly、B结构域的29位的Gly， 或C结构域的29位的Gly。

上述Ala以外的氨基酸优选是Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Asp、 Glu、Arg、His、Lys、Met、Cys、Asn、Gln中的任意的氨基酸。

上述Ala以外的氨基酸优选是Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、Met 中的任意的氨基酸。

上述导入突变前的氨基酸序列优选是序列号5记载的氨基酸序列。

与上述由导入突变前的氨基酸序列组成的蛋白质相比，优选以在碱性条 件下的化学稳定性提高为特征。

上述导入突变后的氨基酸序列优选是是序列号6-18记载的氨基酸序列。

本发明还涉及将2个以上的上述蛋白质连接而成的，包含多个结构域的 蛋白质。

本发明还涉及将2种以上的上述种类不同的蛋白质连接而成的，包含多 个结构域的蛋白质。

在上述蛋白质中，结构域的数量优选为2-5个。

本发明还涉及编码上述蛋白质，或编码上述包含多个结构域的蛋白质的 DNA。

在上述DNA中，与构成相连接的结构域的碱基序列的序列同源性低于 90％是优选的。

本发明还涉及含有上述DNA的载体。

本发明还涉及将上述载体转化于宿主而获得的转化体。

上述宿主优选是革兰氏阳性菌。

上述革兰氏阳性菌优选是短芽孢杆菌(Brevibacillus)属细菌。

上述短芽孢杆菌属细菌优选是桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus  choshinensis)。

本发明还涉及使用上述转化体，或者利用DNA的无细胞蛋白质合成体 系，制造上述蛋白质，或上述包含多个结构域的蛋白质的方法。

在上述制造方法中，将蛋白质积累在转化体的细胞内和/或周质区域内， 和/或将蛋白质分泌到转化体的细胞外是优选的。

本发明还涉及亲和分离基质，其特征是将上述蛋白质，或上述包含多个 结构域的蛋白质作为亲和配体固定在由水不溶性基体材料形成的担体上。

上述亲和分离基质，优选与含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合。

上述含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质优选选自抗体、抗体衍生物、抗 体片段和或抗体片段衍生物。

上述抗体、抗体衍生物、抗体片段和抗体片段衍生物优选是选自IgG和 IgG衍生物。

本发明还涉及上述亲和分离基质在含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质 的分离中的应用。

发明的效果

本发明的蛋白质具有比现有的修饰型蛋白A配体更高的耐碱性，并且具 有充分的抗体酸解离特性，涉及创造出新型修饰蛋白A配体。通过采用将以 所述蛋白质为构成成分的修饰蛋白A配体固定在载体上而成的亲和分离基 质，可以分离纯化抗体样分子，更具体而言，可分离纯化含免疫球蛋白的 Fc区域的抗体、抗体衍生物、片段抗体或片段抗体衍生物。

蛋白A来源的E、D、A、B或C结构域是相互具有高同源性的氨基酸 序列，通过将保存在这类结构域之间的Gly取代为Ala以外的氨基酸，即使 在使用E、D、A、B或C结构域的任何结构域的情况下，也都具有所述效 果。

附图简介

图1.葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白A的E、D、A、B和C结构 域的序列比对表。需要说明的是，-(连字符)表示与C结构域的氨基酸残 基相同。

图2.涉及本发明的实施例9和比较例1，图中显示了C-G29V、C-G29W、 C-野生型和C-G29A对于单克隆IgG-Fab的结合反应曲线。

图3.涉及本发明的实施例10和比较例1，图中显示了各种B-G29X、 B-野生型和B-G29A的在碱处理后残留的IgG结合活性(％)。

图4.涉及本发明的实施例11和比较例1，图中显示了各种C-G29X、C- 野生型和C-G29A在碱处理后残留的IgG结合活性(％)。

图5.涉及本发明的实施例12，图中显示了在从5连接型C-G29V的氨 基酸序列逆翻译而产生的DNA序列中，相连接的各个结构域的DNA序列 比对图。

图6.涉及本发明的实施例13和比较例2，图中显示了(A)5连接型 C-G29V和(B)5连接型C-野生型表达重组菌的培养上清液的SDS-PAGE 的分析结果。

图7.涉及本发明的实施例13和比较例2，图中显示了(A)5连接型 C-G29V和(B)5连接型C-野生型表达重组菌的琼脂糖凝胶电泳的保持质 粒的分析结果。

发明的实施方案方式

本发明的蛋白质是对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其具有的氨基酸 序列是在源自序列号1-5记载的蛋白A的E、D、A、B和C结构域中的任 何结构域的氨基酸序列中，1个以上的Gly被Ala以外的氨基酸取代的序列， 并且，其特征是与具有所述Gly被Ala取代了的氨基酸序列的蛋白质相比， 对免疫球蛋白的Fab区域的亲和性降低。

蛋白A是由5个免疫球蛋白结合性结构域相连接的形态构成的蛋白质。 在多个微生物中都发现了蛋白A，作为发现了蛋白A的微生物可列举例如葡 萄球菌属。序列号1-5记载的蛋白A的E、D、A、B和C结构域是能够与 免疫球蛋白的互补决定区(CDR)之外的区域结合的免疫球蛋白结合性蛋白 质，各个结构域都可与免疫球蛋白的Fc区域、Fab区域和Fab中的特别是 Fv区域各个区域结合。图1的序列比对表显示，源自蛋白A的E、D、A、 B和C结构域，具有相互高同源性的氨基酸序列，在所有的结构域中都保守 了与C结构域的29位Gly、而且甚至与26位-39位的氨基酸残基相对应的 氨基酸序列。

源自结构域的氨基酸序列，是指导入突变前的氨基酸序列，例如可列举 蛋白A的E、D、A、B和C结构域中的任何结构域的野生型氨基酸序列， 但不限于野生型。除了将与C结构域的29位相对应的Gly取代为Ala以外 的氨基酸的突变外，即使是通过部分的氨基酸的取代、插入、缺失或化学修 饰而变异(改变)的氨基酸序列，只要其编码具有与Fc区域的结合能力的 蛋白质，就包含在导入突变前的、源自结构域的氨基酸序列中。例如，在B 结构域中导入了称为A1V和G29A的突变的Z结构域，其是源自B结构域 的序列，在Z结构域的29位Ala上导入Gly以外的氨基酸残基所获得的蛋 白质，也包含在本发明的蛋白质内。

并且，在本发明中，称为“蛋白质”的术语是包含了具有多肽结构的所 有分子的术语，片段化的或者通过肽键而连接的多肽链也都包含在称为“蛋 白质”的术语中。此外，所谓“结构域”，是蛋白质的高级结构的单位，是 指由数十至数百个氨基酸残基序列构成，充分表达出某些物理化学或生物化 学功能的蛋白质单位。

此外，对于将氨基酸取代的突变的表述，在取代位置的编号之前记载了 野生型或非突变型的氨基酸，而在取代位置的编号之后，记载了突变的氨基 酸。例如，将29位的Gly取代为Ala的突变记载为G29A。

被Ala以外的氨基酸所取代的Gly的数目没有特别的限制，相比具有取 代为Ala的氨基酸序列的蛋白质，与免疫球蛋白的Fab区域亲和性下降且仍 具有对免疫球蛋白亲和性就可以。

导入突变前的蛋白质是与蛋白A的E、D、A、B和C结构域中的任何 结构域的野生型氨基酸具有优选85％以上，更优选90％以上的序列同源性， 并具有与Fc区域的结合能力的蛋白质。

作为被Ala以外的氨基酸所取代的Gly，只要是在序列号1-5表示的蛋白 A的E、D、A、B和C结构域中的任何结构域中存在的Gly，就没有特别的 限制，例如可列举保存在结构域间的Gly，具体而言，可列举与C结构域的 29位对应的Gly。此处的“对应”是指如图1所示的将蛋白A的E、D、A、 B和C结构域进行比对时，位于纵列上相同的位置上。

作为与C结构域的29位对应的Gly，可列举E结构域的27位的Gly，D 结构域的32位的Gly，A结构域的29位的Gly，和B结构域的29位的Gly。 就这些氨基酸序列中的Gly的位置而言，是由N末端侧的氨基酸残基的插入、 缺失、添加而突变获得的，由保留在所述Gly残基前后的氨基酸序列，本领 域技术人员可以确定本发明的导入突变的氨基酸残基。

氨基酸的取代意指消除原来的氨基酸，并在相同的位置追加其他的氨基 酸的突变。追加的其他氨基酸不受特别的限制，例如可列举天然的构成蛋白 质的氨基酸、不构成蛋白质的氨基酸、非天然氨基酸。其中，从基因工程生 产的观点看，可以恰当的使用天然类型的氨基酸。

