PIV-5和PIV-2的F蛋白的突变蛋白

摘要

本申请涉及目前被索引为5型PIV(PIV-5或PIV5)和2型PIV(PIV-2或PIV2)的副流感病毒(PIV)的融合蛋白(F蛋白)的突变蛋白。本申请涉及由其衍生的产物，如核酸，载体，细胞，抗体、适体、干扰RNA类型的融合抑制剂；骨髓瘤、杂交瘤；干细胞和祖细胞。本申请还涉及突变蛋白和由其衍生的产物在医疗和生物技术应用中的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及副流感病毒(PIV)融合蛋白(F蛋白)的突变蛋白，副流感病 毒目前被索引为5型PIV(PIV-5或PIV5)和2型PIV(PIV-2或PIV2)。

本申请还涉及由其衍生的产物，如：

●核酸、载体、细胞；

●抗体、适体、干扰RNA类型的融合抑制剂；

●骨髓瘤、杂交瘤；

●肝细胞和祖细胞。

本申请还涉及这些突变蛋白和由其衍生的产物在医药和生物技术应 用中的用途。

发明背景

目前被索引为5型PIV(PIV-5或PIV5)的副流感病毒(PIV)，是副粘 病毒科(paramyxoviridae)腮腺炎病毒属(Rubulavirus)的包膜病毒。以前 PIV-5被称为SV5(猿病毒5)，因为它最初是从原代猴细胞培养物分离 的。然而，PIV-5的天然宿主看起来是狗，其在狗中引起称为犬舍咳的 咳嗽。

随后，从收集自人类但是培养于动物细胞中的样品获得几个PIV-5 分离物。此外，在人类中没有症状与PIV-5相关。因此，人类实际上是 否是PIV-5的宿主的问题，仍然处于热烈的争论中。

目前，无论如何，都认为PIV-5病毒是动物病毒。

目前被索引为2型PIV(PIV-2或PIV2)的副流感病毒(PIV)也是副粘 病毒科腮腺炎病毒属的包膜病毒。

目前，仅仅鉴定了人类的PIV-2分离物(hPIV-2)，因此，认为PIV-2 是人类病毒。

PIV-5和PIV-2病毒在核酸序列、蛋白序列、组织、结构和形态方 面彼此非常相似。

因为选自人副流感病毒，因此PIV-2与在人类中发现的PIV-5最密 切。

可以认为PIV-2是PIV-5的人类等同物，至少本发明人是这么认为 的。

PIV-5或PIV-2感染导致称为合胞体的多核结构形成，合胞体是由 感染的宿主的细胞融合形成的。

PIV-5和PIV-2病毒通过病毒包膜与细胞膜的融合进入宿主细胞。

该融合涉及两种病毒糖蛋白：血细胞凝集素-神经酰胺酶附着蛋白 (HN)和融合蛋白(F)。

PIV-5和PIV-2的融合蛋白F以简单前体(F0)的形式合成，并且采用 糖基化的同型三聚体形式。PIV-5和PIV-2的融合蛋白F需要宿主的宿 主弗林蛋白酶的蛋白水解切割，以产生由通过二硫键连接的两个亚基组 成的“预激活”形式：大羧基末端亚基F1和小氨基末端亚基F2。

亚基F1由疏水融合肽(FP)以及具有卷曲螺旋型构象的两个7个重复 结构域(HR-1和HR-2)组成。在被HN激活后，融合蛋白经历一系列构 象变化，导致融合肽插入靶细胞膜中。接着，在使病毒包膜接近细胞膜 的HR-1和HR-2结构域之间发生相互作用(Russell et al，2006)。已知这 些结构域形成非常稳定的一束由三聚体卷曲螺旋结构组成的六螺旋，在 该六螺旋中，三个HR-I结构域与三个HR-2结构域在反平行方向上相 连。这种构象代表了F蛋白的融合后形式(Baker et al，1999，Sergel- Germano et al，2000，West et al，2005)。

PIV-5和PIV-2的融合蛋白F需要用于促进融合的来自相同病毒类 型的HN蛋白(Yao et al，1997)。然而，存在于F和HN之间的相互作用 的确切本质，仍然没有完全清楚。

然而，几项研究已经表明，PIV-5和PIV-2的某些毒株的不同之处 在于，它们需要HN触发融合。

作为实例，Ito et al，1997描述了″SV5″(PIV-5)的两株毒株，即W3A 和WR，它们的F蛋白的差异仅在于三个氨基酸(残基22、443和516)。 W3A毒株的F蛋白能以自主方式诱导融合，即在缺少HN蛋白的情况 下，而WR毒株的F蛋白不能如此。

Ito et al，1997指出，WR毒株的F蛋白的融合活性可通过以氨基酸 脯氨酸取代该蛋白位置22的氨基酸再次建立。

Ito et al，2000认为，W3A和WR毒株F蛋白的位置132的氨基酸E 和位置290的氨基酸A可能参与这些毒株的F蛋白成为自主HN蛋白的 能力。

Paterson et al，2000指出，W3A毒株F蛋白位置22的氨基酸脯氨酸 的存在，以及WR毒株F蛋白氨基酸443的存在，能够增加这些病毒毒 株的融合能力。

Russell et al，2003指出，用芳族氨基酸取代毒株W3A的F蛋白的残 基L447和I449，能够增加该病毒毒株F蛋白的融合活性。

Gardner and Dutch，2007指出，野生型″SV5″(PIV-5)病毒F蛋白的突 变I49A应具有促融合作用。

Gardner et al，2007指出，野生型″SV5″(PIV-5)病毒F蛋白的突变 V402A应具有促融合作用。

对于蛋白PIV-2，看起来不存在描述将所述类型的突变引入该病毒 F蛋白的序列中以便试图据此增加自主性和融合能力的现有技术文献。

此外，存在许多能融合的其他病毒蛋白，如流感蛋白HA1/HA2、 棒状病毒G蛋白或HIV的gp41/gp120蛋白。

有关这些不同病毒蛋白的融合性能力和自主性的现有知识仍然非常 有限。

无论如何，有关病毒融合蛋白的现有知识未能提供设想有效医疗和/ 或生物技术应用的充分技术知识。

发明概述

本发明人认为，拥有可用的高融合性且在融合能力方面表现出实 质自主性的融合蛋白，能够为若干的医疗和生物技术情况提供了解决方 案。

本发明人因此从一系列其他病毒融合蛋白选择性地选择了PIV-5和/ 或PIV-2的F蛋白，所述其他病毒融合蛋白如来自流感的HA1/HA2蛋 白、来自棒状病毒的G蛋白或来自HIV的gp41/gp120蛋白。

