血管生长素作为血管瘤血清标志物的应用

摘要

本发明公开了血管生长素(angiogenin，ANG)作为新血管瘤血清标志物的应用，即提供一种新型的血管瘤血清标志物ANG，其与血管瘤病程密切相关，且具有很强的特异度和敏感性，检测患儿外周血ANG水平能在临床上监测血管瘤的增殖特性，有助于临床监测血管瘤增生早期和治疗稳定期的瘤体增殖潜能，辅助临床上治疗时机、治疗方式及停药时间的决策，平衡临床治疗的有效性和安全性，从而提高血管瘤综合治疗水平。

说明书

【技术领域】

本发明涉及血管生长素(Angiogenin，ANG)作为血管瘤新血清标志物的用途。

【背景技术】

血管瘤是最常见的婴幼儿良性肿瘤。在中国，新生儿发病率为1％，在欧美白人中则不低于3％。其独特的自然病程，尚不满意的治疗现状，以及作为独一无二的人类血管生成天然模型，使之成为国内外学者研究的热点。

目前，已经公认的血管瘤标志物(如葡萄糖转运蛋白1)主要基于病理标本的研究，必须进行活检或手术切除，同时，因不同取材部位瘤体的增殖特性不同，势必影响结果的可靠性和准确性。目前已发现血管瘤患儿体液中存在异常增高的因子，如外周血循环中的内皮祖细胞、血清中的雌激素、基质金属蛋白酶(MMP)以及尿液中的MMP和bFGF等。这些异常增高的因子与血管瘤的发生发展机制存在一定的联系，但无法敏感特异地反映血管瘤的增殖特性，也无法预测瘤体增殖潜能及治疗预后。目前除我们新发现的血管生长素(Angiogenin，ANG)以外，尚未发现与血管瘤病程密切相关、特异度敏感度较强的血清标志物。

ANG是一种由缺氧诱导的关键的分泌型血管生成因子，其作用类似于VEGF，(参见Russo N，Shapiro R，Acharya KR，Riordan JF，Vallee BL.Role ofglutamine-117 in the ribonucleolytic activity of human angiogenin.Proc Natl AcadSci USA.1994；91(8)：2920-2924.)参与肿瘤的发生、发展过程，具有促进瘤体增殖的作用。在一些肿瘤的临床早期监测和预后判断中，血清ANG浓度具有反映多种肿瘤细胞增殖及病理性血管生成特性的作用。2009年研究发现ANG可作为监测冠脉硬化致心肌缺血的血清标志物(参见Patel JV，Abraheem A，Chackathayil J，et al.Circulating biomarkers of angiogenesis as indicators of leftventricular systolic dysfunction amongst patients with coronary artery disease.JIntern Med.2009，265：562-567.)。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是，提供一种新型的血管瘤血清标志物ANG。

为了解决上述问题，本发明提供了血管生长素ANG在血管瘤血清标志物中的应用。

在临床实践中，我们观察到非常奇特的现象：多发性血管瘤，即生后数天内皮肤上出现一个小红点，之后迅速增大，很短时间内其他部位“不约而同”地出现两个或多个增殖病灶。这种现象在临床血管瘤病例中达到20％。受此启发，我们认为血清中的一些血管瘤相关因子可能影响或密切伴随着血管瘤的发生发展。

在此思路下，本课题组是国内外血管瘤血清学标志物检测的最早发现和倡导者之一。最初的实验中，我们利用cDNA表达谱基因芯片(4096条待测基因)，初步筛选出与血管瘤血管形成密切相关的15个差异表达基因，并发现增生期血管瘤患儿血清VEGF水平高于退化期及正常水平(参见Zhang Li，LinXiaoxi，Wang Wei，et al.Circulating Level of Vascular Endothelial Growth Factor inDifferentiating Hemangioma from Vascular Malformation Patients.Plast ReconstrSurg.2005，116：200-204.)，该研究结果被国际脉管病研究学会(ISSVA)发布的分类文件引用(参见Odile Enjolras，Michel Wassef：Introduciton：ISSVAclassification.Color atlas of vascular tumors and vascular malformations.P1-11，2007，New York，NY，USA.)，这是本课题的重要研究基础，进一步提示血管瘤患儿血清中可能存在更特异的血清标志物。

目前认为，在血管瘤发生、发展的复杂过程中，可能存在着一个相互协调的共表达的基因群体。要了解血管瘤从增生转变为消退过程中的分子机制，就要研究这一基因群体的动态变化，由此可筛选出血清标志物，甚至起调控作用的关键基因。基因芯片的大规模、高通量系统筛查恰恰满足了这一要求，并能避免对已报道因子进行血清检测，消除指标选择上的偏倚(参见Scott CP，VanWye J，McDonald MD，et al.Technical analysis of cDNA microarrays.PLoSONE.2009，4：e4486.)。

基因芯片技术不断完善，在血管瘤中的也有应用，但尚未应用于系统全面地筛查血管瘤血清标志物。本课题通过基因芯片检测取自同一血管瘤患儿的增生期和退化期自身对照标本，获得较可靠的增生期和退化期间的差异表达基因，再针对其中编码分泌蛋白的基因进行筛查，从而系统全面地筛查血管瘤血清标志物。