作为因取代而导入的Ala以外的氨基酸不受特别的限制，优选是Val、 Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Asp、Glu、Arg、His、Lys、Met、Cys、Asn、 Gln中的任何氨基酸。其中，优选是Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、 Asp、Glu、Arg、His、Met中的任何氨基酸。作为因取代而导入的Ala以外 的氨基酸，在碱性条件下的化学稳定性提高这点来说，优选Leu、Ile、Phe、 Tyr、Trp、Glu、Arg、Met中的任何氨基酸，最优选是Phe、Tyr、Trp、Met 中的任何氨基酸。

如上所述，由将Gly取代为Ala以外的氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白 质，可列举例如在构成由序列号5所示的蛋白A的C结构域的氨基酸序列 中，由将29位的Gly取代为Ala以外的氨基酸所获得的氨基酸序列构成的 蛋白质。

在本发明的蛋白质中导入了上述氨基酸取代突变的情况下，相比导入了 将Gly取代为Ala的突变的蛋白质，具有提高碱性条件下的化学稳定性的效 果。特别是，在构成C结构域的氨基酸序列中导入突变所获得的蛋白质，相 比来自其他的E、D、A和B结构域的情况，在碱性条件下的化学稳定性高。

此外，在用亲和柱等层析纯化柱纯化蛋白质药物时，存在出于洗净残留 在所述柱中的有机物等的目的而使用碱性溶液的情况，本发明中的“碱性条 件下”是指能实现达到该洗净目的的程度的碱性。更具体而言，约0.05-1.0N 的氢氧化钠水溶液是合适的，但不限于此。

“化学稳定性”是指蛋白质不发生氨基酸残基的化学变化等化学修饰、 和酰胺键的转移或切断等化学变性，而保持蛋白质功能的性质。在本发明中， 蛋白质的功能保持是指，与免疫球蛋白的Fc区域的结合活性(不发生化学 变性而保持亲和性的蛋白质的比例)。换言之，“化学稳定性”高的情况下， 即使在碱性溶液浸渍处理后，与免疫球蛋白Fc区域的结合活性下降的程度 也小。

例如，对于同一摩尔浓度的野生型或导入突变后的蛋白质，将这2类蛋 白质分别在30℃下在0.5N氢氧化钠溶液中处理25小时后的与免疫球蛋白 的Fc区域的亲和性，与各自处理前的同一摩尔浓度的蛋白质显示的结合活 性对比，如果野生型蛋白质残留40％，导入突变后的蛋白质残留50％，则可 认为相比野生型蛋白质，导入突变后的蛋白质在碱性条件下的稳定性高。通 过使野生型蛋白质的残留结合活性成为10-40％的碱性溶液的浸渍处理，导 入突变后的蛋白质的残留结合活性比同一条件处理的野生型蛋白质的残留 结合活性提高5％以上，优选10％以上，更优选15％以上的情况下，可认为 是本发明所述的“化学稳定性”提高。需要说明的是，在本说明书中，术语 “耐碱性”与“在碱性条件下的化学稳定性”是同义的。

导入取代突变而获得的蛋白质，表现出与蛋白A的E、D、A、B和C 结构域中的任何结构域的野生型氨基酸序列相比，具有优选85％以上，更优 选90％以上的氨基酸的序列同源性。

作为上述蛋白质的具体实例，可列举由序列号6-18中记载的氨基酸序列 组成的蛋白质。

本发明的蛋白质既可以是只由单一结构域组成的蛋白质，也可以是单体 蛋白质、多体蛋白质(多结构域型蛋白质)，其优选是由2个以上，更优选 2-10个，更优选2-5个单个结构域连接而成的。这些多体蛋白质既可以是为 单一的免疫球蛋白结合性结构域的连接体的均二聚体、均三聚体等均多聚 体，也可以是为种类不同的免疫球蛋白结合性结构域的连接体的杂二聚体、 杂三聚体等杂多聚体。

作为根据本发明所获得的单体蛋白质的连接方法，可列举由1个或多个 氨基酸残基连接的方法，但不限于这些方法。连接的氨基酸残基数没有特别 的限制。优选是不使单体蛋白质的三维立体结构不稳定。

本发明的蛋白质，或者包含多个结构域的蛋白质，也可以是作为与公知 的对蛋白质表达起辅助作用的或者具有易于纯化的优点的蛋白质的融合蛋 白而获得。作为融合蛋白的实例，可列举融合了卵清蛋白、MBP(麦芽糖结 合蛋白)或GST(谷胱甘肽S转移酶)的蛋白质，但不限于此。此外，在融 合DNA适体(adaptor)等核酸、抗生物素等药物、PEG(聚乙二醇)等高 分子的情况下，只要利用了根据本发明获得的蛋白质的有用性，就包含在本 发明中。

本发明还涉及具有编码通过上述方法获得的蛋白质的碱基序列的DNA。 就所述DNA而言，只要是由翻译构成所述DNA的碱基序列而获得的氨基 酸序列构成所述蛋白质就可以。这样的DNA可利用普遍使用的公知方法获 得，例如可以利用聚合酶链式反应(下文简称为PCR)法而获得。此外，还 可以由公知的化学合成法合成，或者可以由DNA文库获得。就构成该DNA 的碱基序列而言，密码子可进行简并密码子替换，只要在翻译时编码相同的 氨基酸，不必需与原来的碱基序列相同。

作为在编码本发明蛋白质的DNA中位置特异性的导入突变的方法，可 以使用如下的重组DNA技术、PCR方法等。

换言之，通过重组DNA技术而导入突变，可以通过盒式突变法进行， 例如在编码本发明的蛋白质的基因中，在希望导入突变的目的位点两侧存在 合适的限制性酶识别序列的情况下，用上述限制性酶切断这些限制性酶识别 序列，去除包含希望导入突变的位点的区域后，插入通过化学合成等仅在目 的位点导入了突变的DNA片段。

此外，通过PCR导入位置特异性突变可通过双引物法进行，例如通过以 编码蛋白质的双链质粒为模板，使用与+和-链互补的含有突变的2种合成寡 引物进行PCR。

此外，也可以将编码本发明的单体蛋白质(1个结构域)的DNA按预计 的数串联连接，从而制备编码多体蛋白质的DNA。例如，就编码多体蛋白 质的DNA的连接方法而言，可以是在DNA序列中导入合适的限制性酶切 位点，用DNA连接酶将限制性酶片段化了的双链DNA连接。限制性酶切 位点可以是一种，也可以导入多个不同种类的限制性酶切位点。

制备编码多体蛋白质的DNA的方法不限于这类连接方法。例如，可以 在编码蛋白A的DNA(例如，国际公开号WO06/004067号公报)中应用上 述突变导入法来制备。此外，在编码多体蛋白质的DNA中，在编码各个单 体蛋白质的碱基序列相同的情况下，由于存在引起宿主的同源重组的可能 性，编码相连接的单体蛋白质的DNA的碱基序列间的序列同源性优选低于 90％，更优选低于85％。

就载体而言，包含所编码上述蛋白质或其部分氨基酸序列的碱基序列的 DNA，以及能够在可操作连接于所述碱基序列的宿主中发挥功能的启动子。 一般而言，可以通过将包含编码上述蛋白质的基因的DNA连接或插入到合 适的载体中而获得。用于插入基因的载体只要是可以在宿主中自主复制的， 没有特别的限定，质粒DNA或噬菌体(ファ一ジ)DNA都可作为载体使用。 例如，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可列举pQE系列载体(QIAGEN 公司生产)、pET系列载体(Merck公司生产)和pGEX系列载体(GE  HealthCare日本株式会社生产)等载体。

作为载体，可列举如下：在使用短芽孢杆菌属细菌作为转化的宿主的情 况下，例如作为枯草杆菌载体的公知的是pUB110或pHY500(特开平2-31682 号公报)、pNY700(特开平4-278091号公报)、pNU211R2L5(特开平7-170984 号公报)、pHT210(特开平6-133782号公报)，或者，pNCMO2(特开 2002-238569号公报，其为大肠杆菌和短芽孢杆菌属细菌的穿梭载体)等。

可以通过向成为宿主的细胞导入本发明的载体，而获得转化体。作为载 体向宿主的转化方法，可列举例如使用钙离子的方法、电穿孔方法、原生质 体法、醋酸锂方法、农杆菌感染方法、基因枪法，或聚乙二醇法等，但不限 于此。此外，作为在宿主中维持载体的方法，可列举例如通过在细胞内独立 于基因组的载体的自主复制来维持的方法，或将制作的基因整合到基因组 中，依赖基因组的复制而维持的方法等。