然后构建它们，并产生在缺少HN蛋白的情况下能够融合的突变的 F蛋白。

已证实，本发明的突变蛋白具有高融合能力和高自主性。它们不需 要HN蛋白的存在来诱导细胞融合和合胞体形成。

本发明人还证明，将不同于F蛋白在其天然状态下所呈现的切割位 点的切割位点特别是组织特异性切割位点引入这些突变蛋白中是可能 的。

本发明人还提出了本发明的突变蛋白和/或衍生于所述蛋白的产物或 所述蛋白的后续产物的医疗(治疗、预防、缓和还有诊断)和/或生物技术 应用。

具体而言，本发明人提出使用本发明的突变蛋白或编码它们的核酸 来体内或离体治疗、预防或减轻疾病或功能障碍，如癌症(特别是转移性 癌，优选转移性黑素瘤)或胎盘发育缺陷，对这些疾病或功能障碍而言， 诱导或增加合胞体形成是期望的。

本发明人还提出，用阻断PIV-5和/或PIV-2的F蛋白的试剂，如抗 体、重组树突细胞、反义细胞、siRNAs、核酸适体，来体内或离体治 疗、预防或减轻疾病或功能障碍，如包膜病毒感染、过敏反应、自身免 疫病或移植排斥，对这些疾病或功能障碍而言，抑制或阻断合胞体形成 是期望的的。

本发明人还提出了检测合胞体形成过量或相反形成不足的诊断手 段。

本发明人还特别为筛选能减少合胞体形成的活性成分提出了不同的 生物技术手段。

本发明人还提出了包含本发明突变蛋白的癌细胞，特别是骨髓瘤。 本发明人还提出了包含本发明突变蛋白的杂交瘤。本发明的癌细胞特别 是骨髓瘤能与另一细胞特别是与B淋巴细胞融合，而无需使用聚乙二醇 (PEG)，也无需使用电穿孔，也无需使用任何其他融合诱导手段。本发 明的癌细胞，特别是骨髓瘤，能自主融合。

本发明的杂交瘤可以通过融合(B淋巴细胞与黑素瘤的融合)产生， 不需要使用聚乙二醇(PEG)、也无需使用电穿孔、也无需使用任何其他 融合诱导手段。本发明的杂交瘤实际上可以通过使用本发明的至少一种 癌细胞特别是至少一种骨髓瘤产生。

本发明人还提出了表达本发明突变蛋白的重组干细胞或祖细胞，以 及它们在产生肌纤维中的应用。

本发明的其他方面将在下文“本发明的详细描述”部分中描述。

附图简要说明

所提交的本申请的这组附图以彩色形式提交。其可以通过查阅在国 际局的案卷而访问。

图1A：PIV-5的F蛋白的参考序列(SEQ ID NO：31；WR分离物的 F蛋白的序列)和相应的CDS序列(SEQ ID NO：30；编码SEQ ID NO：31 的蛋白的核酸序列)。SEQ ID NO：31序列中粗体和加下划线的字符表示 以下位置的氨基酸：

-22(L)，

-49(I)，

-132(E，该分离物中预先存在的突变)，

-147(T)，

-158(T)，

-290(A，该分离物中预先存在的突变)，

-402(V)，

-443(P，该分离物中理论上预先存在的突变)，

-447(L)，

-449(I)以及

-463(A)。

图1B：PIV-2的F蛋白的参考序列(SEQ ID NO：33；Greer分离物的 F蛋白的序列)以及相应的CDS序列(SEQ ID NO：32；编码SEQ ID NO： 33的蛋白的核酸序列)。

SEQ ID NO：33的序列中的粗体和加下划线的字符表示以下位置的 氨基酸：

-24(I)，

-53(I)，

-133(K)，

-151(T)，

-162(S)，

-294(I)，

-406(A)，

-428(S)，

-439(S)，

-445(I)，

-474(S)。

图2A：PIV-5的F蛋白(SEQ ID NO：31的氨基酸4-529)与PIV-2的 F蛋白(SEQ ID NO：33的氨基酸8-533)的比对：这两种蛋白间的蛋白同 一性为47.7％。来自该比对的共有序列称为SEQ ID NO：34。

图2B：PIV-2的F蛋白中的氨基酸和突变，其对应于PIV-5的F蛋 白的氨基酸和突变。

图3：图示PIV-5的F蛋白的天然切割位点(SEQ ID NO：23)被组织 特异性切割位点取代，在这种情况下，即转移性肿瘤组织所特异性表达 的酶即基质金属蛋白酶9(MMP-9)的位点。

MMP-9位点的共有位点：SEQ ID NO：27的序列(PXXhyS/T位点， 其中X＝任何氨基酸，且Hy＝任何疏水氨基酸，即选自F、M、V、L、 I的任何氨基酸)。

MMP-9位点的说明性序列：SEQ ID NO：28的序列、SEQ ID NO： 29的序列。

图4：质粒pcDNA3.1的结构，已经将编码PIV-5的F蛋白的序列 克隆到该质粒上。

Amp：氨苄青霉素抗性基因

pCMV：巨细胞病毒启动子

MCS：多克隆位点

F PIV5：PIV-5的F蛋白

BGHpolyA：牛生长激素polyA(聚A)。

图5A、5B、5C、5D：显示本发明人在PIV-5的F蛋白中所产生的 突变。

图6A：图示在半定量融合试验中所完成的显微镜观察结果(本发明 人所产生的突变体的大图面)。

图6B：呈现半定量融合试验后所获得的融合得分的图表(本发明人 所产生的突变体的大图面)。

图7A：说明在半定量融合试验中所完成的显微镜观察结果(选择本 发明人所产生的突变体)。

图7B：呈现半定量融合试验后所获得的融合得分的图表(选择本发 明人所产生的突变体)。

发明的详细描述

在本申请的范围内，术语“蛋白”在其范围内包括术语“糖蛋 白”。对于实际上是糖蛋白的F和HN蛋白而言，情况尤其如此。

PIV-5和PIV-2的F蛋白(非突变蛋白)：

PIV-5的F蛋白的序列呈现于图1A(SEQ ID NO：31的蛋白序列； SEQ ID NO：30的编码核酸序列)中。它是WR分离物的序列，WR分离 物是猿分离物。这些序列是可从基因库(GenBank)数据库获得的序列， 登录号为AB021962。

WR分离物的样品，是本发明人从ATCC接受的，并且用它构建和 产生下文实施例所述的突变蛋白，然而，其不具有F蛋白位置443的氨 基酸P(与根据从Genbank获得的序列对其期望的相反)，而具有氨基酸 S。WR分离物的F蛋白的该可选序列，因此等同于SEQ ID NO：31的序 列，例外是位置443的氨基酸是S而不是P。出于简洁的目的，该可选 序列会在本文中表示为“在443处具有S的SEQ ID NO：31”。

SEQ ID NO：31的序列和可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO： 31”，优选可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO：31”，在本专利申请 中充当PIV-5的F蛋白的参考序列。

然而，显然存在除了WR分离物以外的分离物，特别是：

●其他猿分离物，如W3A分离物；

●来自其他非人类动物的分离物，如：

○犬分离物，例如犬分离物CPI+、CPI-、H221、78524、Tl；

○猪分离物，例如猪分离物SER；

●称为“人类”分离物的分离物，其衍生于从人类采集但是已经培养 于动物细胞中的样品(参阅上文的介绍部分)，如MIL分离物、DEN分离 物、LN分离物、MEL分离物以及在WO 02 077211中描述为″隐病毒″的 分离物。

