鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对及其应用

摘要

本发明公开了鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对及其应用。本发明所提供的引物对为鉴定或辅助鉴定牛、羊、猪、鸡和鸭组织和/或器官的共五个PCR引物对中，包含鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对在内的至少一种引物对；所述鉴定或辅助鉴定猪、牛、羊、鸡和鸭组织和/或器官的共五个PCR引物对依次分别由序列表中序列1和序列2所示的两条DNA单链、序列3和序列4所示的两条DNA单链组成、序列5和序列6所示的两条DNA单链、序列7和序列8所示的两条DNA单链、序列9和序列10所示的两条DNA单链组成。本发明五个引物对均选用了62℃的退火温度，实现了在同一温度一次PCR完成所有鉴别，且特异性强，检测过程耗时短。

说明书

技术领域

本发明涉及鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对及其应用，特别涉 及可以鉴定或辅助鉴定牛、羊、猪、鸡和鸭这五种动物中至少一种动物的组织和/或器 官的PCR引物对。

背景技术

目前在国内生肉和肉制品的生产和销售领域，一些不法商贩为了牟取暴利，利用 掺杂掺假等手段欺骗消费者的事件时有发生。比如用猪肉冒充羊肉、猪肉冒充牛肉以 及用鸡肉或鸭肉冒充其它价格较高肉类等。因此一套快速、准确鉴别肉种类，并且能 够适应混合肉制品鉴定的方法，无疑会为执法人员提供了强大的技术支撑。

传统的肉制品鉴定的方法主要是基于蛋白质水平的分析，包括电泳法、免疫法、 ELISA等技术。操作过程中首先需制备相应物种的抗体，然后抗原和抗体间进行免疫 反应，最后通过电泳或者显色等方法进行鉴别。这类鉴别技术受蛋白质(主要起作用 的部分为抗原决定簇)结构的影响很大，实际应用中经常出现的问题包括：1.热加工 过程会改变蛋白质(抗原决定簇)的结构，因而无法检测热加工的肉类；2.对混合肉 类的检测可能出现交叉反应，因为不同物种蛋白质的结构可能具有某种程度的相似性， 检验的灵敏程度取决于制备的抗体的特异性强弱。

基于以上原因，以核酸为基础的检测方法成为近几年食品检测领域的发展方向， 包括DNA分子杂交法和PCR方法等。DNA分子杂交法操作复杂，且成本较高，目前 已逐渐被PCR方法所取代。PCR方法灵敏度高、特异性强，可对混合肉类进行鉴别和 区分，即使掺杂少量异种肉，也能用PCR方法加以鉴别；PCR方法可用于热加工的肉 制品鉴别当中，高温过程仅仅打断了核酸的片断，并不会完全降解核酸，因而热加工 的肉制品当中仍然存在可扩增的模板，这在饲料工业肉骨粉来源的鉴别过程中得到了 很好的证实；PCR反应的迅速，结果易于观测，使得这种检测方法目前广泛应用在饲 料、保健品的动物源性成分的鉴别当中。目前，也有使用PCR方法进行牛、羊、猪、 鸡、鸭等肉类鉴别的报道，但普遍着重于单个肉种，系统性较差；即使将方法整合， 在PCR鉴别过程中，不同肉种的退火温度同一性较差，需要进行多个退火温度，进行 不同PCR反应才能进行判断。

PCR技术中，引物设计是PCR成功的关键因素，好的引物将使检测实验更加快捷， 结果更加清晰。

发明内容

本发明的目的是提供鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对或引物对 组合物，以及利用所述引物对或引物对组合物鉴定待测动物组织和/或器官中是否含有 牛、羊、猪、鸡和鸭这五种动物中至少一种动物的组织和/或器官的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对既可为鉴定或 辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对，也可为在含有鉴定或辅助鉴定猪组织和/或 器官的PCR引物对的前提下，再含有鉴定或辅助鉴定猪、牛、羊、鸡、鸭组织和/或 器官的5个PCR引物对中其余四个引物对中的全部、或任意三对、或任意两对、或任 一对形成的引物对组合物。具体分为如下五种：