对于成为宿主的细胞，并没有特别的限制，在可廉价的大量生产的基础 上，优选可恰当的使用大肠杆菌、枯草杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属 (Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、 棒状杆菌属(Corynebacterium)等真细菌。更优选的可以是枯草杆菌、短芽 孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、棒状杆菌属等革兰氏阳性菌。 更优选的是公知的适用于大量生产蛋白A的实例(国际公开第WO06/004067 号公报)短芽孢杆菌属细菌。

作为短芽孢杆菌属细菌，虽无限定，但可示例土壤短芽孢杆菌 (Brevibacillus agri)、波茨坦短芽孢杆菌(B.borstelensis)、简短短芽孢杆菌 (B.brevis)、中孢短芽孢杆菌(B.centrosporus)、B.choshinensis、美丽短芽 孢杆菌(B.formosus)、B.invocatus、侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporus)、喜 湖短芽孢杆菌(B.limnophilus)、副短短芽孢杆菌(B.parabrevis)、罗伊兹短 芽孢杆菌(B.reuszeri)、热红短芽孢杆菌(B.thermoruber)。优选的可示例 简短短芽孢杆菌47株(JCM6285)、简短短芽孢杆菌47K株(FERM BP-2308)、 简短短芽孢杆菌47-5Q株(JCM8970)、桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis) HPD31株(FERM BP-1087)和桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis)HPD31-OK 株(FERM BP-4573)。为了适应提高产量等目的，可以使用上述短芽孢杆菌 属细菌的蛋白酶缺陷株、高表达株或芽孢形成能力缺失株等突变株(或诱导 株)。具体可列举源自桥石短芽孢杆菌HPD31的蛋白酶突变株桥石短芽孢杆 菌HPD31-OK(特开平6-296485号公报)，或没有芽孢形成能力的桥石短芽 孢杆菌HPD31-SP3(国际公开第WO05/045005号公报)。

本发明的蛋白质可使用转化体或上述使用了DNA的无细胞蛋白质合成 系统来制备。

在使用转化体制备蛋白质的情况下，可以通过将蛋白质积累在转化体的 细胞内(含周质区域内)或培养液(细胞外)中而回收。蓄积在细胞内时， 其优点是可以防止表达的蛋白质的酸化，也不与培养基组分发生副反应，蓄 积在周质区域内时，优点是可以抑制因细胞内蛋白酶的分解。另一方面，如 果将蛋白质分泌在转化体的细胞外，就不需要菌体破碎和提取工艺，优点是 降低了生产成本。

具体的方法是，在蛋白质蓄积在培养细胞内(含周质区域内)的情况下， 可以通过例如从培养液离心分离、过滤等方法收集菌体，然后，通过超声破 碎、法式压滤法等将所述菌体破碎，和/或通过添加表面活性剂等使其溶解， 回收细胞内蓄积产生的蛋白质。在分泌生产重组蛋白质的情况下，可以在培 养结束后，通过离心分离、过滤等普通的分离方法，将培养细胞和含有分泌 生产的蛋白质的上清液分离，回收所生产的重组蛋白。

在通过无细胞的蛋白质合成体系制备本发明的蛋白质的情况下，作为所 述无细胞的蛋白质合成体系，可以是使用细胞提取液在体外合成蛋白质的体 系，并无特殊限制，例如，可以使用原核细胞来源的、植物细胞来源的、高 等动物细胞来源的合成体系等。

本发明的蛋白质可以如下制备：在培养基中培养上述转化体，使其以与 其他的蛋白质的融合蛋白的形式表达，从所述培养物中提取所述融合蛋白， 通过适当的蛋白酶切割所述融合蛋白，提取所需要的蛋白质。

在培养基中培养本发明的转化体的方法，根据用于宿主培养的常用方法 进行。用于所获得的转化体的培养的培养基并无特殊限制，只要能够高效、 高产量的生产所述蛋白质即可。具体而言，可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、 多价蛋白胨、肉的提取物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸等作为碳源或氮源。 此外，必要时相应添加钙盐、钠盐、磷酸盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐等无 机盐类。在使用营养缺陷性的宿主细胞的情况下，可添加生长繁殖必需的营 养物。此外，必要时也可以添加青霉素、红霉素、氯霉素、新霉素等抗生素。

作为培养以大肠杆菌为宿主而获得的转化体的培养基没有特殊的限定， 例如，可列举LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)或2× YT培养基(1.6％胰蛋白胨，1.0％酵母提取物，0.5％NaCl)等。

作为培养以短芽孢杆菌属细菌为宿主而获得的转化体的培养基没有特殊 的限定，例如，可列举TM培养基(1％蛋白胨，0.5％肉的提取物，0.2％酵 母提取物，1％葡萄糖，pH7.0)或2SL培养基(4％蛋白胨，0.5％酵母提取 物，2％葡萄糖，pH7.2)等。

进一步的，为了抑制由存在于菌体内外的宿主来源的蛋白酶所导致的该 目标蛋白的分解和低分子化，可以添加适当浓度的各种公知的蛋白酶抑制 剂，即，苯甲基磺酰氟(PMSF)、苯甲脒、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、 抗蛋白酶(AntiPain)、糜蛋白酶抑素、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素A、膦酰二 肽(Phosphoramidon)、抑肽酶(aprotinin)、乙二胺四乙酸(EDTA)，和/或 其他市售的蛋白酶抑制剂。

进一步的，为了使本发明的蛋白质正确的折叠，可以利用例如GroEL/ES、 Hsp70/DnaK、Hsp90、Hsp104/ClpB等分子伴侣。分子伴侣可以通过共表达 或融合蛋白化等手段，与本发明的蛋白质共存。在以蛋白质的正确折叠为目 的的情况下，向培养基中添加促进正确折叠的添加剂，或者在低温下培养等 手段是可以的，但不限于此。

可以在15-42℃的培养温度下，优选20-37℃下，通过在通气搅拌条件下 进行数小时-数天的好氧性培养来制备蛋白质。根据情况不同，也可以隔绝 通气进行厌氧性培养。

可以通过亲和层析、阳离子或阴离子交换层析、凝胶过滤层析等单独或 恰当的组合，进行蛋白质的提纯。

确认所获得的提纯物质是否是目的蛋白，一般可以进行的方法是例如 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、N末端氨基酸序列分析、Western印迹等。

通过将本发明的蛋白质作为亲和配体固定在由水不溶性的基体材料制成 的载体上，可以获得亲和分离基质。在此，“亲和配体”是指以抗原和抗体 的结合为代表，基于特异性的分子间亲和性，从某些分子的集合中选择性的 捕获(结合)目标分子的物质(官能团)的术语，在本发明中，指特异性结 合免疫球蛋白的蛋白质。在本说明书中，在仅记载“配体”的情况下，与“亲 和配体”也是同义的。

在本发明中使用的由水不溶于性基体材料制成的载体可以列举玻璃珠、 硅胶等无机载体，交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸、交联聚丙烯酰胺、交联聚 乙烯等合成高分子，或由结晶纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联右旋 糖等多糖形成的有机载体，此外，由这些组合而获得的有机-有机、有机-无 机等复合载体等。作为市售商品，可以列举作为多孔纤维素凝胶的GCL2000 (生化学工业株式会社生产)、烯丙基右旋糖和亚甲基双丙烯酰胺以共价键 交联的Sephacryl S-1000(GE HealthyCare日本株式会社生产)、作为丙烯酸 类的载体的Toyopearl(东曹株式会社生产)、作为琼脂糖类的交联载体的 Sepharose CL4B(GE HealthyCare日本株式会社生产)，或作为纤维素类的交 联载体的Cellufine(チッソ株式会社生产)等。但是，本发明中的水不溶性 载体不限于这些示例的载体。

此外，本发明中使用的水不溶性载体，从所述亲和分离基质的使用目的 和方法来看，希望是表面积大的，优选是具有多个合适大小的细孔的多孔物 质。载体的形态可以选择任意的形态，珠状、独石状、纤维状、膜状(包括 中空类的)等都是可以的。

关于配体的固定化方法，可以是例如利用配体中存在的氨基、羧基或巯 基，通过传统的偶联方法与载体结合。作为偶联方法，可列举使载体与溴化 氰、表氯醇、二缩水甘油醚、对甲苯磺酰氯(トシルクロライド)、三氟代乙 烷磺酰氯(トレシルクロライド)、肼和高碘酸钠等反应而活化载体(或者在 载体表面导入反应官能团)，与作为配体而固定化的化合物进行偶联反应的 固定化方法，此外，可列举在载体和作为配体而固定化的化合物存在的体系 中，添加类似碳二亚胺这类的缩合试剂，或者类似戊二醛这类的在分子中具 有多个官能团的试剂，通过缩合、交联来固定化的方法。