这些不同PIV-5分离物的F蛋白序列中的变化非常微小。

这些变化的描述由Chatziandreou et al，2004给出，其内容，特别是 该文章的表3以及与表3有关的注释，在此通过引用并入本专利申请。

该文章的表3复制于此：

在上文的表1中，空格表示所涉及的F蛋白与左栏所示的W3A毒 株的F蛋白具有相同的氨基酸。在该表中没有清楚地列出位置的氨基酸 当然与W3A的F蛋白的序列中与其对应的氨基酸序列相同。这些氨基酸 自身与WR分离物F蛋白的序列中与其对应氨基酸序列相同(参阅SEQ  ID NO：31的序列)。

因此，SEQ ID NO：35-46的序列是来自以下的序列，在SEQ ID NO： 31序列中取代表1所示的这些序列中的每个序列的氨基酸(并且，如果 合适，在SEQ ID NO：31序列的C末端部分添加所示的氨基酸)。

W3A分离物的F蛋白以及上文所提到的其他分离物的蛋白具有：

●在位置147，氨基酸T；

●在位置158，氨基酸T；

●在位置447，氨基酸L；以及

●在位置449，氨基酸I。

因此，可以看出，W3A和WR分离物不具有细胞质延伸，其在其 他分离物中延伸超出位置529。取决于所涉及的分离物，该细胞质延伸 含有2-7个氨基酸。

还可以看出，这些分离物F蛋白的序列的变化范围与WR毒株F蛋 白的序列相比小于5％(特别是最大3％)(在没有考虑细胞质延伸的情况 下，即通过由WR的F蛋白的长度计算该百分比)；参阅Chatziandreou  et al，2004文章第85页的末尾。

PIV-5的F蛋白因此可以由以下组成：

●SEQ ID NO：31的序列，或所述可选序列“在443处具有S的SEQ  ID NO：31”的序列；或

●该SEQ ID NO：31的序列的变异序列，或该可选序列“在443处具 有S的SEQ ID NO：31”的变异序列；该变异序列可以限定为：

○在大小上与SEQ ID NO：31的序列相同，或比SEQ ID NO：31 的序列小最多7个氨基酸，或比SEQ ID NO：31的序列大最多7个氨基 酸[所述可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO：31”与SEQ ID NO：31 的大小相同]，优选地，大小与SEQ ID NO：31的序列相同，或比SEQ  ID NO：31的序列大最多7个氨基酸；以及

○与SEQ ID NO：31的序列或与所述可选序列“在443处具有S 的SEQ ID NO：31”具有多于95％、优选至少96％、更优选至少97％的序 列同一性(该同一性利用SEQ ID NO：31的序列的长度，如果合适，利用 所述可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO：31”的序列长度来计算)。

SEQ ID NO：31的PIV-5的F蛋白的变体序列特别包含上文提到的 分离物W3A、MIL、DEN、LN、MEL、隐病毒、CPI+、CPI-、H221、 78524、Tl以及SER的F蛋白的序列(参阅上文表1和Chatziandreou et al， 2004的文章)。

以相似的方式，在本发明中充当PIV-2F蛋白的参考的序列是呈现 在图IB中的Greer毒株的序列(SEQ ID NO：33的蛋白序列，SEQ ID NO： 32的编码核酸序列)。

显然，存在除了Greer分离物以外的PIV-2分离物，如V98、V94 Toshiba分离物。

这些其他PIV-2分离物F蛋白的序列与Greer分离物的F蛋白的序 列非常接近，但是具有为分离物间变异的几处小变化。

因此，PIV-2F蛋白的组成如下：

●SEQ ID NO：33的序列；或

●该SEQ ID NO：33的序列的变异序列；该变异序列可以限定为：

○大小与SEQ ID NO：33的序列相同，或比SEQ ID NO：33的 序列小最多2个氨基酸，或比SEQ ID NO：33的序列最多大2个氨基 酸，优选地，具有与SEQ ID NO：33的序列相同的大小，优选地，大小 与SEQ ID NO：33的序列相同；以及

○与SEQ ID NO：33的序列具有多于95％、优选至少96％、更 优选至少97％的序列同一性(该同一性利用SEQ ID NO：33的序列长度 计算。

来自PIV-5的F蛋白的序列(SEQ ID NO：31)与PIV-2的F蛋白的序 列(SEQ ID NO：33)的比对的共有序列(SEQ ID NO：34)如下，并且可以在 图2A中读取。该共有序列可以按如下再次书写：

I----V------G-----L--IGVI----R-LMYYT-----FIVVKL

-P--------CNITS---YN-T--KLL-P—-ENL--I---------R-RF

AGVV-GLAALGVATAAQ-TAAVA-VKAN-NAAAI-NL---IQ-TN-AV-D

V-A------TAVQA-QD-IN------IT-A-C-A-DA-IGSILNLYLTEL

TTIFHNQITNPAL-P--IQALRILLGSTLP-V-E---NT----AELLSSG

LLTGQI------YMQM-I-I-PT----QP----IDL—-ISA----QEV--

Q-P-R--------Q-YPA—C--TPN-V-CRYN-----------CL-GNL

--CTF-P---G-FL-RF----G--YANC-S-LC-C—P—V--Q-------

-ID---C----LD---F-IT---N-TY----------I----PLD-S---

---NKSL--A----A-S---------A-T---LS-1A-L-----L----L

L-----KL-------R--------H-(SEQ ID NO：34)，

符号“-”表示PIV-5的F蛋白和PIV-2的F蛋白在该位置具有不同的氨基 酸。

该共有序列也可以具有如下形式：

IXXXXVXXXXXXGXXXXXXXXLXXIGVIXXXXRXLMYYTXXXXXFIVVKL

XPXXXXXXXXCNITSXXXYNXTXXKLLXPXXENLXXIXXXXXXXXXRXRF

AGVVXGLAALGVATAAQXTAAVAXVKANXNAAAIXNLXXXIQXTNXAVXD

VXAXXXXXXTAVQAXQDXINXXXXXXITXAXCXAXDAXIGSILNLYLTEL

TTIFHNQITNPALXPVXIQALRILLGSTLPXVXEXXXNTXXXXAELLSSG

LLTGQIXXXXXXYMQMXIXIXPTXXXXQPXXXXIDLXXISAXXXXQEVXX

QXPXRXXXXXXXXQXYPAXXCXXTPNXVXCRYNXXXXXXXXXXXCLXGNL

XXCTFXPXXGXFLXRFXXXXGXXYANCXSXLCXCXXPXXVXXQXXXXXXX

XIDXXXCXXXXLDXXXFXITXXXNXTYXXXXXXXXXXIXXXXPLDXSXXX

XXXNKSLXXAXXXXAXSXXXXXXXXXAXTXXXLSXIAXLXXXXXLXXXXL

LXXXXXKLXXXXXXXRXXXXXXXXHX (SEQ ID NO：34)，

其中X＝任何氨基酸。

PIV-5的WR分离物的F蛋白的序列是SEQ ID NO：34的序列，该 序列的前面是在N末端的氨基酸MGT(参阅图1A和2A)。

PIV-2的Greer分离物的F蛋白的序列是SEQ ID NO：34的序列，其 前面是N末端的氨基酸MHHLHPM(SEQ ID NO：86)，随后是C末端的 氨基酸ENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO：87)(参阅图1B和2A)。