1、鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的五个 引物对组成，第一对引物是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的 鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对，第二对引物是由序列表中序列3和 序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对， 第三对引物是由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴 定羊组织和/或器官的PCR引物对，第四对引物是由序列表中序列7和序列8所示的 两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对，第五对引物是 由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸭组织和/ 或器官的PCR引物对；所述动物为牛、羊、猪、鸡、鸭中的至少一种。

2、鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的四个 引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组 成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对，另外三个引物对为下述四个引 物对中的任三个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅 助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列5和序列6所示的两条单链 DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列7和序 列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对、由 序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器 官的PCR引物对；所述动物为牛、羊、猪、鸡、鸭中的至少一种。

3、鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的三个 引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组 成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对，另外二个引物对为下述四个引 物对中的任二个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅 助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列5和序列6所示的两条单链 DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列7和序 列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对、由 序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器 官的PCR引物对；所述动物为牛、羊、猪、鸡、鸭中的至少一种。

4、鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的二个 引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组 成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对，另外一个引物对为下述四个引 物对中的任一个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅 助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列5和序列6所示的两条单链 DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列7和序 列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对、由 序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器 官的PCR引物对；所述动物为牛、羊、猪、鸡、鸭中的至少一种。

上述1中所述五个引物对在PCR反应体系中的配比为1∶1∶1∶1∶1；上述2中 所述四个引物对在PCR反应体系中的配比为1∶1∶1∶1；上述3中所述三个引物对 在PCR反应体系中的配比为1∶1∶1；上述4中所述二个引物对在PCR反应体系中的 配比为1∶1。

5、鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对，由两条单链DNA组成，所 述两条DNA单链分别为序列表中序列1所示的单链DNA，和序列表中序列2所示的 单链DNA。

其中，序列表中的序列1由24个核苷酸组成，序列2由26个核苷酸组成，序列 3由24个核苷酸组成，序列4由22个核苷酸组成，序列5由22个核苷酸组成，序列 6由28个核苷酸组成，序列7由22个核苷酸组成，序列8由22个核苷酸组成，序列 9由26个核苷酸组成，序列10由21个核苷酸组成。

上述动物组织和/或器官可来源于猪、牛、羊、鸡和鸭这五种动物中任一种动物组 织和/或器官，也可以来源于猪、牛、羊、鸡和鸭这五种动物中的任两种、任三种、任 四种或五种动物的混合组织和/或器官。

含有上述引物对组合物或单独的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对 的试剂盒也属于本发明的保护范围。

为了提高上述试剂盒的准确性，所述试剂盒除含有上述引物对组合物或单独的鉴 定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对外，还含有限制性内切酶，所述限制性 内切酶为EcoR I和/或Hind III；所述动物为牛、羊、猪、鸡、鸭中的至少一种。

由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织 和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得猪肉线粒体腺苷三磷酸酶VI亚基和VIII 亚基基因的基因片段(如序列表中序列11和序列12所示)，该基因片段共有611个核 苷酸，其中前24位和后26位分别为序列表中序列1和序列2所示上下游引物，第 133-138位是Hind III的识别序列。

由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织 和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得牛肉线粒体DNA细胞色素C氧化酶II亚 基基因的基因片段(如序列表中序列13和序列14所示)，该基因片段共有494个核苷 酸，其中前24位和后22位分别为序列表中序列3和序列4所示上下游引物，第263-268 位是Hind III的识别序列。

由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织 和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得羊肉线粒体DNA细胞色素B基因的基因 片段(如序列表中序列15和序列16所示)，该基因片段共有716个核苷酸，其中前 22位和后28位分别为序列表中序列5和序列6所示上下游引物，第253-258位是EcoR I的识别序列。

由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织 和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得鸡肉线粒体DNA腺苷三磷酸合成酶VI亚 基和VIII亚基基因的基因片段(如序列表中序列17和序列18所示)，该基因片段共 有259个核苷酸，其中前22位和后22位分别为序列表中序列7和序列8所示上下游 引物，第97-102位是Hind III的识别序列。

