猪雌激素受体基因快速分型试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种猪雌激素受体基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRM PCR预混液和Nuclease-free dH

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪雌激素受体基因快速分型试剂盒及其检测方法，属于生物技术 领域。

背景技术

雌激素(estrogen)主要是由卵泡的颗粒细胞和内膜细胞合成与分泌的，在动物 繁殖过程中具有重要的生理作用。1994年，Rothschild等发现雌激素受体基因 (estrogen receptor，ESR)是猪产仔数性状的主效基因或与产仔数主基因紧密连锁的 基因，将猪的雌激素受体基因定位于猪1号染色体的p24～p25区域，并在PvuII酶 切位点上将该基因分为AA、BB和AB三种基因型，分析发现BB基因型为产仔数有利 基因型，比AA型母猪总产仔数和产活仔数分别高出1.40～3.37头和0.63～3.58头。 后来研究表明，雌激素受体基因的PvuII酶切多态性是由于该基因T1665G点突变造成 的。雌激素受体基因作为影响猪产仔数的主效基因已经广泛用于猪的标记辅助选择 (Marker-assisted selection)，据欧盟2008年统计数据显示，在欧盟25国，每年有 120～480万只猪接受雌激素受体基因的筛选，在中国虽然没有详细的统计调查，但是 雌激素受体基因标记辅助选择也广泛应用于各大商业猪场。随着雌激素受体基因标记辅 助选择的普及，迫切需要一种高效率，高通量且高准确率的技术来解决如此庞大规模的 基因分型。

高分辨率熔解(High Resolution Melt，HRM)是一种最新的遗传学分析方法，主 要是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样 品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。主要是依赖于精确的检测DNA 双链熔解荧光曲线，如同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，从而对样品进行检测，HRM源于熔解曲线，原理与普通熔解曲线分析是 一致的，二者不同之处主要表现在升温速率和所用的染料。HRM用的是饱和染料(dye EvaGreen)，高浓度的染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会 发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。HRM技术特别适用于样本量多、检测位 点较少的SNP、突变或甲基化分析，是不同于基因芯片检测方法(检测位点多，样本少) 的高通量方法。HRM检测SNP是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性， 期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都 有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很 高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合 子。HRM的特点和优势是：无需序列特异性探针；操作简便、快速，使用成本低；可对 未知位点进行筛查；较高通量；高灵敏度；特异性、重复性好；适用范围广。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面。凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅 速普及。

对于猪雌激素受体基因T1665G突变进行基因分型的传统方法有聚合酶链式反应结 合限制性内切酶片段长度多态性法(PCR-RFLP)，聚合酶链式反应结合单链构象多态性 法(PCR-SSCP)，其中PCR-RFLP法最为常用，该方法通常按照以下步骤进行：步骤一、 对待检样本进行预处理，提取基因组DNA；步骤二、特异性引物的制备：设计和合成上、 下游引物一对，用于PCR扩增特定片断(片段必须包括雌激素受体基因的1665位点)； 步骤三、PCR扩增目DNA片段；步骤四、根据扩增片段上的限制性酶切位点，用特异的 限制性内切酶对扩增片段进行酶切；步骤五、对酶切产物进行凝胶电泳检测，分析待测 样本的基因型。PCR-RFLP法由于步骤繁琐且酶切反应后需要进行凝胶电泳检测，使其耗 时长、通量小且准确性受主观因素影响，一直很难适用于大规模的雌激素受体基因筛选。 仅对单个样本进行检测，传统的PCR-RFLP法需要14～16小时，如果对于大批量的样 本进行扫描分型，工作量和耗时都是无法想象的。

发明内容

本发明旨在克服上述传统方法的技术缺陷，基于HRM技术，提供一种猪雌激素受 体基因快速分型试剂盒及其检测方法。该方法通量大，特异性强，重复性好，准确率高 且鉴定简便快捷。

本发明中的这种猪雌激素受体基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRM PCR预混液和Nuclease-free dH₂O。

其中引物预混液：混合液中两条引物浓度均为10μM，引物序列如下：

上游引物：GCAGAATCAAGTTTTATGAGACCA；

下游引物：CGAGGGTCAGTCCAATTAGAA；

HRM PCR预混液：成分及体积比例如下：

HotStar Taq DNA Polymerase(5U/μl)∶10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)∶dNTP Mixture(各2.5mM)∶EvaGreen dye(1.2μM)＝1∶1∶2∶6。

本发明提供的一种猪雌激素受体基因快速分型检测方法，包括以下步骤：

步骤1：将引物预混液、HRM PCR预混液、Nuclease-free dH₂O以及提前抽提好的 DNA样本从-20℃冰箱中取出并在冰上融化；

步骤2：配制反应预混液；预混液体积根据待检样本的数量而定；

步骤3：将反应预混液混合均匀，并根据所需的体积分装到PCR管中；

步骤4：向分装好反应预混液的PCR中添加样本DNA模板，并轻轻混匀；

步骤5：根据优化程序，调置好荧光定量仪的工作程序；

步骤6：将配制好的PCR管放到荧光定量PCR仪上，启动HRM程序；

步骤7：数据分析

本发明利用高分辨率溶解曲线技术，结合优化设计的引物和反应程序，能够准确地 对待测样本进行雌激素受体基因分型，通过详细的测试，本方法的准确率为98.33％，高于 传统的PCR-RFLP法(98.00％).