PIV-5和PIV-2的F蛋白的序列被认为是包含SEQ ID NO：34的序 列的序列，优选地，是包含SEQ ID NO：34的序列的PIV病毒的F蛋白 的序列。更特别地，PIV-5和PIV-2的F蛋白的序列被认为是：

a)SEQ ID NO：34的序列：

●其前面是N末端的3-7个氨基酸(如MGT)，更特别是N末端 的3个氨基酸(如MGT)或7个氨基酸(如MHHLHPM)；以及

●任选地随后是C末端的18个氨基酸，特别是C末端的氨基 酸ENPAFFSKNNHGNIYGIS；或

b)上文a)中所述序列的变异序列，所述变异序列是：

●或：

i.大小与SEQ ID NO：31的序列相同，或者比SEQ ID NO： 31的序列小最多7个氨基酸，或比SEQ ID NO：31的序列大最多7个氨 基酸，优选地，大小与SEQ ID NO：31的序列相同或比SEQ ID NO：31 的序列大最多7个氨基酸；以及

ii.与SEQ ID NO：31的序列或与所述可选序列“在443处 具有S的SEQ ID NO：31”具有多于95％、优选至少96％、更优选至少 97％的序列同一性(该同一性利用SEQ ID NO：31的序列长度或者，如果 合适，利用所述可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO：31”的序列长 度计算)；

●或

i.大小与SEQ ID NO：33的序列相同，或比SEQ ID NO：33 的序列小最多2个氨基酸或比SEQ ID NO：33的序列大最多2个氨基 酸，优选地大小与SEQ ID NO：33的序列相同；以及

ii.与SEQ ID NO：33的序列具有多于95％、优选至少 96％、更优选至少97％的序列同一性(该同一性利用SEQ ID NO：33的序 列长度计算)。

本发明的突变蛋白：

本申请涉及突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列包含通过以下方 式衍生于PIV-5或PIV-2病毒的F蛋白的序列的序列：

●通过

○氨基酸P取代在所述PIV-5F蛋白的序列中位于位置22或在 所述PIV-2F蛋白的序列中位于位置24的氨基酸(PIV-5的F中的突变 22P；PIV-2的F中的突变24P)；以及

○氨基酸E取代在所述PIV-5F蛋白的序列中位于位置132或 在所述PIV-2F蛋白的序列中位于位置133的氨基酸(PIV-5的F中的突 变132E；PIV-2的F中的突变133E)；以及

○氨基酸A取代在所述PIV-5F蛋白的序列中位于位置290或 在所述PIV-2F蛋白的序列中位于位置294的氨基酸(PIV-5的F中的突 变290A；PIV-2的F中的突变294A)；以及

○氨基酸P取代在所述PIV-5F蛋白的序列中位于位置447或 在PIV-2F蛋白的序列中位于位置445的氨基酸(PIV-5的F中的突变 447P；PIV-2的F中的突变445P)；

●和通过

○选自V、I、L、优选V的疏水氨基酸取代在所述PIV-5F蛋 白中位于位置147或在PIV-2F蛋白中位于位置151的氨基酸(PIV-5的 F中的突变147Hy；PIV-2的F中的突变151Hy)；和/或

○选自V、I、L、优选V的疏水氨基酸取代在所述PIV-5F蛋 白中位于位置158或在PIV-2F蛋白中位于位置162的氨基酸(PIV-5的 F中的突变158Hy；PIV-2的F中的突变162Hy)；

●和任选地

○通过另一酶促切割位点取代所述F蛋白的天然(天然)切割位 点，和/或通过将除了所述F蛋白的天然(或天然)切割位点以外的酶促切 割位点插入所述F蛋白；和/或

○通过使所述F蛋白的C末端部分缺失，所述C末端部分从该 蛋白C末端的最后氨基酸开始在N末端方向上延伸，但是延伸不超出所 述F蛋白的HR2结构域。

针对所述F蛋白的前体形式(F0)的序列(即切割前的F蛋白的序 列)，计算所述氨基酸位置，从而计数从N末端到C末端的位置。

PIV-2F蛋白中所示的位置是对应于PIV-5的F蛋白中所示的那些的 位置：参阅图2B，其给出了位置对应表。

所述PIV-5或PIV-2病毒的F蛋白的序列如上文所限定。因此，它 特别地可以被限定为包含SEQ ID NO：34的序列(PIV-5和PIV-2的F蛋 白的共有序列)。

PIV-5F蛋白的突变蛋白：

根据本发明的一方面，本发明的突变蛋白包含衍生于PIV-5病毒F 蛋白序列的序列：

●SEQ ID NO：31的序列(图1A所呈现的PIV-5的WR分离物的F蛋 白的序列)，或所述可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO：31”的序 列；或

●该SEQ ID NO：31的序列的变异序列，或所述可选序列“在443处 具有S的SEQ ID NO：31”的变异序列，所述变异序列：

○大小与SEQ ID NO：31的序列相同(即由529个氨基酸组成)， 或大小比SEQ ID NO：31的序列大最多7个氨基酸(即由530、531、 532、533、534、535或536个氨基酸组成)，或大小比SEQ ID NO：31的 序列小最多7个氨基酸(即由522、523、524、525、526、527或528个 氨基酸组成)；以及

○与SEQ ID NO：31的序列或与所述可选序列“在443处具有S 的SEQ ID NO：31”具有多于95％、优选至少96％、更优选至少97％的序 列同一性，该同一性利用SEQ ID NO：31的序列长度或(如果合适)利用 所述可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO：31”的序列长度来计算。

优选地，所述PIV-5的F蛋白序列由以下组成：

●SEQ ID NO：31的序列(图1A所呈现的PIV-5的WR分离物的F蛋 白的序列)，或所述可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO：31”；或

●该SEQ ID NO：31的序列的变异序列，或所述可选序列“在443处 具有S的SEQ ID NO：31”的变异序列，所述变异序列：

○大小与SEQ ID NO：31的序列相同(即由529个氨基酸组成)， 或大小比SEQ ID NO：31的序列大最多7个氨基酸(即由530、531、 532、533、534、535或536个氨基酸组成)；以及

○与SEQ ID NO：31的序列或与所述可选序列“在443处具有S 的SEQ ID NO：31”具有多于95％、优选至少96％、更优选至少97％的序 列同一性，该同一性利用SEQ ID NO：31的序列长度或如果适当利用所 述可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO：31”的序列长度计算。

此类变异序列的具体实例包括本申请的表1所呈现的W3A、MIL、 DEN、LN、MEL、隐病毒、CPI+、CPI-、H221、78524、Tl以及SER分 离物(参阅上文)之一的F蛋白的序列，即SEQ ID NO：35-46的序列之一。