由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸭组织 和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得鸭肉线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基III 基因的基因片段(如序列表中序列19和序列20所示)，该基因片段共有350个核苷酸， 其中前26位和后21位分别为序列表中序列9和序列10所示上下游引物，第173-178 位是Hind III的识别序列。

本发明所提供的引物对组合物或引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。该 制备方法具体可包括将所述引物对组合物或引物对中各引物对的所述两条单链DNA 分别单独包装的步骤。

上述鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的试剂盒的制备方法也属于本发明的保 护范围。该制备方法具体可包括如下步骤：上述引物对组合物或引物对中各引物对的 所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂 盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP(dATP，dTTP，dCTP和dGTP) 和限制性内切酶，所述限制性内切酶为Hind III和/或EcoR I。所述动物为猪、牛、羊、 鸡和鸭中至少一种。

利用所述引物对组合物或引物对，或所述PCR试剂盒鉴定或辅助鉴定待测动物组 织和/或器官中是否含有牛、羊、猪、鸡和鸭这五种动物中至少一种动物组织和/或器官 的方法也属于本发明的保护范围。

其中，利用所述引物对组合物或引物对的鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官 中是否含有牛、羊、猪、鸡和鸭这五种动物中至少一种动物组织和/或器官的方法包括 下述1)和2)的步骤：

1)在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板， 选用60-64℃的退火温度，优选为62℃，用上述四种引物对组合物中的任一种组合物 进行PCR扩增；

2)检测步骤1)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述 待测动物组织和/或器官中含有哪种或哪些动物组织和/或器官：如果所述PCR产物中 含有大小是580-640bp，如611bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有猪 组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段， 所述待测动物组织和/或器官中含有牛组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小 是690-750bp，如716bp的DNA片段，所述的DNA片段待测动物组织和/或器官中含 有羊组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是230-280bp，如259bp的DNA 片段，所述待测动物组织和/或器官中含有鸡组织和/或器官；如果所述PCR产物中含 有大小是330-380bp，如350bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有鸭组 织和/或器官。

所述检测所得到的PCR产物大小的方法是将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳，如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示580-640bp之间的一条带，如611bp， 所述待测动物组织和/或器官中含有猪组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝 胶电泳上显示460-520bp之间的一条带，如494bp，所述待测动物组织和/或器官中含 有牛组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示690-750bp之间的一 条带，如716bp，所述待测动物组织和/或器官中含有羊组织和/或器官；如果所述PCR 产物在琼脂糖凝胶电泳上显示230-280bp之间的一条带，如259bp，所述待测动物组 织和/或器官中含有鸡组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示 330-380bp之间的一条带，如350bp，所述待测动物组织和/或器官中含有鸭组织和/或 器官。

所述待测动物组织和/或器官来源于下述动物中的至少一种：牛、羊、猪、鸡、鸭。

利用所述PCR试剂盒的鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否含有牛、 羊、猪、鸡和鸭这五种动物中至少一种动物组织和/或器官的方法，包括下述a)和c) 的步骤：

a)在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板， 选用60-64℃的退火温度，优选为62℃，所述试剂盒中的引物对组合物或引物对进行 PCR扩增；

b)检测步骤a)得到的PCR产物的大小，根据PCR产物确定所述待测动物组织 和/或器官中含有哪种或哪些动物组织和/或器官的方法同上；

c)对经步骤b)检测的PCR产物进行酶切鉴定，所述酶切鉴定的步骤及确定所 述待测动物组织和/或器官中含有哪种或哪些动物组织和/或器官的方法为下述c1)-c5) 中的至少一种：

c1)将所述大小是580-640bp，如611bp的DNA片段用HindIII进行酶切鉴定， 如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为100-200bp和450-550bp的两个片段，如 135bp和476bp，所述待测动物组织和/或器官中含有猪组织和/或器官；

c2)将所述大小为460-520bp，如494bp的DNA片段用Hind III进行酶切鉴定的 步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为200-300bp的两个片段，如265bp 和229bp，所述待测动物组织和/或器官中含有牛组织和/或器官；