此外，可以在配体和载体之间导入由多个原子构成的间隔分子，也可以 将配体直接固定在载体上。因而，为了固定化，可以对本发明的蛋白质进行 化学修饰，也可以加入对固定化有用的氨基酸残基。作为对固定化有用的氨 基酸，可列举侧链具有对固定化的化学反应有用的官能团的氨基酸，例如可 列举侧链含有氨基的Lys、侧链含有巯基的Cys。本发明的实质是，赋予了 本发明中蛋白质的效果，在固定了该蛋白质作为配体的基质中也同样而赋 予，不论为固定化而进行何种修饰、变化，也都包含在本发明的范围内。

上述亲和分离基质优选是与包含免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合的。 亲和分离基质结合的、包含免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质，可列举例如包 含免疫球蛋白的Fc区域的抗体、抗体衍生物、片段抗体和片段抗体衍生物。 使得通过亲和柱·层析提纯法分离提纯这些蛋白质成为可能。

此处“包含免疫球蛋白的Fc区域的抗体”可列举例如IgG。“抗体衍生 物”是指IgG衍生物，可列举例如将人IgG的一部分结构域替换为其他物种 的IgG抗体的结构域而融合成的嵌合抗体，或将人IgG的CDR部分替换为 其他物种的抗体的CDR部分而融合成的人源化抗体。“片段抗体”可列举例 如仅由人IgG的Fc区域构成的蛋白质。“片段抗体衍生物”可列举例如由人 IgG的Fv区域和Fc区域融合而成的人工抗体。此外，这些抗体、抗体衍生 物、片段抗体和片段抗体衍生物在说明书中使用“抗体样分子”的表述作为 统称。

可以使用亲和分离基质分离包含免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质。包含 Fc区域的蛋白质(上述抗体、抗体衍生物、片段抗体或片段抗体衍生物)的 分离，可以使用已经作为商品存在的蛋白A柱按照亲和柱层析提纯法的步骤 实现(非专利文献3)。换言之，将含有抗体、抗体衍生物、片段抗体或片段 抗体衍生物的缓冲液调整为中性后，使所述溶液通过填充了本发明的亲和分 离基质的亲和柱，吸附抗体、抗体衍生物、片段抗体或片段抗体衍生物。然 后，使适量的纯缓冲液通过亲和柱，将柱内部洗净。此时，所预期的抗体、 抗体衍生物、片段抗体和片段抗体衍生物被吸附到柱内的本发明的亲和分离 基质上。然后，将调整到合适的pH的酸性缓冲液(也有时含有促进从所述 基质解离的物质)流经柱子，通过洗脱所预期的抗体、抗体衍生物、片段抗 体和片段抗体衍生物，实现高纯度的提纯。

就本发明的亲和分离基质而言，通过使缓冲液流经而洗净，可以循环利 用，所述缓冲液是完全不损坏配体化合物或载体的基体材料的、合适的强酸 性或强碱性的纯缓冲液(也有含合适的变性剂或有机溶剂的溶液的情况)。

一般而言，构成蛋白A的各个结构域，与Fc区域的结合比与Fab区域 的结合更强(非专利文献3)。因此，本发明蛋白质的“对免疫球蛋白的亲和 性”实质上是指对Fc区域的亲和性的表述，即使与Fab区域的结合力发生 变化，与免疫球蛋白的亲和性的强度也没有很大的变化。就本发明的蛋白质 而言，蛋白A的免疫球蛋白结合结构域所具有的、与Fab区域的次级亲和性 降低，产生如下效果，即可以排除与免疫球蛋白的相互作用中的次级结合的 影响。一方面，由于保留了与Fc区域的亲和性，因而保留了与全体免疫球 蛋白的亲和性。就本发明的蛋白质所具有的与免疫球蛋白的亲和性而言，当 通过下文所述的Biacore系统测定对于人免疫球蛋白G制品的亲和性时，亲 和常数优选在10⁶(M^-1)以上，更优选在10⁷(M^-1)以上。

本发明的蛋白质与免疫球蛋白的亲和性可以通过例如使用表面质子共振 原理的Biacore系统(GE HealthCare日本株式会社生产)等生物传感器来测 定，但不限于这类测定方法。

作为测定条件，可以检测出蛋白A与免疫球蛋白的Fc区域结合时的结 合信号就行，可以通过在20-40℃(恒定温度)的温度，pH6-8的中性条件 下测定而进行简单的评价。

作为本发明的蛋白质表现出亲和性的对象，可列举例如不是不充分地含 有Fab区域或Fc区域的免疫球蛋白分子，或者，可列举其衍生物，但不限 于此。本发明的蛋白质与含有一部分Fc区域侧的蛋白质也具有亲和性，结 合对象不必须是含有完整Fc区域的蛋白质。由于抗体的立体结构都是已知 的，在蛋白质工程学上保持了本发明蛋白质结合的区域的立体结构的基础 上，还可以对Fab区域或Fc区域进行进一步的改变(片段化)，本发明的蛋 白质也能够结合这些衍生物。作为本发明的蛋白质的实例，可列举与IgG的 亚型1、2或4的Fc区域具有亲和性的蛋白质，其特征在于，就与属于VH3 亚家族的IgG的Fab区域的亲和性而言，相比导入了将C结构域的29位的 Gly替换为Ala的突变后的蛋白质，其亲和性降低。

一方面，当测定与免疫球蛋白的Fab区域的亲和性时，对作为结合对象 使用的免疫球蛋白分子没有特殊的限制，只要可以检测出与Fab区域的结合 即可，但是由于使用含Fc区域的免疫球蛋白分子时，也检测出与Fc区域的 结合，故优选使用诸如去除Fc区域而将免疫球蛋白分子片段化所获得的Fab 片段或Fv片段。

可以使用属于VH3亚家族的人IgG(单克隆抗体)来确认本发明蛋白质 与免疫球蛋白的Fab区域的结合。进一步的，更优选蛋白A与Fab区域的结 合已确认、且属于VH3亚家族的免疫球蛋白的Fab片段。人的VH生殖细 胞基因约一半属于VH3亚家族，实际上，由属于VH3亚家族的IgG抗体构 成的药物正在销售、开发中。进一步地，与属于VH3亚家族的免疫球蛋白 的Fab片段的结合能力的残留，会对抗体的酸解离特性产生不良影响，这可 以说已经是可通过文献而公知的信息(Ghose S.等，Biotechnology and  bioengineering，2005年，第92卷，第6期)。

本领域技术人员可以如下方便的验证亲和性的差异，通过在相同的测定 条件下，获得与相同的免疫球蛋白分子的结合反应曲线，根据分析时所获得 的结合参数，与导入了将对应C结构域的29位的Gly替换为Ala的突变的 蛋白质进行比较。此时，比较亲和性差异的两者的序列在突变位置(C结构 域的情况下是29位)以外的序列必须是相同的，例如在将29位的Gly替换 为Ala的B结构域变体为比较对象的情况下，与29位的Gly替换为了Ala 以外的氨基酸的B结构域变体进行比较是恰当的，而与例如29位的Gly替 换为了Ala以外的氨基酸的C结构域变体进行比较则是不恰当的。

结合参数可使用例如亲和常数(KA)或解离常数(KD)(永田等著“生 体物質相互作用のリアルタイム解析実験法”，シュプリンガ一·フェアラ 一ク東京，1998年，第41頁)。本发明的各个结构域变体与Fab的亲和常数 可以例如通过如下实验体系获得，利用Biacore系统，在传感芯片中固定属 于VH3亚家族的免疫球蛋白的Fab片段，在温度25℃，pH7.4的条件下流 路添加各结构域变体的实验体系。相比29位的Gly替换为Ala的变体，将 29位的Gly替换为Ala以外的氨基酸的变体的亲和常数(KA)优选降低至 1/2以下的变体可适合使用，更优选降低至1/5以下，更优选降低至1/10以 下的变体可适合使用。特别的是，将29位的Gly替换为Ala的C结构域变 体与Fab的KA一般是1×10⁴～1×10⁵(M^-1)，而将29位的Gly替换为Ala 以外氨基酸的C结构域变体且其KA不足1×10⁴(M^-1)的可合适在本发明 中使用，更合适的可使用KA为0.5×10⁴(M^-1)以下的变体。需要说明的是， 在上述KA测定中，可以使用将免疫球蛋白G用木瓜蛋白酶解片段化为Fab 片段和Fc片段而获得的Fab，或者可以使用通过基因工程手段获得的、用仅 表达免疫球蛋白G的Fab区域的生产系统制造的Fab。