优选地，所述PIV-5的F蛋白的序列由SEQ ID NO：31的序列(图 1A所呈现的PIV-5的WR分离物的F蛋白的序列)或所述可选序列“在 443处具有S的SEQ ID NO：31”的序列组成，高度优选所述可选序列 “在443处具有S的SEQ ID NO：31”。

优选地，所述衍生于所述PIV-5的F蛋白的序列的序列，通过上文 所提到的至少所述突变22P、132E、290A、447P以及158Hy，衍生于该 F蛋白序列。

优选地，所述衍生于所述PIV-5的F蛋白的序列的序列，通过上文 所提到的至少所述突变22P、132E、290A、447P以及147Hy，衍生于该 F蛋白序列。

优选地，所述衍生于所述PIV-5的F蛋白的序列的序列，通过上文 所提到的至少所述突变22P、132E、290A、447P、147Hy以及158Hy， 衍生于该F蛋白序列。

所述衍生于PIV-5的F蛋白的序列的序列相对于所述PIV-5的F蛋 白序列，不必包含除了上文所提到的突变22P、132E、290A、447P以 及147Hy/158Hy以外的突变。

可选地，所述衍生于PIV-5的F蛋白的序列的序列可以通过上文提 到的所述突变22P、132E、290A、447P以及147Hy/158Hy和通过除了 上文所提到的这些突变22P、132E、290A、447P以外的至少一个突变 衍生于该F蛋白序列，优选地通过：

●至少一个选自以下的融合前突变：

○位置49的氨基酸被氨基酸A取代；

○位置402的氨基酸被氨基酸A取代；

○位置443的氨基酸被氨基酸P取代；

○位置449的氨基酸被氨基酸P取代；

和/或通过

●至少一个选自以下的融合后突变：

○位置463的氨基酸被疏水氨基酸取代；

优选地，所述衍生于所述PIV-5的F蛋白的序列的序列通过以下方 式衍生于该F蛋白序列：通过上文提到的所述突变22P、132E、290A、 447P以及147Hy/158Hy，和通过：

●至少一个选自以下的融合前突变：

○位置49的氨基酸被氨基酸A取代；

○位置402的氨基酸被氨基酸A取代；

和/或通过

●至少一个选自以下的融合后突变：

○位置463的氨基酸被疏水氨基酸取代。

优选地，所述衍生于所述PIV-5的F蛋白的序列的序列，通过以下 方式衍生于该F蛋白序列：通过上文提到的所述突变22P、132E、 290A、447P以及147Hy/158Hy，和通过至少一个选自以下的融合后突 变：

○位置463的氨基酸被疏水氨基酸取代；

所述选择用来取代位置463的氨基酸的疏水氨基酸有利地选自V、 I、L，优选V。

表4：本发明突变蛋白(PIV-5F蛋白的突变蛋白)的选择

可以将表4所示的突变引入任何PIV-5分离物即WR分离物或变异 分离物的F蛋白中。更特别地，可以将它们引入图1A所呈现的SEQ ID  NO：31的F蛋白序列(可从Genbank数据库获得的WR的F蛋白，登录 号为AB021962)中。

如上文所示，WR分离物的样品，是本发明人从ATCC接受的，并 且用它构建和产生下文实施例所述的突变蛋白，然而该样品在F蛋白的 位置443不具有氨基酸P(与根据可从Genbank获得的序列对其预期的 相反)，而具有氨基酸S。因此可以将表4所示的突变引入所述可选序列 “在443处具有S的SEQ ID NO：31”(SEQ ID NO：62、63、64)中。

PIV-2F蛋白的突变蛋白：

根据本发明的另一方面，本发明的突变蛋白包含衍生自PIV-2病毒 的F蛋白的序列的序列。

所述PIV-2F蛋白的序列如上文所限定。特别是，其可以由以下组 成：

●SEQ ID NO：33的序列(图IB所呈现的PIV-2的Greer分离物的F 蛋白的序列)；或

●该SEQ ID NO：33的序列的变异序列，所述变异序列：

○大小与SEQ ID NO：33的序列相同(即由551个氨基酸组成)， 或大小比SEQ ID NO：33的序列大最多2个氨基酸(即由552或553个氨 基酸组成)，或大小比SEQ ID NO：33的序列小最多2个氨基酸(即由 549或550个氨基酸组成)；和

○与SEQ ID NO：33的序列具有多于95％、优选至少96％、更 优选至少97％的序列同一性，该同一性利用SEQ ID NO：33的序列长度 计算。

优选地，所述PIV-2的F蛋白的序列由以下组成：

●SEQ ID NO：33的序列(图IB所呈现的PIV-2的Greer分离物的F 蛋白的序列)；或

●该SEQ ID NO：33的序列的变异序列，所述变异序列：

○大小与SEQ ID NO：33的序列相同(即由551个氨基酸组成)， 或大小比SEQ ID NO：33的序列大最多2个氨基酸(即由552或553个氨 基酸组成)；以及

○与SEQ ID NO：33的序列具有多于95％、优选至少96％、更 优选至少97％的序列同一性，该同一性利用SEQ ID NO：33的序列长度 计算。

更优选地，所述PIV-2的F蛋白的序列由以下组成：

●SEQ ID NO：33的序列(图1B所呈现的PIV-2的Greer分离物的F 蛋白的序列)；或

●该SEQ ID NO：33序列的变异序列，所述变异序列：

○大小与SEQ ID NO：33的序列相同(即由551个氨基酸组成)； 以及

○与SEQ ID NO：33的序列具有多于95％、优选至少96％、更 优选至少97％的序列同一性，该同一性利用SEQ ID NO：33的序列长度 计算。

高度优选地，所述F蛋白的序列由SEQ ID NO：33的序列组成(图 1B所呈现的PIV-2的Greer分离物的F蛋白的序列)。

优选地，所述衍生于所述PIV-2F蛋白的序列的序列，通过上文所 提到的至少所述突变24P、133E、294A、445P以及162Hy，衍生于该F 蛋白序列。

优选地，所述衍生于所述PIV-2的F蛋白的序列的序列，通过上文 所提到的至少所述突变24P、133E、294A、445P以及151Hy，衍生于该 F蛋白序列。

优选地，所述衍生于所述PIV-2的F蛋白的序列的序列，通过上文 所提到的至少所述突变24P、133E、294A、445P、162Hy以及151H， 衍生于该F蛋白序列。

所述衍生于PIV-5的F蛋白的序列的序列，相对于所述PIV-2的F 蛋白序列而言，不必包含除了上文提到的突变24P、133E、294A、445P 以及151Hy/162Hy以外的突变。

可选地，所述衍生于PIV-2F蛋白的序列的序列，可以通过以下方 式衍生于该F蛋白序列：通过上文提到的所述突变24P、133E、294A、 445P以及151Hy/162Hy，以及通过除了上文提到的这些突变24P、 133E、294A、445P以外的至少一个突变，优选地通过：