c3)将所述大小为690-750bp，如716bp的DNA片段用EcoR I进行酶切鉴定的 步骤，如果所述PCR扩增产物可被EcoR I酶切为200-300bp和400-500bp的两个片段， 如255bp和461bp，所述待测动物组织和/或器官中含有羊组织和/或器官；

c4)将所述大小为230-280bp，如259bp的DNA片段用Hind III进行酶切鉴定的 步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为50-100bp和150-200bp的两个片段， 如99bp和160bp，所述待测动物组织和/或器官中含有鸡组织和/或器官；

c5)将所述大小为330-380bp，如350bp的DNA片段用Hind III进行酶切鉴定的 步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为150-200bp的两个片段(根据实际 电泳分辨率，可能重叠为一条条带)，所述待测动物组织和/或器官中含有鸭组织和/或 器官。

所述待测动物组织和/或器官来源于下述动物中的至少一种：牛、羊、猪、鸡、鸭。

所述待测动物组织和/或器官具体可为结缔组织(如血液)、肌肉组织。

本发明的牛、羊、猪、鸡、鸭特异性引物，均选用了62℃的退火温度，实现了在 同一温度一次PCR完成所有鉴别。同时，PCR产物的酶切鉴定，进一步增强了检测的 精确度。本发明的检测方法特异性强，能鉴别掺杂牛、羊、猪、鸡和/或鸭的组织和/ 或器官。整个结果清晰、可信度高。本发明的方法检测过程耗时短，从提取基因组到 酶切结束，最短仅需要8小时的时间(样品数量多时酌情延长)。

附图说明

图1为民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭 10种肉类基因组的提取结果。从左至右的十一条泳道分别为DNA分子量标准 DL15000，民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭 的基因组电泳图。

图2为猪特异引物PCR检测民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、 北京鸭、绍兴鸭肌肉样品结果。从左至右的十一条泳道分别为DNA分子量标准100bp Ladder，民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭的 PCR结果。

图3为牛特异引物PCR检测民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、 北京鸭、绍兴鸭肌肉样品结果。从左至右的十一条泳道分别为DNA分子量标准100bp Ladder，民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭的 PCR结果。

图4为羊特异引物PCR检测民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、 北京鸭、绍兴鸭肌肉样品结果。从左至右的十一条泳道分别为DNA分子量标准100bp Ladder，民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭的 PCR结果。

图5为鸡特异引物PCR检测民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、 北京鸭、绍兴鸭肌肉样品结果。从左至右的十一条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder，民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭的 PCR结果。

图6为鸭特异引物PCR检测民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、 北京鸭、绍兴鸭肌肉样品结果。从左至右的十一条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder，民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭的 PCR结果。

图7为五个引物对组合物PCR检测民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、 土鸡、北京鸭、绍兴鸭肌肉样品结果。从左至右的十一条泳道分别为DNA分子量标准 100bp Ladder，民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、绍 兴鸭的PCR结果。

图8(A)为五个引物对PCR扩增特异性片段的酶切结果(一)。其中M：DNA分子 量标准50bp Ladder，1：民猪肌肉的PCR产物，2：民猪PCR产物的酶切结果，3：小耳猪肌 肉的PCR产物，4：小耳猪PCR产物的酶切结果，5：黄牛肌肉的PCR产物，6：黄牛PCR产物 的酶切结果，7：水牛肌肉的PCR产物，8：水牛PCR产物的酶切结果，9：山羊肌肉的PCR产 物，10：山羊PCR产物的酶切结果，11：绵羊肌肉的PCR产物，12：绵羊PCR产物的酶切结 果。

图8(B)为五个引物对PCR扩增特异性片段的酶切结果(二)。其中，M：DNA分 子量标准50bp Ladder，1：原鸡肌肉的PCR产物，2：原鸡PCR产物的酶切结果，3：土鸡肌肉 的PCR产物，4：土鸡PCR产物的酶切结果，5：北京鸭肌肉的PCR产物，6：北京鸭PCR产物的 酶切结果，7：绍兴鸭肌肉的PCR产物，8：绍兴鸭PCR产物的酶切结果。