肿瘤标志物(tumor marker，TM)是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成、分泌的，或因机体对肿瘤反应而异常产生和(或)升高的反映肿瘤存在和生长的一类物质。这些物质可在肿瘤患者组织、体液、排泄物中检测出来。较好的血清肿瘤标志物与病程及治疗预后相关，特异度、敏感度较强，可作为监测病程、评估疗效、预防复发的重要监测指标。

分泌蛋白是指在细胞内合成并分泌至细胞外发挥作用的一类蛋白质，如酶、抗体、细胞因子、神经肽、部分激素等。它仅占人体蛋白的十分之一，是一类功能非常重要的蛋白，参与了细胞的生长发育、形态发生、信号传导、细胞分化凋亡、血管生成、肿瘤发生等多种过程。

由此可见，由瘤体细胞的基因表达而合成分泌于血清的肿瘤标志物，均属分泌蛋白。本课题针对分泌蛋白筛选血清标志物，创新性实践了从组织的差异表达基因寻找血清标志物的捷径，该方法已在同日申请的另一份发明专利申请“应用基因芯片检测肿瘤组织筛查肿瘤血清标志物的方法”中公开，将差异表达基因的筛选范围缩小约10倍，而且提高了血清学验证的成功率，从而解决了基因筛选过程中工作量大，但准确率较低的难题。此筛选方法对利用基因芯片寻找其他肿瘤血清标志物的研究具借鉴意义。

本发明的优点在于，本发明公开了一种新型的血管瘤血清标志物ANG，其血清浓度与血管瘤病程密切相关，且具有很强的特异度和敏感性，能在不同程度上区分出增生期血管瘤和正常婴幼儿、血管瘤和静脉畸形、以及血管瘤增生期和退化期。ANG作为一种缺氧诱导的分泌型血管生成因子，与肿瘤细胞的增殖、侵袭及血管生成紧密相关，处于血管生成调控网络的枢纽环节，并且由内皮细胞分泌至其血清。因此，检测患儿外周血ANG水平能在临床上监测血管瘤的增殖特性，有助于临床监测血管瘤增生早期和治疗稳定期的瘤体增殖潜能，辅助临床上治疗时机、治疗方式及停药时间的决策，平衡临床治疗的有效性和安全性，从而提高血管瘤综合治疗水平。

【附图说明】

图1为血管瘤增生退化期差异表达基因聚类图，示意新的血清标志物ANG筛选过程：(A)表示68个差异表达基因，(B)表示放大显示含ANG的部分差异表达基因，(C)表示筛出的ANG等4个编码分泌蛋白的基因。

图2为ELISA法检测各组血清ANG浓度均值比较：增生期组(PH，n＝46)高于退化期组(IH，n＝23)，退化期组高于正常对照组(control，n＝31)，增生期组和退化期组均高于静脉畸形组(VM，n＝20)。

图3为ROC曲线分析显示增生组和其他各组的最佳ANG临界浓度及相应的敏感度和特异度：A.表示与正常对照组相比，B.表示与静脉畸形组相比，C.表示与退化组相比。

图4为实时定量RT-PCR验证ANG在血管瘤组织中mRNA水平上的表达。实验结果显示增生期组(PH，n＝6)血管瘤组织中mRNA水平上ANG的表达高于退化期(IH，n＝5)组和正常对照组(control，n＝5)(P＜0.001)。

图5为免疫组织化学染色验证ANG蛋白在血管瘤组织中的表达。实验结果显示增生期组(上行，n＝26)血管瘤血管内皮细胞呈胞浆内强阳性表达(胞浆内呈现棕黄色颗粒为免疫组化染色阳性)，退化期组(中行，n＝25)血管瘤血管内皮细胞呈胞浆内中等阳性表达，正常对照组(下行，n＝15)呈阴性表达，提示增生期血管瘤组织中蛋白水平上ANG的表达高于退化期组和正常对照组。图中左列放大200倍，右列放大400倍。

图6为Western blotting验证ANG蛋白在血管瘤组织中的表达。实验结果显示增生期组(PH，n＝7)血管瘤组织中ANG蛋白定量高于退化期组(IH，n＝6)和正常对照组(control，n＝6)(P＜0.05)。A.显示三组蛋白印迹条带，B.显示三组蛋白相对定量统计比较，均以β-actin为内参。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式做详细说明。

实施例1

从同一血管瘤增生、退化期自身对照标本的基因芯片结果中，筛查得4个有意义的编码分泌蛋白的基因(见图1)。经ELISA法检测增生、退化期血管瘤、静脉畸形及正常对照4组血清中各分泌蛋白浓度，发现增生期组血清ANG浓度高于退化期组(P＜0.01)，退化期组高于正常对照组(P＜0.001)，增生期组和退化期组均高于静脉畸形组(P值分别小于0.001、0.01)(图2)。ROC曲线分析显示血清ANG浓度与血管瘤增生退化病程密切相关，且特异性敏感性强(表1，图3)。

之后，以实时定量RT-PCR(图4)、免疫组织化学(图5)及Western blotting(图6)验证ANG在血管瘤组织中的表达，实验结果显示增生期血管瘤组织的mRNA及蛋白水平上ANG的表达均高于退化期组和正常对照组。

上述实验充分验证ANG为一种新型的血管瘤血清标志物。

表1.ROC曲线分析显示增生组和其他各组的最佳ANG临界浓度及相应的敏感度和特异度

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。