●至少一个选自以下的融合前突变：

○位置53的氨基酸被氨基酸A取代；

○位置406的氨基酸被氨基酸A取代；

○位置428的氨基酸被氨基酸P取代；

○位置445的氨基酸被氨基酸P取代；

和/或通过

●至少一个选自以下的融合后突变：

○位置474的氨基酸被疏水氨基酸取代；

优选地，所述衍生于所述PIV-2的F蛋白的序列的序列通过以下方 式衍生于该F蛋白序列：通过上文提到的所述突变24P、133E、294A、 445P以及151Hy/162Hy，以及通过：

●至少一个选自以下的融合前突变：

○位置53的氨基酸被氨基酸A取代；

○位置406的氨基酸被氨基酸A取代；

和/或通过

●至少一个选自以下的融合后突变：

○位置474的氨基酸被疏水氨基酸取代；

优选地，所述衍生于所述PIV-2的F蛋白的序列的序列通过以下方 式衍生于该F蛋白序列：通过上文提到的所述突变24P、133E、294A、 445P以及151Hy/162Hy；和通过至少一个选自以下的融合后突变：

○位置474的氨基酸被疏水氨基酸取代；

所述选择用于取代位置474的氨基酸的疏水氨基酸有利地选自V、 I、L，优选V。

表5：本发明突变蛋白(PIV-2F蛋白的突变蛋白)的选择

可以将表5所示的突变引入任何PIV-2分离物即Greer分离物或变 异分离物的F蛋白中。因此，更特别地，可以将它们引入图IB所呈现 的SEQ ID NO：33的F蛋白序列(Greer的F蛋白；SEQ ID NO：88-90) 中。

SEQ ID NO：88

MHHLHPMIVC IFVMYTGIVG SDAPAGDQLL NIGVIQSKIR SLMYYTDGGA SFIVVKLLPN     60

LPPSNGTCNI TSLDAYNVTL FKLLTPLIEN LSKISTVTDT KTRQKRFAGV VVGLAALGVA     120

TAAQITAAVA IVEANANAAA INNLASSIQS VNKAVSDVID ASRTIATAVQ AIQDRINGAI     180

VNGITSASCR AHDALIGSIL NLYLTELTTI FHNQITNPAL TPLSIQALRI LLGSTLPIVI     240

ESKLNTNFNT AELLSSGLLT GQIISISPMY MQMLIQINVP TFIMQPGAKV IDLAAISANH     300

KLQEVVVQVP NRILEYANEL QNYPANDCVV TPNSVFCRYN EGSPIPESQY QCLRGNLNSC     360

TFTPIIGNFL KRFAFANGVL YANCKSLLCR CADPPHVVSQ DDTQGISIID IKRCSEMMLD     420

TFSFRITSTF NATYVTDFSM INANPVHLSP LDLSNQINSI NKSLKSAEDW IADSNFFANQ     480

ARTAKTLYSL SAIALILSVI TLVVVGLLIA YIIKLVSQIH QFRSLAATTM FHRENPAFFS     540

KNNHGNIYGI S                                                          551

SEQ ID NO：89

MHHLHPMIVC IFVMYTGIVG SDAPAGDQLL NIGVIQSKIR SLMYYTDGGA SFIVVKLLPN     60

LPPSNGTCNI TSLDAYNVTL FKLLTPLIEN LSKISTVTDT KTRQKRFAGV VVGLAALGVA     120

TAAQITAAVA IVEANANAAA INNLASSIQS TNKAVSDVID AVRTIATAVQ AIQDRINGAI     180

VNGITSASCR AHDALIGSIL NLYLTELTTI FHNQITNPAL TPLSIQALRI LLGSTLPIVI     240

ESKLNTNFNT AELLSSGLLT GQIISISPMY MQMLIQINVP TFIMQPGAKV IDLAAISANH     300

KLQEVVVQVP NRILEYANEL QNYPANDCVV TPNSVFCRYN EGSPIPESQY QCLRGNLNSC     360

TFTPIIGNFL KRFAFANGVL YANCKSLLCR CADPPHVVSQ DDTQGISIID IKRCSEMMLD     420

TFSFRITSTF NATYVTDFSM INANPVHLSP LDLSNQINSI NKSLKSAEDW IADSNFFANQ     480

ARTAKTLYSL SAIALILSVI TLVVVGLLIA YIIKLVSQIH QFRSLAATTM FHRENPAFFS     540

KNNHGNIYGI S                                                          551

SEQ ID NO：90

MHHLHPMIVC IFVMYTGIVG SDAPAGDQLL NIGVIQSKIR SLMYYTDGGA SFIVVKLLPN     60

LPPSNGTCNI TSLDAYNVTL FKLLTPLIEN LSKISTVTDT KTRQKRFAGV VVGLAALGVA     120

TAAQITAAVA IVEANANAAA INNLASSIQS VNKAVSDVID AVRTIATAVQ AIQDRINGAI     180

VNGITSASCR AHDALIGSIL NLYLTELTTI FHNQITNPAL TPLSIQALRI LLGSTLPIVI     240

ESKLNTNFNT AELLSSGLLT GQIISISPMY MQMLIQINVP TFIMQPGAKV IDLAAISANH     300

KLQEVVVQVP NRILEYANEL QNYPANDCVV TPNSVFCRYN EGSPIPESQY QCLRGNLNSC     360

TFTPIIGNFL KRFAFANGVL YANCKSLLCR CADPPHVVSQ DDTQGISIID IKRCSEMMLD     420

TFSFRITSTF NATYVTDFSM INANPVHLSP LDLSNQINSI NKSLKSAEDW IADSNFFANQ     480

ARTAKTLYSL SAIALILSVI TLVVVGLLIA YIIKLVSQIH QFRSLAATTM FHRENPAFFS     540

KNNHGNIYGI S                                                          551

切割位点：

根据本发明，本发明的突变蛋白可以包含通过以下方式衍生于PIV- 5或PIV-2病毒的F蛋白的序列的序列：

●上文所提到的突变；且还通过

●所述F蛋白的天然切割位点被另一酶促切割位点取代，和/或通过 将除了该F蛋白的天然切割位点以外的酶促切割位点插入所述F蛋白， 优选地通过所述F蛋白的天然切割位点被另一酶促切割位点取代。

PIV-5或PIV-2F蛋白的切割位点是该蛋白的两个亚基(F1和F2)的切 割位点。

在天然形式的PIV-5和PIV-2的F蛋白中，该切割位点是受弗林蛋 白酶切割的位点。

在天然形式的PIV-5的F蛋白中，该切割位点由序列RRRRR(SEQ  ID NO：23)组成。其位于天然形式的PIV-5的F蛋白的位置98-102(参阅 图1A)。包含PIV-5的F蛋白的天然(天然)切割位点的PIV-5F蛋白序列 的片段的实例是：

IGENLETIRNQLIPTFAGVVIGL(SEQ ID NO：24)。

在天然形式的PIV-2F蛋白中，该切割位点由序列KTRQKR(SEQ ID NO：25)组成。其位于天然形式的PIV-2F蛋白的位置101-106(参阅 图IB)。包含PIV-2的F蛋白的天然(天然)切割位点的PIV-2F蛋白序列 的片段的实例是 LTPLIENLSKISTVTDTFAGVVVGLAALGVA(SEQ ID NO： 26)。