图9为五个引物对组合物PCR检测掺杂猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉的鸭肉样品结果。 其中，M：DNA分子量标准100bp Ladder，1：五个引物对组合物PCR扩增的掺杂0.1％猪肉、 牛肉、羊肉和鸡肉的鸭肉，2：五个引物对组合物PCR扩增的纯鸭肉。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测动物纯肌肉样品

一、制备鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对

以猪肉线粒体腺苷三磷酸酶VI亚基和VIII亚基基因为靶基因，设计特异扩增该 基因的引物对。上游引物的序列为5′-CAGAATCAATTGAACTCAAAACTC-3′(序列 表中的序列1)，下游引物的序列为5′-TAGTGTTGATGTTGAGTAGTGCTAAT-3′(序 列表中的序列2)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对。该 引物对扩增民猪和小耳猪的靶序列如序列表中序列11和序列12所示。序列表中的序 列11和序列12的第133-138位是Hind III的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两 条片段，长度分别为135bp和476bp。

以牛肉线粒体DNA细胞色素C氧化酶II亚基基因为靶基因，设计特异扩增该基 因的引物对。上游引物的序列为5′-CGCTTGTCTTCTTAATTAGCTCAT-3′(序列表 中的序列3)，下游引物的序列为5′-GTAATATAAGCCTGGACGGGAC-3′(序列表中 的序列4)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对。该引物对 扩增黄牛和水牛的靶序列如序列表中序列13和序列14所示。序列表中的序列13和序 列14的第263-268位是Hind III的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片段，长 度分别为265bp和229bp。

以羊肉线粒体DNA细胞色素B基因为靶基因，设计特异扩增该基因的引物对。 上游引物的序列为5′-CGGCATTCATAGGCTATGTTTT-3′(序列表中的序列5)，下 游引物的序列为5′-GACCGGAATGATAAGGAAATATATAATA-3′(序列表中的序列 6)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对。该引物对扩增山 羊和绵羊的靶序列如序列表中序列15和序列16所示。序列表中的序列15和序列16 的第253-258位是EcoR I的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片段，长度分别 为255bp和46Ibp。

以鸡肉线粒体DNA腺苷三磷酸合成酶VI亚基和VIII亚基基因为靶基因，设计特 异扩增该基因的引物对。上游引物的序列为5′-TTATCCAACCCAAACTTCTTTC-3′ (序列表中的序列7)，下游引物的序列为5′-TTGTTTTGTGATTAGGTGGGTG-3′(序 列表中的序列8)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对。该 引物对扩增原鸡和土鸡的靶序列如序列表中序列17和序列18所示。序列表中的序列 17和序列18的第97-102位是Hind III的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片 段，长度分别为99bp和160bp。

以鸭肉线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基III基因为靶基因，设计特异扩增该基因 的引物对。上游引物的序列为5′-ATGTGATTCCACTACAACTCATCTAT-3′(序列表中 的序列9)，下游引物的序列为5′-TGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3′(序列表中的序 列10)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对。该引物对扩增 北京鸭和绍兴鸭的靶序列如序列表中序列19和序列20所示。序列表中的序列19和序 列20的第173-178位是Hind III的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片段，长 度相差小于5bp，在2％琼脂糖凝胶电泳中不能明显区分，电泳结果应显示为一条带。

二、检测动物纯肌肉样品

1、检测样品的制备

该实验中的样品均是纯肌肉，分别是黄牛、水牛、山羊、绵羊、民猪、小耳猪、 原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭肌肉样品。

2、利用步骤一的引物对PCR扩增线粒体基因组上的相关基因片段

1)样品基因组的提取

使用北京全式金生物技术有限公司Easy Pure Genomic DNA Extraction Kit(货号 EE101-01)提取步骤1中样品的基因组DNA。结果表明，步骤1中的所有样品使用该 试剂盒均能有效提取到基因组，提取的数量在电泳检测时可见(如图1)，足够用作PCR 反应的模板。