就与化学处理后的免疫球蛋白的结合活性而言，可以通过与上述相同的， 使用表面质子共振原理的Biacore系统(GE HealthCare日本株式会社生产) 等生物传感器来进行试验，但不限于此。但是在化学处理后的结合活性(相 比进行化学处理前的结合活性)中，作为结合参数的亲和常数(KA)和解 离常数(KD)是不合适的(通过化学处理，1分子蛋白质与免疫球蛋白的结 合能没有变化)。在计算化学处理后的蛋白质的残存结合活性的情况下，例 如将蛋白质固定在传感芯片上，在对蛋白质化学处理之前和之后，添加了相 同浓度的免疫球蛋白时的结合信号大小、或被称为理论的最大结合容量 (Rmax)的结合参数是优选使用的，但不限于此。例如，也可以使用固定 免疫球蛋白，添加化学处理前后的蛋白质的实验体系。

由于亲和分离基质具有与上述免疫球蛋白的Fab区域的结合能降低的性 质，在用酸性溶液洗脱抗体的步骤中，其解离抗体的特性是优秀的。具体而 言，可以通过更偏中性的酸性洗脱条件进行洗脱，从而获得抑制酸性条件对 抗体的破坏的效果。所谓的更偏中性的酸性洗脱条件，具体而言，通常的酸 性洗脱条件是pH2.0-3.5左右，与此相对比的，更偏中性的酸性洗脱条件是 pH3.0-5.0左右，在此条件下的洗脱对抗体的破坏小(Ghose S.等， Biotechnology and bioengineering，2005，第92卷，第6期)。优秀的抗体酸 解离特性是指这样的特性，即，在更偏中性的酸性洗脱条件下解离，在酸性 条件下洗脱抗体时的洗脱峰形更加尖锐。层析的洗脱峰形变得更尖锐，则可 以用更小体积的洗脱液回收含有更高浓度的抗体的洗脱液。

此外，可以提供这样的基质，所述基质的用酸性溶液解离抗体的特性优 秀，且在碱性条件下的化学稳定性高。具体而言，可以提供这样的基质，所 述基质在为了从基质去除杂质(宿主来源的蛋白质、碳水化合物、脂类、细 菌、病毒等)再利用而用氢氧化钠水溶液(0.05M-1M左右)进行洗涤的过 程中，对配体分子的破坏更小。需要说明的是，为了再利用的洗涤方法不限 于氢氧化钠水溶液的洗涤，能够高效的洗涤、杀菌且更便宜的实施的手段也 可适用。

实施例

基于以下实施例，对本发明进行更详细的说明，但是本发明不限于这些 实施例。对于实施例中获得的各种蛋白质(结构域没有连接的、单一结构域 类型的蛋白质)，有时以“表示结构域的字母-导入的突变(野生型的话为野 生型)”的形式表述。例如，野生型C结构域表述为“C-野生型”，导入了 G29V突变的C结构域变体表述为“C-G29V”。此外，在本发明中，将对应 于C结构域的29位的Gly替换为Ala以外的氨基酸的突变，统称表述为 “G29X”，例如涉及在C结构域中导入了本发明突变的各种C结构域变体时， 表述为“C-G29X”。

实施例1：制备编码野生型C结构域(C-野生型)的DNA

以编码野生型蛋白A的表达载体pNK3262NX为模板，使用序列号19-20 的寡核苷酸引物进行PCR，扩增编码C-野生型(序列号5)的DNA片段(177 bp)。用作模板的pNK3262NX，是已经公知的pNK3262的一部分改变了的 蛋白A表达载体，其编码去除了细胞壁结合结构域X的一部分等的野生型 蛋白A(国际公开号WO 06/004067号公报)。通过本实施例获得的、编码 C-野生型的碱基序列在序列号21中显示。此外，序列号19-20中显示的寡 核苷酸引物，是如下设计的：使用其而扩增了的DNA，在编码C-野生型的 基因的外侧具有BamHI和EcoRI的限制性酶识别位点，并且在C-野生型的 C末端侧(Lys-58之后)具有Cys残基。

将所获得的DNA片段用限制性酶BamHI和EcoRI(均为Takara公司生 产)消化后，纯化回收。将表达GST融合蛋白的载体pGEX-6P-1(GE  HealthCare日本株式会社生产)用BamHI和EcoRI消化后，纯化回收，进一 步通过碱性磷酸酶处理而进行脱磷酸化处理。用DNA连接酶Ligation High (TOYOBO公司生产)将编码C-野生型的DNA片段和所述表达载体 pGEX-6P-1连接，构建GST融合型C-野生型表达质粒。

使用通过上述操作获得的包含编码C-野生型的基因的表达质粒，进行大 肠杆菌HB101(Takara公司生产)的转化，通过常规方法扩增并提取质粒 DNA。

实施例2：制备编码野生型B结构域(B-野生型)的DNA

如图1所示，B-野生型的氨基酸序列(序列号4)是在C-野生型中导入 T23N、V40Q、K42A、E43N、I44L的突变所获得的序列。因此，编码B- 野生型的DNA，是在编码C-野生型的DNA(序列号21)中导入T23N、V40Q、 K42A、E43N、I44L的突变而制备的。以实施例1获得的C-野生型表达质粒 为模板，使用序列号22-23所示寡核苷酸引物，获得这样的质粒，所述质粒 含有编码用QuickChange方法在C-野生型中导入了T23N突变的氨基酸序列 的基因。此外，以所获得的质粒为模板，使用序列号24-25所示寡核苷酸引 物，获得这样的GST融合型B-野生型表达质粒，所述质粒包含以同样的 QuickChange方法导入V40Q、K42A、E43N、I44L的突变的、编码B-野生 型的基因。

使用该表达质粒，进行大肠杆菌HB101(Takara公司生产)的转化，通 过常规方法扩增并提取质粒DNA。序列号26中显示了本实施例获得的编码 B-野生型的DNA序列。

需要说明的是，QuickChange方法是使用DNA聚合酶Pfu Turbo和甲基 化DNA(模板DNA)切割酶DpnI(均为Stratagene公司生产)，根据Stratagene 公司的说明书实施的。

实施例3：向Gly-29导入突变

以实施例1获得的C-野生型表达质粒和实施例2获得的B-野生型表达质 粒为模板，使用表1所示序列号27-52的引物，用QuickChange方法获得编 码变体的各种基因。

以C-野生型表达质粒为模板，将序列号5的氨基酸序列中的Gly-29替换 为Val、Leu、Ile、Tyr、Phe、Thr、Trp、Ser、Asp、Glu、Arg、His或Met， 获得编码序列号6-18的任一项记载的C结构域变体(C-G29X)的各种表达 质粒。同样的，以B-野生型表达质粒为模板，将序列号4的氨基酸序列中的 Gly-29替换为Val、Arg、Asp或Trp，获得编码序列号53-56的任一项记载 的B结构域变体(B-G29X)的各种表达质粒。

使用通过上述方法获得的、包含编码序列号6-18和序列号53-56中任一 项的基因的各种上述表达质粒，进行大肠杆菌HB101(Takara公司生产)的 转化，通过常规方法扩增并提取质粒DNA。

关于序列号27-52的引物，表1显示了各种引物分别在导入何种突变时 使用。

[表1]

实施例4：DNA序列确认

使用DNA测序仪3130x1 Genetic Analyzer(Applied Biosystem公司生产)， 确认实施例1-3所获得的C-野生型、各种C-G29X、B-野生型和各种B-G29X 的各种表达质粒的DNA碱基序列。使用BigDye Terminator v.1.1循环测序试 剂盒(Applied Biosystem公司生产)，根据附带的说明书，进行各个质粒DNA 的测序PCR反应，纯化所述测序产物，用于序列分析。

实施例5：表达目的蛋白

将实施例3所获得的、将各种C-G29X/B-G29X作为GST融合蛋白而表 达的各种转化体，在含有氨苄西林的LB培养基中，37℃培养过夜。将所述 培养液(5mL)接种在2x YT培养基(200mL，含有氨苄西林)上，在37 ℃培养约1小时。添加IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)使终浓 度达到0.1mM，进一步在37℃培养18小时。

培养结束后，离心收集菌，重悬于5mL含EDTA(0.5mM)的PBS缓 冲液中。超声破碎细胞，离心分离，将上清液级分(无细胞提取液)和不溶 性级分分级。

将目的基因导入pGEX-6P-1载体的多克隆位点中的情况下，GST作为附 加于N端的融合蛋白而表达。在SDS电泳分析时，针对所有由各种转化体 的培养液制备的各种无细胞提取液，确认了在分子量约33000的位置上可认 为是由IPTG诱导出来的蛋白质条带。

实施例6：目的蛋白的纯化

用使用了与GST具有亲和性的GSTrap FF柱(GE HealthCare日本株式 会社生产)的亲和层析，由在实施例5获得的、包含GST融合蛋白的各种 无细胞提取液纯化GST融合蛋白(粗纯化)。将各种无细胞提取液添加到 GSTrap FF柱中，用标准缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，150mM NaCl， pH7.4)洗涤柱，然后用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，20mM谷胱甘肽， pH8.0)洗脱目的GST融合蛋白。