优选地，所述除了天然切割位点以外的切割位点是组织特异性切割 位点。

优选地，所述除了天然切割位点以外的切割位点是一种肿瘤组织或 多种肿瘤组织特异性表达的酶的切割位点，高度优选一种转移性组织或 多种转移性组织特异性表达的酶的切割位点。

作为实例，所述除了天然切割位点以外的切割位点可以是金属蛋白 酶的切割位点，如基质金属蛋白酶9(MMP-9)的切割位点；参阅下文的 实施例2。

基质金属蛋白酶9(MMP-9)的切割位点可以包含序列PXXHy S/T (SEQ ID NO：27)或由其组成，其中X＝任何氨基酸，且其中Hy＝任何疏 水氨基酸(即选自F、M、V、L、I的任何氨基酸)。

作为实例，基质金属蛋白酶9(MMP-9)的切割位点可以包含序列 PRRIT(SEQ ID NO：28)和/或序列 IGENLETIRNQLIPTFAGVVIGL(SEQ ID NO：29)，或由其组成。

本发明的核酸：

本申请还涉及编码(根据通用遗传密码并允许该密码的简并性)本发 明突变蛋白的核酸、DNA或RNA，并涉及这类核酸的互补核酸(优选相 同长度的互补核酸)。

这类核酸衍生于以下的序列：SEQ ID NO：30(编码天然PIV-5F蛋白 的序列)，或编码所述可选序列“在443处具有S的SEQ ID NO：31”的可 选序列，编码变异F蛋白的变异序列，或甚至SEQ ID NO：32的序列(编 码天然PIV-2F蛋白的序列)或编码变异F蛋白的变异序列。

本发明的载体：

本申请还涉及包含至少一种本发明核酸的核酸载体，特别是转染、 转导或转化载体。

有利的是，此类载体可以是表达载体。

优选地，其是允许所述至少一种核酸在动物细胞(非人类动物细胞和 /或人类细胞)中表达的载体，更优选：

●在人类细胞中，有利的是，在病理性人类细胞中，更特别是人类 肿瘤细胞，更优选转移性黑素瘤细胞；或

●在胎盘细胞中。

有利的是，此类表达载体可以是腺病毒载体。

所述腺病毒载体可以包含调节所述核酸表达的元件，优选启动子， 从而允许所述核酸在肿瘤细胞、优选在转移性细胞、更优选在转移性黑 素瘤细胞中表达。

优选地，该表达是特异性的。有利的是，该表达的特异性足以允许 所述核酸在所述肿瘤细胞或转移性细胞中表达，而在非肿瘤(非转移性) 细胞中无显著表达。

有利的是，此类腺病毒载体是溶瘤腺病毒载体。

有利的是，本发明的表达载体可以是包含调节所述核酸表达的元件 优选启动子的腺病毒载体，从而允许所述核酸在胎盘细胞优选在融合性 不足的病理性胎盘细胞中表达。

优选地，该表达是特异性的。有利的是，该表达的特异性足以允许 所述核酸在所述胎盘细胞中表达，而在非胎盘细胞中无显著表达。

本发明的载体可选地或补充地可以是允许将所述至少一种核酸插入 动物细胞(非人类动物细胞和/或人类细胞)、更优选人类细胞、有利的是 病理性人类细胞、更特别是人类肿瘤细胞、优选转移性人类细胞、更优 选转移性黑素瘤细胞的基因组的载体。这类载体特别用于肿瘤、特别是 转移性肿瘤、更特别是转移性黑素瘤的基因治疗。

本申请还涉及这样的载体，其包含至少一种本发明的核酸，并且允 许将所述至少一种核酸插入动物细胞(非人类动物细胞和/或人类细胞)、 更优选人类细胞、有利的是胎盘细胞、优选人类胎盘细胞的基因组。这 类载体特别用于与缺陷型胎盘发育有关的疾病或状况的基因治疗。

本发明的细胞：

本申请还涉及包含至少一种本发明的突变蛋白和/或至少一种本发明 的核酸、DNA或RNA和/或至少一种本发明的载体的细胞。

这类细胞可以是人类细胞或非人类动物细胞。

优选地，这类细胞是肿瘤细胞，优选转移性细胞、更优选转移性黑 素瘤细胞。

如下文所述，这类细胞可用作具有能够诱导合胞体形成的融合能力 的细胞。

可选地，本发明的细胞可以是人类或非人类动物免疫系统的非肿瘤 细胞，优选非肿瘤人类或非人类动物树突细胞，所述细胞在其表面表达 至少一种本发明的突变蛋白。如下文所述，这类细胞可用作能通过例如 主动免疫诱导细胞融合抑制剂产生的试剂。

医疗应用(促融合)：

本发明的突变蛋白和/或本发明的核酸、DNA或RNA和/或本发明 的载体和/或本发明的细胞可以用于治疗和/或预防和/或减轻与病理性或 不利于生物体健康的细胞的存在或增殖有关的疾病或状况，更特别是用 于治疗和/或预防和/或减轻与细胞融合性不足有关的疾病或状况，优选 用于治疗和/或预防和/或减轻诸如肿瘤、转移性肿瘤、有利的是转移性 黑素瘤的疾病或瘤性状况。

可以通过减少或除去这些病理性和/或不利的细胞，治疗和/或预防 和/或减轻这类疾病或状况。

在这类细胞的表面所表达的本发明的突变蛋白会诱导这些细胞的融 合，结果是形成合胞体，从而导致这些细胞的破坏(或至少数量减少)。

本发明的突变蛋白和/或本发明的核酸、DNA或RNA和/或本发明 的载体和/或本发明的细胞，可以用于治疗和/或预防和/或减轻与胎盘发 育缺陷有关的疾病或状况。

可以通过诱导或刺激胎盘细胞融合，治疗和/或和/或预防和/或减轻 这类疾病或状况。

本申请因此还涉及药物组合物或药物，其包含至少一种本发明的突 变蛋白和/或至少一种本发明的核酸、DNA或RAN和/或至少一种本发 明的载体和/或本发明的细胞。

特别是，这类药物组合物或这类药物用于治疗和/或预防和/或减轻 上文所述的与病理性或不利于生物体健康的细胞的存在和/或增殖有关的 疾病或状况(作为实例，肿瘤、转移性肿瘤、转移性黑素瘤)，或治疗和/ 或预防和/或减轻与细胞融合性不足有关的疾病或状况(作为实例，胎盘 发育缺陷)。

这类药物组合物或这类药物还可以包括至少一种药学和/或生理学上 可接受的介质(vehicle)。

本发明的突变蛋白(或本发明的核酸、DNA、RNA或表达载体)可用 于被人类细胞或非人类动物细胞表达，优选在这类细胞的表面表达。

该细胞可以是病理性细胞，优选肿瘤细胞，更优选转移性细胞，更 优选转移性黑素瘤细胞，或其可以是非肿瘤细胞，例如健康细胞。

更特别地，已经从人类患者或患病的非人类动物个体除去的病理性 细胞，可以通过与至少一种本发明的突变蛋白和/或至少一种本发明的核 酸、DNA或RNA和/或至少一种本发明的表达载体接触来离体(或体外) 处理以便使其表达本发明的突变蛋白。