2)单重PCR和五重PCR反应及电泳检测

分别以上述步骤1中各个样品的基因组DNA为模板，利用如下五个引物对或者 是所述五个引物对的组合物进行单重PCR和五重PCR：由序列1和序列2所示的两条 单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的引物对；由序列3和序列4 所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的引物对；由序列 5和序列6所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的引物 对；由序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或 器官的引物对；由序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定 鸭组织和/或器官的引物对。

其中，单个引物对的PCR体系：10×Buffer 2.0μL(购自宝生物工程(大连)有限 公司，货号DR001A)，dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物 (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D4030)2.0μL，浓度为20μM的上游引物 1.0μL，浓度为20μM的下游引物1.0μL，模板(总DNA)2.0μL，5U/μL的Taq DNA 聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)0.5μL，加双蒸水至20μL。

其中，当上游引物为序列1时，下游引物为序列2，此时PCR体系为扩增猪基因 的PCR体系；当上游引物为序列3时，下游引物为序列4，此时PCR体系为扩增牛基 因的PCR体系；当上游引物为序列5时，下游引物为序列6，此时PCR体系为扩增羊 基因的PCR体系；当上游引物为序列7时，下游引物为序列8，此时PCR体系为扩增 鸡基因的PCR体系；当上游引物为序列9时，下游引物为序列10，此时PCR体系为 扩增鸭基因的PCR体系。

五个引物对组合物的PCR体系：10×Buffer 2.0μL(购自宝生物工程(大连)有限 公司，货号DR001A)，dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物 (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D4030)2.0μL，浓度为20μM的上游引 物(序列1、3、5、7和9所示单链DNA)各1.0μL，浓度为20μM的下游引物(序 列2、4、6、8和10所示单链DNA)各1.0μL，模板(总DNA)2.0μL，5U/μL的 Taq DNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)0.5μL，加双蒸 水至20μL。

PCR程序：95℃，10min预变性；95℃，30s，62℃，30s，72℃，45s，扩增反 应进行30个循环；72℃，延伸5min；4℃，保温结束。

将PCR反应获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2％。

3、纯肌肉样品的PCR结果

电泳检测结果显示：(1)采用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA 组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对进行PCR反应，其中民猪和小 耳猪的PCR扩增产物中得到一条大小580-640bp的条带(图2)，其它黄牛、水牛、山 羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭肌肉样品中没有该条带。说明猪特异引物专 一性非常好，与其他动物没有交叉反应；没有非特异的杂带产生。(2)采用由序列表 中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的 PCR引物对进行PCR反应，其中黄牛和水牛的PCR扩增产物中得到一条大小 460-520bp的条带(图3)，其它民猪、小耳猪、山羊、绵羊、原鸡、土鸡、北京鸭、 绍兴鸭肌肉样品中没有该条带。说明牛特异引物专一性非常好，与其他动物没有交叉 反应；没有非特异的杂带产生。(3)采用由序列表中序列5和序列6所示的两条单链 DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对进行PCR反应，其中山羊 和绵羊的PCR扩增产物中得到一条大小690-750bp的条带(图4)，其它民猪、小耳猪、 黄牛、水牛、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭肌肉样品中没有该条带。说明羊特异引物 专一性非常好，与其他动物没有交叉反应；没有非特异的杂带产生。(4)采用由序列 表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的 PCR引物对进行PCR反应，其中原鸡和土鸡的PCR扩增产物中得到一条大小 230-280bp的条带(图5)，其它民猪、小耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、北京鸭、 绍兴鸭肌肉样品中没有该条带。说明鸡特异引物专一性非常好，与其他动物没有交叉 反应；没有非特异的杂带产生。(5)采用由序列表中序列9和序列10所示的两条单链 DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对进行PCR反应，其中北京 鸭和绍兴鸭的PCR扩增产物中得到一条大小330-380bp的条带(图6)，其它民猪、小 耳猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、原鸡、土鸡肌肉样品中没有该条带。说明鸭特异引 物专一性非常好，与其他动物没有交叉反应；没有非特异的杂带产生。(6)采用五个 引物对组合物在同一反应体系中进行PCR反应，其中民猪和小耳猪的PCR扩增产物 中只有一条大小580-640bp的条带，黄牛和水牛的PCR扩增产物中只有一条大小 460-520bp的条带，山羊和绵羊的PCR扩增产物中只有一条大小690-750bp的条带， 原鸡和土鸡的PCR扩增产物中只有一条大小230-280bp的条带，北京鸭和绍兴鸭的 PCR扩增产物中只有一条大小330-380bp的条带(图7)。这一结果再次说明五种PCR 引物对专一性非常好，与其他动物没有交叉反应，没有非特异的杂带产生；另外，这 一结果还表明，五种引物对可以同时使用，在检测灵敏度方面能达到与单独使用各引 物对相同的效果，引物对组合物的形式使得一次PCR反应完成五种肉类的检测，大大 节约了检测时间与成本。