将基因导入pGEX-6P-1载体的多克隆位点中的情况下，在GST和目的 蛋白之间导入可用ProScission蛋白酶(GE HealthCare日本株式会社生产) 切断GST的氨基酸序列。在各种GST融合蛋白中添加ProScission蛋白酶(按 相对于1mgGST融合蛋白添加2单位的ProScission蛋白酶的比例进行添 加)，在4℃孵育16小时。

从进行了GST切断反应的含目的蛋白的反应溶液中，用使用了Superdex  75 10/300 GL柱(GE HealthCare日本株式会社生产)的凝胶过滤层析，分离 目的蛋白。在用标准缓冲液平衡了的Superdex 7510/300 GL柱中，添加各种 反应溶液，将目的蛋白与切断的GST或ProScission蛋白酶分离纯化。

在Tricine(トリシン)-SDS电泳分析这些完成了纯化的各种蛋白质溶液时， 确认了在分子量约6800的位置上可认为是目的蛋白的条带。根据 Tricine-SDS电泳的分析结果，可认为以90％以上的高纯度存在。

此外，关于本实施例获得的各种蛋白质的一级序列，相对各种 C-G29X/B-G29X的序列来说，是在N末端附加来自载体pGEX-6P-1的 Gly-Pro-Leu-Gly-Ser，并在C末端附加Cys残基的序列。

需要说明的是，上述的用使用了柱的层析纯化蛋白质，是利用 AKTAprime plus系统(GE HealthCare日本株式会社生产)而实施的。

实施例7：解析所获得的各种C-G29X/B-G29X的与免疫球蛋白的亲和性

使用利用了表面质子共振的生物传感器Biacore 3000(GE HealthCare日 本株式会社生产)解析所获得的各种C-G29X/B-G29X的与免疫球蛋白的亲 和性。在本实施例中，利用了从人血浆中分级的人免疫球蛋白G制品(下文 称为人IgG)。将人IgG固定在传感芯片上，将各种C-G29X/B-G29X在芯片 上流过，检测两者的相互作用。用氨基偶联法将人IgG固定在传感芯片CM5 上，所述氨基偶联法使用了N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或盐酸N-乙基-N’-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)进行，使用乙醇胺进行封闭(传感芯片 和固定化试剂都是GE HealthCare日本株式会社生产的)。将Gammagard (Baxter公司生产)溶解在标准缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，150mM  NaCl，pH7.4)中使得浓度为1.0mg/ml，从而制备人IgG溶液。用固定化用 缓冲液(10mM CH₃COOH-CH₃COONa，pH4.5)将人IgG溶液稀释100倍， 根据Biacore 3000附带的规程，将人IgG固定在传感芯片上。此外，对于芯 片上别的流动池，通过在用EDC/NHS活化后，进行将乙醇胺固定化的处理， 从而准备了作为阴性对照的参照池。对于各种C-G29X/B-G29X而言，使用 上样缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，150mM NaCl，0.005％P-20， pH7.4)，在10-1000nM的范围内恰当的配制(每种分别配制3种不同的蛋 白质浓度的溶液)，将各种蛋白质溶液以20μl/min的流速30秒时间加入到 传感芯片中。在测定温度25℃，依次观测了添加时(结合相，3秒)和添加 结束后(解离相，60秒)的结合反应曲线。在各种观测结束后，添加50mM NaOH(15秒)，使传感芯片再生(目的是去除传感芯片上残留的添加蛋白 质，确认了所固定的人IgG的结合活性几乎完全恢复)。针对所获得的结合 反应曲线(减去了参照池的结合反应曲线的结合反应曲线)，进行了使用系 统附带的BIA evaluation软件的1∶1结合模型的拟合解析，计算出结合速率 常数(k_on)、解离速率常数(k_off)、亲和常数(K_A＝k_on/k_off)和解离常数(K_D＝ k_off/k_on)。根据表2所示，各种C-G29X与人IgG的结合参数和C-野生型(比 较例1)是相同程度的。具体来说，就对人IgG的解离常数而言，对于任一 种C-G29X都是10^-8M数量级。而对于各种B-G29X，也获得相同的结果。

[表2]

实施例8：制备源自人源化单克隆抗体的Fab片段

对于本发明中的“与Fab区域的亲和性”，使用不含免疫球蛋白的Fc区 域的Fab片段进行研究。

以人源化单克隆IgG制品为原料，将其通过木瓜蛋白酶而片段化为Fab 片段和Fc片段，通过分离纯化而仅制备了Fab片段。

将人源化单克隆IgG制品赫赛汀(Herceptin，中外制药公司生产)溶解 在木瓜蛋白酶消化用缓冲液(0.1M AcOH-AcONa，2mM EDTA，1mM半 胱氨酸，pH 5.5)中，加入来自木瓜树乳胶的木瓜酶琼脂糖(Papain Agarose  from papaya latex)木瓜蛋白酶固定化琼脂糖(Sigma公司生产)，一边用振动 器(ロ一テ一タ一)混合，一边在37℃孵育约8小时。由从木瓜蛋白酶固定化 琼脂糖分离的反应溶液(混合了Fab片段和Fc片段)，通过利用了Resource  S柱(GE HealthCare日本株式会社生产)的离子交换层析，分离纯化Fab 片段(下文表述为单克隆IgG-Fab)。具体而言，将用离子交换用缓冲液A(50 mM CH₃COOH-CH₃COONa，pH4.5)稀释至pH4.5的反应溶液，添加到用离 子交换用缓冲液A平衡了的Resource S柱中，用离子交换用缓冲液A洗涤 后，通过利用了离子交换用缓冲液A和离子交换用缓冲液B(50mM  CH₃COOH-CH₃COONa，1M NaCl，pH4.5)的盐浓度梯度(在用10倍柱体 积的缓冲液流过柱的时侯，将缓冲液B的浓度从0％直线升高至50％)，在 中途分离提取洗脱的单克隆IgG-Fab。

通过利用了Superdex 7510/300GL柱(平衡化和分离中使用标准缓冲液) 的凝胶过滤层析来纯化分离提取的单克隆IgG-Fab溶液，获得单克隆IgG-Fab 溶液。

需要说明的是，与实施例6相同地，由层析进行的蛋白质的纯化是使用 AKTAprime plus系统而实施的。

实施例9：解析所获得的各种C-G29X的与单克隆IgG-Fab的亲和性

对于解析所获得的各种C结构域变体的与IgG-Fab的亲和性，与实施例 7相同地，也使用Biacore 3000来实施。

将实施例8中获得的单克隆IgG-Fab固定在传感芯片CM5上，将各种 C-G29X在芯片上流过并检测相互作用。参照池中固定化了人血清白蛋白 (Sigma Aldrich公司生产)。单克隆IgG-Fab和人血清白蛋白的固定方法与 实施例6相同。

使用上样缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，150mM NaCl，0.005％ P-20，pH7.4)，将准备测定的各种C-G29X分别配制成4μM、8μM、16μM、 32μM(根据情况可不配制32μM)的不同蛋白质浓度的溶液，将各种蛋白 质溶液以20μL/min的流速30秒添加到传感芯片中。在25℃的测定温度下， 依次观测了添加时(结合相，30秒)和添加结束后(解离相，60秒)的结 合反应曲线。在各种观测结束后，添加10mM NaOH(30秒)，使传感芯片 再生。测定分为2次实施，用2次都进行了测定的C-G29A(比较例1)和 C-G29D确定了实验之间的一致性(整合性)。解析方法与实施例7相同。但 是，作为解析时的1种结合参数的R_max是作为常数而进行的拟合。R_max值是 所有的固定分子都与添加的分子结合时的信号量，在固定化了相同分子(单 克隆IgG-Fab)的本实验系统中，该值不可能有大的变化。然而，在结合信 号非常微弱的情况下，为了避免R_max值成为极小的值而导致错误的拟合，将 R_max值作为常数进行拟合。

图2中示例了C-G29V和C-G29W与单克隆IgG-Fab的结合反应曲线。 与一同示例的C-野生型和C-G29A与单克隆IgG-Fab的结合反应曲线(比较 例1，相同的蛋白质浓度)相比较可知，C-G29A的情况时还残留了与单克 隆IgG-Fab的结合信号，而例如C-G29V的情况时，与单克隆IgG-Fab的结 合信号几乎完全消失了。

在图2中，图示的结合反应曲线是从获得的结合反应曲线中减去了参照 池的结合反应曲线的结合反应曲线。按从下往上的顺序，3条反应曲线是添 加的蛋白质浓度为4μM、8μM、16μM时的反应曲线，将它们综合显示。 纵轴是结合响应差(RU)，横轴是时间(秒)。

