一种诱导烟草疫霉产生致病性分泌蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种诱导烟草疫霉产生致病性分泌蛋白的方法。其方法是将烟草黑胫病样带回实验室，用自来水冲洗干净病株茎秆表面。待风干后从病健交界处取0.4cm×0.4cm髓部组织块置于燕麦培养基，置于28℃黑暗条件下培养3～4天，形成较大的菌落后，将菌丝块转接到300mL分泌蛋白液体诱导培养基中，于28℃，120rpm振荡培养2周，用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经5000rpm离心10min，上清液加入硫酸铵，10000rpm离心20min，沉淀经透析处理，冻干后获得烟草疫霉的分泌蛋白，-20℃保存。此方法可以诱导烟草疫霉菌大量产生致病性分泌蛋白，填补了国内外烟草疫霉致病机理研究中不能获得分泌蛋白的空白，具有重大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，具体地说是一种诱导烟草疫霉产生致病性分泌蛋白的方法。

背景技术

由Phytophthora parasiticavar.nicotiana 引起的烟草黑胫病是烟草生产上毁灭性病害之一，世界各地的烟草种植区均有发生，每年可造成数百亿美元的损失，因此受到世界各国烟草育种学家、植物病理学家、遗传学家的广泛关注。烟草疫霉同时还是遗传学和分子生物学的良好实验材料，该病害系统是真菌-植物互作研究的模式系统，近年来的研究获得了许多与该病原菌侵染相关的形态分化和致病因子的遗传资源与信息，为烟草疫霉菌基因组学研究打下了良好基础。

通过致病相关基因的功能研究，可深入了解烟草疫霉菌的致病机制、并以此为途径寻找烟草中与该病原菌致病基因相对应的抗性基因，研究寄主-病原物互作机制和抗病机制，预测该病菌群体中致病基因分布、多样性栽培条件下致病基因的表达和变化、诱导过敏反应的功能域与致病功能域的关系，预测烟草中相应抗病基因的抗性持久性。通过鉴定致病基因控制的致病相关因子，可以寻找杀菌剂的作用靶点，最终为有效控制烟草黑胫病提出新的策略。但是多年研究结果表明，目前还没有能够诱导烟草疫霉菌产生致病性分泌蛋白的方法，从而无法确定其致病相关因子，限制了对其致病机理的深入研究。

发明内容

本发明的目的是克服烟草疫霉菌在固体培养条件下无法产生分泌蛋白的不足，提供一种能够诱导烟草疫霉病菌产生致病性分泌蛋白的方法。

  本发明的诱导烟草疫霉菌产生致病性分泌蛋白的方法是按以下步骤进行：

（1）将烟草黑胫病样用自来水冲洗干净病株茎秆表面，待风干后从病健交界处取0.4cm×0.4cm髓部组织块置于燕麦培养基，置于28℃黑暗条件下培养3～4天，再接种到燕麦培养基上，置于28℃黑暗条件下培养3～4天；形成较大的菌落；

（2）形成较大的菌落后，将菌丝块转接到300mL分泌蛋白液体诱导培养基；分泌蛋白液体诱导培养基由以下部分组成：酵母浸膏0.5 -1mg/L、葡萄糖 25-30g /L、NaH₂PO4 0.5－0.75g/L、MgSO4·7H₂O 0.25－0.4g/L、天门冬酰胺 1.5－2g/L、VB1 1.5－2mg/L、H₂O 1L，于28℃，120rpm振荡培养2周；

（3）用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经5000rpm离心20min，上清液加入100%饱和硫酸铵溶液，于10000 rpm离心30min，沉淀经1KD（透析带截流范围）透析带处理，冻干后获得烟草疫霉致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存；

（4）将得到的蛋白提取物用100μl除离子水溶解后，在成株期烟草叶片上进行接种实验，验证所提取蛋白的特性。

本发明的有益效果是解决了烟草疫霉菌在人工培养条件下不产生致病性分泌蛋白的问题，通过对液体培养基配方调整，加入少量无机盐及氨基酸，从而诱导烟草疫霉菌大量产生致病性分泌蛋白。通过对这些分泌蛋白的分离和提纯，可以深入研究烟草疫霉与寄主之间在蛋白质水平上的相互作用，最终揭示二者在基因水平上的相互识别、信号传导等机理，对于烟草黑胫病致病机理的研究具有重要意义。

具体实施方式

将分离得到的烟草疫霉菌在燕麦固体培养基上培养，然后转入致病性分泌蛋白液体诱导培养基中培养，最后提取烟草疫霉菌致病性分泌蛋白，蛋白提取物在烟草叶片上接种，调查坏死斑。

实施例 1：

将烟草黑胫病样带回实验室，用自来水冲洗干净病株茎秆表面。待风干后从病健交界处取0.4cm×0.4cm髓部组织块置于燕麦培养基，置于28℃黑暗条件下培养3～4天。燕麦培养基由以下部分组成：燕麦片30g，琼脂20g，蒸馏水1000ml；将分离获得的烟草疫霉病菌弱致病性菌株Y1接种到由燕麦片30g，琼脂20g，蒸馏水1000ml组成的普通固体培养基上，置于28℃黑暗条件下培养3～4天；形成较大的菌落后，将菌丝块转接到300mL致病性分泌蛋白液体诱导培养基中,该培养基由以下部分组成：酵母浸膏0.5 mg/L、葡萄糖 25g /L、NaH₂PO4 0.5g/L、MgSO4·7H₂O 0.25g/L、天门冬酰胺 1.5g/L、VB1 1.5mg/L、H₂O 1L，于28℃，120rpm振荡培养2周；用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经5000rpm离心20min，上清液加入100%饱和硫酸铵溶液，10000 rpm离心30min，沉淀经1KD透析带处理，冻干后获得烟草疫霉分泌蛋白提取物，-20℃保存。

实施例 2：

将分离获得的烟草疫霉病菌强致病性菌株Y2、Y3接种到由燕麦片30g，琼脂20g，蒸馏水1000ml组成的普通固体培养基上，置于28℃黑暗条件下培养3～4天；形成较大的菌落后，将菌丝块转接到300mL由致病性分泌蛋白液体诱导培养基中,该培养基由以下部分组成：酵母浸膏1 mg/L、葡萄糖 30g /L、NaH₂PO4 0.75g/L、MgSO4·7H₂O 0.4g/L、天门冬酰胺 2g/L、VB1 2mg/L、H₂O 1L，于28℃，120rpm振荡培养2周；用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经5000rpm离心20min，上清液加入100%饱和硫酸铵溶液，10000 rpm离心30min，沉淀经1KD透析带处理，冻干后获得烟草疫霉分泌蛋白提取物，-20℃保存。

将上述实施例1、实施例2所提取、保存的分泌蛋白接种到烟草品种K326上，接种7天后调查坏死斑大小，结果表明坏死病斑由内至外，依次形成灰白斑、水渍圈和褐斑圈的感病症状，而且菌株致病性越强，诱导蛋白致病性也越强。坏死斑大小见下表：

烟草疫霉菌株坏死斑直径大小（毫米）Y12.15±0.35～3.23±0.11Y2、Y34.05±0.44～6.24±0.78CK1.25±0.20～1.58±0.13

上述结果表明，通过本方法诱导不同致病性的烟草疫霉菌株产生的分泌蛋白，对广泛种植的烟草品种K326均有致病作用，这对烟草疫霉菌致病性分泌蛋白的研究具有重要作用。