4、酶切鉴定

将PCR扩增获得的民猪、小耳猪、黄牛、水牛、原鸡、土鸡、北京鸭、绍兴鸭的 条带使用Hind III进行酶切反应；山羊和绵羊的条带使用EcoR I进行酶切反应。

酶切体系：10×Buffer 1.0μL，限制性内切酶0.5μL，PCR产物8.5μL，加双 蒸水至20μL。

其中，当PCR产物为民猪、小耳猪、黄牛、水牛、原鸡、土鸡、北京鸭或绍兴鸭 的条带时，上述10×Buffer为与Hind III匹配使用的10×Buffer(购自宝生物工程(大 连)有限公司，货号D1060A)，上述限制性内切酶为Hind III(购自宝生物工程(大 连)有限公司，货号D1060A；当PCR产物为山羊和绵羊的条带时，上述10×Buffer 为与EcoR I匹配使用的10×Buffer(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D1040A)， 上述限制性内切酶为EcoR I(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D1040A)。

酶切反应获得的产物进行凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2％。

结果显示：PCR扩增获得的民猪、小耳猪肌肉的条带均被酶切为100-200bp和 450-550bp的两条条带；黄牛、水牛肌肉的条带均被酶切为200-300bp的两条条带；原 鸡、土鸡肌肉的条带均被酶切为50-100bp和150-200bp的两条条带；北京鸭、绍兴鸭 肌肉的条带均被酶切为150-200bp的两条条带；山羊、绵羊肌肉的条带均被酶切为 200-300bp和400-500bp的两条条带(图8)。说明PCR产物符合最初的设计，不是非 特异性扩增的结果，说明PCR反应结果真实有效。

5、测序验证

将民猪、小耳猪肌肉的PCR产物进行测序，结果表明民猪(序列表中的序列11) 和小耳猪(序列表中的序列12)PCR产物的序列与NCBI数据库中家猪AP003428.1 基因腺苷酸磷酸酶VI亚基和VIII亚基片段的序列同源性达到98％以上，大小为611bp。

将黄牛、水牛肌肉的PCR产物进行测序，结果表明黄牛(序列表中的序列13) 和水牛(序列表中的序列14)PCR产物的序列分别与NCBI数据库中黄牛AY526085.1 和水牛NC_006295的细胞色素C氧化酶II亚基基因片段的序列同源性达到98％以上， 大小为494bp。

将山羊、绵羊肌肉的PCR产物进行测序，结果表明山羊(序列表中的序列15) 和绵羊(序列表中的序列16)PCR产物的序列分别与NCBI数据库中山羊GU068049 和绵羊AY858379.1的细胞色素B基因片段的序列同源性达到98％以上，大小为716bp。

将原鸡、土鸡肌肉的PCR产物进行测序，结果表明原鸡(序列表中的序列17) 和土鸡(序列表中的序列18)PCR产物的序列与NCBI数据库中原鸡AY235571.1腺 苷酸磷酸合成酶VI亚基和VIII亚基片段的序列同源性达到98％以上，大小为259bp。