该发明高效迅速，操作步骤简单，只需要一个PCR反应和半个小时的溶解曲线分析 即可完成，大大缩短了雌激素受体基因分型所需要的时间。对于单个样本，传统的 PCR-RFLP法需要12-16小时，而本方法将所需时长缩短到2小时以内。

本发明方法价格与传统PCR-RFLP法相当，所需费用不到2.5元/样品，而传统的 方法也需要约2.1元/样品。

本发明的方法完全闭管操作，可以避免繁琐的开管操作带来的外源污染，大大降 低了假阳性结果的出现。

本发明方法通量大，一次可以同时对96或者384个样本进行基因分型检测，适用 于猪雌激素受体基因的大规模筛查，特别适用于大型商业猪场。

附图说明

图1为标准化后的溶解曲线图；

图2为用本发明中特异性引物对雌激素受体基因三种基因型进行扩增后的溶解峰 图

图3为15个猪DNA样品的雌激素受体基因分型结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

猪雌激素受体基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRM PCR预混液和 Nuclease-free dH₂O。

其中引物预混液：混合液中两条引物浓度均为10μM，引物序列如下：

上游引物：GCAGAATCAAGTTTTATGAGACCA；

下游引物：CGAGGGTCAGTCCAATTAGAA；

HRM PCR预混液：成分及体积比例如下：

HotStar Taq DNA Polymerase(5U/μl)∶10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)∶dNTP Mixture(各2.5mM)∶EvaGreen dye(1.2μM)＝1∶1∶2∶6。

实施例2

用上述试剂盒对猪雌激素受体基因快速分型步骤如下：

步骤1：将引物预混液、HRM PCR预混液、Nuclease-free dH₂O以及提前抽提好的 DNA样本(需要自行抽提，本试剂盒不提供抽提试剂和方法)从-20℃冰箱中取出并在 冰上融化；

步骤2：按照表1配制反应预混液。预混液体积根据待检样本的数量而定，但是考 虑配制分装过程中无法避免的损耗，建议在理论体积基础上多配置10％的反应预混液；

表1反应体系

步骤3：将反应预混液混合均匀，并根据所需的体积分装到PCR管中；

步骤4：向分装好反应预混液的PCR中添加样本DNA模板，并轻轻混匀；

步骤5：根据表2或表3所列出的优化程序，调置好荧光定量仪的工作程序。没有 在列的荧光定量仪也可以参照此程序进行，但是需要自行优化程序。

表2针对Rotor-Gene Q and Rotor-Gene 6000优化的程序

表3针对LightCycler 480优化的程序

步骤6：将配制好的PCR管放到荧光定量PCR仪上，启动HRM程序；

步骤7：数据分析。使用仪器配套的高分辨率溶解曲线分析软件对获得的数据进行 分析，得到待测样本的基因型。具体的分型效果如图1所示。如图1中所示，本试剂盒 能够清晰准确地区分出猪雌激素受体基因的三种基因型。BB型个体由于是雌激素受体基 因的阳性纯合子，其扩增片段溶解温度(Tm)最高，溶解曲线也相应在最右边；AA型个 体是雌激素受体基因阴性纯合子，其扩增片段的溶解温度(Tm)最低，溶解曲线相应在 最左边；AB为雌激素受体基因杂合子，溶解温度居中，溶解曲线也相应居中。

本发明中HRM PCR预混液经过优化配比，能够获得最优的扩增效率和特异性。针对 不同的仪器平台，本发明提供了相应的最优化的HRM程序，使分型结果准确可靠。本发 明采用优化设计的特异性引物，该引物特异性好，无非特异性扩增，如图2所示，该 引物对猪雌激素受体基因三种基因型样本扩增，产物的溶解峰图峰值单一，没有非特异 性的峰值出现，说明该引物特异性很好。

实施例3

利用本试剂盒对15个浓度为25ng/μl的猪DNA样本进行雌激素受体基因分型检 测：

步骤1：将引物预混液、HRM PCR预混液、Nuclease-free dH2O以及提前抽提好的 DNA样本从-20℃冰箱中取出并在冰上融化；

步骤2：按照表4配制反应预混液。在理论体积基础上多配置10％的反应预混液；

表4反应体系

步骤3：将反应预混液混合均匀，并根据所需的体积分装到15个PCR管，每管分装 9μl；

步骤4：向分装好反应预混液的PCR管中添加样本DNA模板，每个样品添加1μl， 并轻轻混匀；

步骤5：根据表5所列出的优化程序，调置好荧光定量仪的工作程序。

表5针对Rotor-Gene Q优化的程序

步骤6：将配制好的PCR管放到荧光定量PCR仪上，启动HRM程序；

步骤7：数据分析。使用仪器配套的高分辨率溶解曲线分析软件对获得的数据进行 分析，得到待测样本的基因型。分型结果如图3所示，三种基因型界限清晰，分型结果 明确，分析结果可以直接用于猪雌激素受体基因的标记辅助选择。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。