表3中显示了各种C结构域变体与单克隆IgG-Fab的亲和常数。需要说 明的是，N.D.表示没能检测出结合信号。与C-G29A相比，C-G29V、C-G29L、 C-G29Y、C-G29F、C-G29T、C-G29W、C-G29D、C-G29E、C-G29R、C-G29H 和C-G29M表现出明显更低的亲和常数。此外，C-G29I没能检测出结合信 号。这表示，与C-G29A相比，对单克隆IgG-Fab的结合明显更弱。

[表3]

实施例10：各种B-G29X的耐碱性评估

关于各种B-G29X的耐碱性，通过在碱性条件下进行一段时间的孵育处 理后，比较对人IgG的结合量的降低程度(对人IgG的残留结合活性)来进 行评估。

针对各种B-G29X，使用Biacore 3000测定在碱处理前后与人IgG的结 合量。关于碱处理，向26.2μM的各种B结构域变体(10μL)中加入一定 量的0.625M NaOH，使最终浓度为0.5M，在30℃孵育20小时。之后，向 各种处理溶液中加入0.5M HCl(预先确定了pH恢复至中性的一定体积)进 行中和，用上样缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，150mM NaCl，0.005％ P-20，pH7.4)稀释2倍，制备了碱处理后的各种B-G29X溶液。就碱处理 前的各种B-G29X溶液而言，将碱处理时添加的NaOH溶液与中和处理时添 加的HCl溶液进行了预先混合的溶液，添加到26.2μM的各种B-G29X(10 μL)中，使得蛋白质浓度、溶液组成都相同，从而制备而成。关于传感芯片 的制备(人IgG的固定化等)、测定时的上样缓冲液、测定温度、芯片的再 生处理都与实施例7相同。将碱处理之前和处理之后的各种B-G29X溶液， 以20μL/min的流速150秒添加到传感芯片中。依次观测添加时(结合相， 150秒)和添加结束时(解离相，210秒)的结合反应曲线。解析方法与实 施例7相同，但补充了对所获得的结合参数的解释。此次的解析方法中，虽 然碱处理前后的蛋白质浓度相同，但与人IgG具有结合活性的蛋白质浓度发 生了变化。然而，由于浓度作为变量难以拟合，因此将在处理前后的浓度作 为定值进行了拟合。此时，与IgG具有结合活性的蛋白质浓度的变化反映在 表示最大结合容量的R_max上，计算各种B-G29X的碱处理后的R_max的相对 于碱处理前的R_max的相对值(残留的IgG结合活性[％])，通过进行比较，评 估耐碱性。

如图3所示，对于碱处理后残留的IgG结合活性，B-G29A(比较例1) 是41.2％，与此相对地，B-G29W是55.7％，明显更高，B-G29W表现出比 B-G29A高的耐碱性。

实施例11：各种C-G29X的耐碱性的评估

关于各种C-G29X的耐碱性，根据与实施例10相同的手段进行评估。但 是，碱处理时的孵育时间与实施例10不同，在30℃孵育25小时。

如图4所示，对于碱处理后残留的IgG结合活性，与C-G29A(比较例1) 相比，C-G29R、C-G29M、C-G29L、C-G29I、C-G29F、C-G29E、C-G29Y、 C-G29W更高。特别的是，C-G29M、C-G29F、C-G29Y、C-G29W的残留 的IgG结合活性高，表现出比C-G29A更高的耐碱性。

实施例12：制备编码5连接型C-G29V的DNA

从C-G29V进行5次连接而成的蛋白质的氨基酸序列(序列号57)进行 逆翻译，设计出编码所述蛋白质的碱基序列。考虑到使得所述蛋白质的密码 子使用频率与Brevibacillus choshinensis HPD31菌株中大量表达的细胞表层 蛋白HWP(Ebisu S.著，“J.Bacteriol.”1990年，第172期，1312-1320页) 的密码子使用频率接近，并且，考虑到使5个结构域之间的碱基序列的序列 同源性变低而分配密码子。此外，在编码5连接型结构域的序列的5’端制作 PstI、和在3’端制作XbaI的限制性酶识别位点。DNA片段的制备委托Takara  BIO公司完成。制备的DNA片段的序列记载在序列号58中。

图5中显示了5个结构域之间的碱基序列比对，表4中显示了用百分比 表示的各个结构域之间的碱基序列的序列同源性(对各结构域从N端起依次 赋予1-5的编号)。，相对于编码单个结构域单位的长度174bp，所匹配的碱 基数用百分比在表4中表示。分派到密码子的结果是，即使是最高的组合(结 构域2和结构域5)，碱基序列的序列同源性也低于85％。

用PstI和XbaI(均为Takara公司生产)消化编码所制备的5连接型 C-G29V的DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳分离、纯化。另一方面，将短芽 孢杆菌属细菌用的质粒载体pNK3262用PstI和XbaI消化，然后纯化回收， 再通过碱性磷酸酶(Takara公司生产)处理进行脱磷酸化处理。将两者混合 后，用Ligation High(TOYOBO公司生产)连接，构建5连接型C-G29V表 达质粒载体pNK3262-C-G29V。使用由上述操作获得的质粒载体进行桥石短 芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)FY-1菌株的转化。转化是通过已知的方 法由电导入法来实施的(“Biosci.Biotech.Biochem.J”，1997年，第61期， 202-203页)。此外，桥石短芽孢杆菌FY-1菌株是对桥石短芽孢杆菌 HPD31-OK菌株(特开平6-296485号公报)进行突变处理而获得的Phe、Tyr 需求性菌株。

[表4]

实施例13：对5连接型C-G29V表达重组菌中表达和保持目的蛋白的质粒载体的解析

将由实施例12获得的桥石短芽孢杆菌FY-1重组菌，利用5mL含有60 μg/mL新霉素的3YC培养基(多价蛋白胨3％、酵母提取物0.2％、葡萄糖 3％、硫酸镁0.01％、硫酸铁0.001％、氯化锰0.001％、氯化锌0.0001％)，在 30℃下振荡培养3天。

结束培养后，离心分离菌体，通过常规方法用SDS-PAGE解析5μL上 清液，如图6A所示，存在可认为是5连接型C-G29V的分子量约33000的 条带。没有观察到如将表达5连接型C-野生型(比较例2)重组菌的培养上 清液同样地通过SDS-PAGE分析时可见的(图6B)、表示视为是结构域数目 减少的蛋白质的存在的条带。

从由振荡培养而获得的菌体，用常规方法制备质粒，用PstI和XbaI消化， 用琼脂糖凝胶电泳解析时，如图7A所示，存在与编码5连接型C-G29V的 DNA片段相当的约890bp的片段。不存在如将5连接型C-野生型表达重组 菌的保持质粒载体(比较例2)同样地进行解析时可见的(图7B)、视为所 编码的结构域数是减少的这样大小的DNA片段。

在实施例2中，编码5连接的各个结构域的DNA片段的序列分别100％ 相同，但在本实施例中，作为密码子改变的结果，结构域之间的碱基序列的 序列同源性降低至85％以下。因此大幅度的抑制了分子内的同源重组，不引 起DNA片段的部分缺失，稳定了质粒。本实施例中，虽然以编码5连接型 C-野生型的DNA作为比较对象(比较例2)，但不是氨基酸序列为C-野生型 情况下和为C-G29V情况下的比较，而是将各个结构域之间的编码碱基序列 的序列同源性为100％相同的情况与序列同源性低于85％以下的情况的比 较。

实施例14：制备5连接型C-G29W、5连接型C-G29Y

从在实施例13制备的质粒pNK3262-C-G29V，将编码5次连接了的 C-G29V的基因切成5份，制备DNA片段使得含有各结构域的Val-29。分 别用PstI和NarI消化结构域1、NarI和HindIII消化结构域2、HindIII和 MluI消化结构域3、MluI和BglII消化结构域4、BglII和XbaI消化结构域5 (NarI为TOYOBO公司生产，其他均为Takara公司生产)，以琼脂糖凝胶 分离纯化，获得各种DNA片段(序列号59-63)。

采用与用于编码各个结构域的DNA片段时所使用的相同的2种限制性 酶消化克隆载体pSL301(Invitrogen公司生产)，将上述DNA片段混合后， 用Ligation High连接，构建具有切割成5份的DNA片段的质粒。与结构域 所附编号对应，各个质粒分别表述为pSL301-V29-d1、pSL301-V29-d2、 pSL301-V29-d3、pSL301-V29-d4、pSL301-V29-d5。