将北京鸭、绍兴鸭肌肉的PCR产物进行测序，结果表明北京鸭(序列表中的序列 19)和绍兴鸭(序列表中的序列20)PCR产物的序列与NCBI数据库中北京鸭EU755252 细胞色素氧化酶亚基III基因片段的同源性达到98％以上，大小为350bp。

上述实验表明，本发明的检测方法特异性强，引物之间没有交叉反应。扩增产物 符合预计的大小，且都能被设计好的限制性内切酶切割，说明扩增产物不是非特异性 扩增的结果。整个结果清晰、可信度高。

实施例2检测掺杂肌肉样品

一、制备鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对

设计和制备方法同实施例1一。

二、检测动物肌肉样品

1、检测样品的制备

该实验中的样品是掺杂猪肉、羊肉、牛肉和鸡肉的鸭肉：在99.6g北京鸭鸭肉中 掺杂0.1g民猪肉、0.1g山羊肉、0.1g黄牛肉和0.1g土鸡肉，制成掺杂0.1％猪肉、羊 肉、牛肉、鸡肉的鸭肉，同时以未掺杂的纯鸭肉为对照。

2、利用步骤一的引物对PCR扩增线粒体基因组上的相应基因片段

1)样品基因组的提取

制备方法同实施例1步骤二2。

2)PCR反应及电泳检测

以上述步骤1中掺杂猪肉、羊肉、牛肉和鸡肉的鸭肉和纯鸭肉的基因组DNA分 别为模板，进行PCR扩增，体系为：10×Buffer 2.0μL(购自宝生物工程(大连)有限 公司，货号DR001A)，dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物 (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D4030)2.0μL，浓度为20μM的上游引物 (序列1、3、5、7和9所示单链DNA)1.0μL，浓度为20μM的下游引物(序列2、 4、6、8和10所示单链DNA)1.0μL，模板(总DNA)2.0μL，5U/μL的Taq DNA聚 合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)0.5μL，加双蒸水至20μL。

将PCR反应获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2％。

3、掺杂动物肌肉样品的检测结果

电泳检测结果显示：掺杂猪肉、羊肉、牛肉和鸡肉的鸭肉样品得到5条带，大小 分别为230-280bp(鸡)、330-380bp(鸭)、460-520bp(牛)、580-640bp(猪)、690-750bp (羊)；而纯鸭肉中只有一条大小330-380bp(鸭)的条带(图9)。

4、测序验证

将如下PCR产物均进行测序：230-280bp(鸡)、330-380bp(鸭)、460-520bp(牛)、 580-640bp(猪)、690-750bp(羊)，结果表明民猪(序列表中的序列11)PCR产物的 序列与NCBI数据库中家猪AP003428.1基因腺苷酸磷酸酶VI亚基和VIII亚基片段的 序列同源性达到98％以上，大小为611bp；黄牛(序列表中的序列13)PCR产物的序 列与NCBI数据库中黄牛AY526085.1的细胞色素C氧化酶II亚基基因片段的序列同 源性达到98％以上，大小为494bp；山羊(序列表中的序列15)PCR产物的序列与 NCBI数据库中山羊GU068049的细胞色素B基因片段的序列同源性达到98％以上， 大小为716bp；土鸡(序列表中的序列18)PCR产物的序列与NCBI数据库中原鸡 AY235571.1腺苷酸磷酸合成酶VI亚基和VIII亚基片段的序列同源性达到98％以上， 大小为259bp；北京鸭(序列表中的序列19)PCR产物的序列与NCBI数据库中北京鸭 EU755252细胞色素氧化酶亚基III基因片段的序列同源性达到98％以上，大小为350bp。

上述实验表明，本发明的检测方法特异性强，能鉴别肉中是否含有猪、牛、羊、 鸡和鸭这五种动物中至少一种肉类的组分，引物之间没有交叉反应。扩增产物符合预 计的大小，且都能被设计好的限制性内切酶切割，说明扩增产物不是非特异性扩增的 结果。整个结果清晰、可信度高。