以pSL301-V29-d1、pSL301-V29-d2、pSL301-V29-d3、pSL301-V29-d4、 pSL301-V29-d5为模板，使用序列号64-73的寡核苷酸引物实施QuickChange 方法，制备含有各结构域的Val-29被Trp替换了的DNA片段(序列号74～78) 的质粒pSL301-W29-d1、pSL301-W29-d2、pSL301-W29-d3、pSL301-W29-d4、 pSL301-W29-d5，在确认已导入突变后，用Ligation High依次连接5个片段， 制作了编码5连接型C-G29W的DNA片段(序列号79)。

此外，以上述相同的手段，使用序列号80-89的寡核苷酸引物，制备含 有Val-29被Tyr替换了的DNA片段(序列号90-94)的质粒pSL301-Y29-d1、 pSL301-Y29-d2、pSL301-Y29-d3、pSL301-Y29-d4、pSL301-Y29-d5，在确认 已导入突变后，用Ligation High依次连接5个片段，制作了编码5连接型 C-G29Y的DNA片段(序列号95)。

将通过上述操作制备的编码5连接型C-G29W(序列号79)和5连接型 C-G29Y(序列号95)的DNA片段用PstI和XbaI消化，用琼脂糖凝胶电泳 分离、纯化。另一方面，将短芽孢杆菌属细菌用的质粒载体pNK3262用PstI 和XbaI消化，然后纯化回收，进而用碱性磷酸酶处理进行脱磷酸化处理。 将两者混合后，用Ligation High连接，获得5连接型C-G29W的表达质粒 pNK3262-C-G29W和5连接型C-G29Y的表达质粒pNK3262-C-G29Y。使用 这些质粒，进行桥石短芽孢杆菌FY-1菌株的转化。

将由上述操作获得的桥石短芽孢杆菌FY-1重组菌，用5mL含有60μ g/mL新霉素的3YC培养基，在30℃下振荡培养3天。结束培养后，离心分 离菌体，通过常规方法用SDS-PAGE解析5μL上清液，确认了认为是5 连接型C-G29W和5连接型C-G29Y的、各自分子量约为33000的条带。

比较例1：关于野生型和G29A变体的实验

针对具有实施例1中获得的C-野生型和实施例2中获得的B-野生型的表 达质粒的各个转化体，用与实施例5-6相同的方法，获得C-野生型和B-野 生型的纯化蛋白质溶液。此外，使用序列号96-97的引物，以与实施例3相 同的手段，获得具有C-G29A和B-G29A的表达质粒的各个转化体。用序列 号98显示C-G29A的蛋白质序列，用序列号99显示B-G29A的蛋白质序列。 以与实施例3相同的方法，确认编码DNA的碱基序列，以与实施例5-6相 同的方法，获得C-G29A和B-G29A的纯化蛋白质溶液。针对C-野生型和 C-G29A，与各种C-G29X同样地，作为对照实验，实施了与实施例7、9、 11相同步骤的实验。针对B-野生型和B-G29A，与各种B-G29X同样地，作 为对照实验，实施了与实施例7、10相同步骤的实验。

比较例2：关于5连接型C-野生型的实验

以编码野生型蛋白A的表达载体pNK3262NX为模板，用序列号100和 101的寡核苷酸引物进行PCR，扩增C-野生型的前半部分。此外，用序列号 102和103的寡核苷酸引物进行PCR，扩增C-野生型的后半部分。纯化两 PCR片段后，混合，在退火部位用序列号100和103的寡核苷酸引物使两片 段重叠，以此为模板，用序列号101和102的寡核苷酸引物进行第2次的 PCR。通过上述操作，制备C-野生型前半部分和后半部分交换的、并且在两 端存在HindIII识别位点的序列号104的DNA片段。用HindIII(Takara公 司生产)消化所获得的DNA片段后，进行纯化回收。

用HindIII消化大肠杆菌的克隆载体pBluescriptII KS(-)(Stratagene公司 生产)后，纯化回收，进而用碱性磷酸酶(Takara公司生产)处理进行脱磷 酸化处理。用DNA连接酶Ligation High(TOYOBO公司生产)连接HindIII 消化后的序列号104的DNA片段，构建质粒。用所获得的质粒进行大肠杆 菌HB101(Takara公司生产)的转化，通过常规方法扩增和提取质粒DNA。 用HindIII部分消化质粒DNA后，用琼脂糖凝胶分离纯化仅切断1处的DNA 片段，进而用碱性磷酸酶处理进行脱磷酸化处理。使用Ligation High将用 HindIII消化后的序列号104的DNA片段与所述质粒连接，同样进行大肠杆 菌HB101的转化，制备质粒DNA，获得这样的质粒DNA，所述质粒DNA 中组合了序列号104的DNA片段在HindIII位点2个串联连接而成的DNA 片段。

以上述操作获得的质粒DNA为模板，用序列号105和106的寡核苷酸 引物进行PCR。需要说明的是，序列号105和106表示的寡核苷酸引物是为 了如下而设计的：在C-野生型结构域的N端侧(Ala-1之前)添加 Met-Ala-Phe-Ala，在C端侧(Lys-58之后)具有终止密码子，以及在编码结 构域的DNA序列的5’侧具有XhoI和NcoI、在3’侧具有BamHI的限制性酶 识别位点。通过上述操作，扩增如下DNA片段，该DNA片段编码C-野生 型结构域，并在5’侧具有XhoI和NcoI、在中间附近具有HindIII、在3’侧具 有BamHI的限制性酶识别位点。用序列号107表示所获得的DNA序列。通 过限制性酶XhoI和BamHI(均为Takara公司生产)消化序列号107的DNA 片段后，进行纯化回收。

用XhoI和BamHI消化大肠杆菌的克隆载体pBluescriptII KS(-)后，纯化 回收，进而用碱性磷酸酶处理进行脱磷酸化处理。用Ligation High连接序列 号107的DNA片段和pBluescriptII KS(-)，进行大肠杆菌HB101的转化，通 过常规方法扩增和提取质粒DNA。

用HindIII消化通过上述方法制备的、包含编码C-野生型的DNA片段的 质粒后，纯化回收，进而用碱性磷酸酶处理进行脱磷酸化处理。使用Ligation  High将其与序列号104表示的DNA片段连接，构建具有编码2个串联连接 而成的C-野生型的DNA片段的质粒。用所获得的质粒进行大肠杆菌HB101 的转化，通过常规方法扩增和提取质粒DNA。用HindIII部分消化提取的质 粒后，用琼脂糖凝胶分离纯化仅切断1处的DNA片段，进而用碱性磷酸酶 处理进行脱磷酸化处理。使用Ligation High将其与序列号104表示的DNA 片段连接，构建具有编码3个串联连接而成的C-野生型的DNA片段的质粒。 以下，以同样的方法，构建具有编码5个串联连接而成的C-野生型的DNA 片段的质粒，进行大肠杆菌HB101的转化，通过常规方法扩增和提取质粒 DNA。用NcoI和BamHI(均为Takara公司生产)消化所述质粒后，用琼脂 糖凝胶分离纯化，制备编码5连接型C-野生型的DNA片段。

用NcoI和BamHI消化短芽孢杆菌属细菌用的质粒载体pNK3262后，纯 化回收，进而用碱性磷酸酶处理进行脱磷酸化。用Ligation High连接之前制 备的编码5连接型C-野生型的DNA片段，构建5连接型C-野生型的表达质 粒载体pNK3262-C-野生型。使用通过上述操作获得的质粒载体，进行桥石 短芽孢杆菌FY-1菌株的转化。

用5mL含有60μg/mL新霉素的3YC培养基，将由上述操作获得的桥 石短芽孢杆菌FY-1重组菌在30℃下振荡培养3天。结束培养后，离心分离 菌体，通过常规方法用SDS-PAGE解析5μL上清液。如图6B所示，除可 视为5连接型C-野生型的5聚体的分子量约33000的条带外，还确认了存在 提示连接结构域数减少为4个、3个、2个的蛋白质的条带。

由通过振荡培养而获得的菌体，以常规方法制备质粒，用NcoI和BamHI 消化并用琼脂糖凝胶电泳解析。如图7B所示，除显示与编码5连接型C-野生 型的DNA片段相当的约890bp的片段的条带的存在外，还确认了这样的条 带，所述条带提示与相连接的结构域数为4个、3个、2个相当的这样大小的 DNA片段的存在。所述电泳图谱与SDS-PAGE所得的蛋白质的条带的图谱 非常一致。解析这些DNA片段序列的结果可知，结构域单元中产生了基因部 分缺失。因为编码5连接型C-野生型的各个结构域的DNA片段的序列分别 100％相同，所以可认为在质粒分子内容易产生同源重组，出现结构域数目 减少了的质粒载体，其结果使得由它们分别翻译出的蛋白质混合存在。