可选地或补充地，然而，可以除去与所述患者或个体的病理性细胞 位置靠近的非病理性细胞，以便经历所述处理。

可以将如此离体(或体外)处理的细胞再次给予所述患者或个体。

这类细胞用于治疗和/或预防和/或减轻侵袭所述患者的病理，例如 肿瘤、转移性肿瘤、转移性黑素瘤。

可选地，该细胞可以是胎盘细胞，特别是患有融合性不足的胎盘细 胞。一旦通过在其表面表达本发明的突变蛋白被处理，这类细胞可用于 治疗和/或预防和/或减轻胎盘发育缺陷。

本申请因此更特别涉及本发明的突变蛋白，本发明的核酸、DNA或 RNA，本发明的载体，本发明的细胞，在治疗和/或预防和/或减轻疾病 或瘤性状况、优选肿瘤、更优选转移性肿瘤、高度优选转移性黑素瘤中 的用途。

本申请还特别涉及本发明的突变蛋白，本发明的核酸、DNA或 RNA，本发明的载体，本发明的细胞，在治疗和/或预防和/或减轻胎盘 发育缺陷中的用途。

本发明的融合抑制剂：

本申请还涉及能减少或阻断细胞融合的产物。这些产物是本发明一 种或多种突变蛋白的抑制剂。

这类抑制剂可用于治疗和/或预防和/或减轻与细胞融合性过度有关 的疾病或状况，优选用于治疗和/或预防和/或减轻包膜病毒感染(如HIV 感染、流感感染或副流感感染或棒状病毒感染)、过敏反应、自身免疫病 或移植排斥。

优选地，本发明的抑制剂是：

●针对本发明的突变蛋白的抗体或这类抗体的Fab或F(ab’)2片段； 或

●与至少一种本发明的突变蛋白或与本发明的核酸、DNA、RNA特 异性结合的核酸适体或肽适体；或

●在其表面表达至少一种本发明的突变蛋白的重组免疫系统细胞， 优选重组树突细胞；或

●本发明核酸的反义核酸；或

●包含双链RNA的小干扰RNA即siRNA，其含有能与本发明的核 酸结合(杂交)的19-22个核苷酸。

本申请因此还涉及人类或非人类动物免疫系统的非肿瘤细胞，优选 人类或非人类动物树突细胞，所述细胞在其表面表达至少一种本发明的 突变蛋白，还涉及该细胞在治疗和/或预防和/或减轻与细胞融合性过度 有关的疾病或状况中的用途，优选在治疗和/或预防和/或减轻包膜病毒 感染(如HIV感染、流感感染、副流感感染、棒状病毒感染)、过敏反 应、自身免疫病或移植排斥中的用途。

本申请还涉及针对本发明一种突变蛋白或针对本发明几种突变蛋白 的抗体。优选地，该抗体是本发明所述突变蛋白的特异性抗体。有利的 是，该抗体是单克隆抗体。本发明的抑制剂可以是此类抗体的保守片 段，如Fab或F(ab′)2片段。

此类抗体或抗体片段可用于阻断或抑制细胞融合机制，例如通过给 予有需要的患者或者个体所述抗体或抗体片段。

可选地或补充地，本发明的突变蛋白自身可用于给予所述患者或个 体，以便诱导针对该蛋白的主动免疫，即以便诱导所述患者或个体产生 抗突变蛋白抗体。如果需要或期望，可以共同或在不同时间给予一种或 多种疫苗佐剂和所述一种突变蛋白或所述多种突变蛋白。

本申请因此还涉及治疗性和/或预防性和/或减轻性疫苗，其包含作 为免疫原性试剂的至少一种本发明的突变蛋白，和有利地至少一种免疫 佐剂。这类疫苗可以用于治疗和/或预防和/或减轻与细胞融合性过度有 关的疾病或状况，优选用于治疗和/或预防和/或减轻包膜病毒感染(如 HIV感染、流感感染、副流感感染、棒状病毒感染)、过敏反应、自身免 疫病或移植排斥。

本申请还涉及：

●与至少一种本发明的突变蛋白或与本发明的核酸、DNA、RNA 特异性结合的核酸适体或肽适体；

●在其表面表达至少一种本发明的突变蛋白的重组免疫系统细胞， 优选重组树突细胞；

●本发明核酸的反义核酸；

●包含双链RNA的小干扰RNA即siRNA，其含有能与本发明的核 酸结合(杂交)的19-22个核苷酸，从而有利地阻断或抑制所述核酸转 录。

这类产物也是本发明的抑制剂。它们因此可以用于治疗和/或预防和 /或减轻如上文所述的与细胞融合性过度有关的疾病或状况。更特别地， 它们用于治疗和/或预防和/或减轻与至少一种表达或超表达F蛋白的基 因有关的疾病或状况。

本申请因此还涉及包含本发明至少一种抑制剂的药物组合物或药 物。

特别是，此类药物组合物或此类药物可以用于治疗和/或预防和/或 减轻如上文所述的与细胞融合性过度有关的疾病或状况。

此类药物组合物或此类药物还可以包含至少一种药学和/或生理学上 可接受的介质。

本申请特别涉及本发明的抑制剂在治疗和/或预防和/或减轻与细胞 融合性过度有关的疾病或状况中的用途，所述疾病或状况是包膜病毒感 染(优选HIV感染和/或流感感染和/或副流感感染和/或棒状病毒感染)、 过敏反应、自身免疫病或移植排斥。

本申请特别涉及本发明的突变蛋白作为免疫原性试剂在治疗和/或预 防和/或减轻与细胞融合性过度有关的疾病或状况中的用途，所述疾病或 状况是包膜病毒感染(优选HIV感染和/或流感感染和/或副流感感染和/ 或棒状病毒感染)、过敏反应、自身免疫病或移植排斥。

更特别地，本申请涉及疫苗或疫苗组合物，特别是用于治疗和/或预 防和/或减轻与细胞融合性过度有关的疾病或状况的疫苗或疫苗组合物， 所述疾病或状况是包膜病毒感染(优选HIV感染和/或流感感染和/或副流 感感染和/或棒状病毒感染)、过敏反应、自身免疫病或移植排斥。这类 疫苗或疫苗组合物包含至少一种本发明的突变蛋白，和任选地至少一种 生理学上可接受的佐剂。

诊断和预后应用：

本申请还涉及诊断或预后疾病或状况的方法，特别是体外方法，所 述疾病或状况与以下有关：

●合胞体形成不足，如肿瘤、转移性肿瘤、转移性黑素瘤，或胎盘 发育缺陷；或相反，

●合胞体形成过量，如包膜病毒感染(优选HIV感染和/或流感感染 和/或副流感感染和/或棒状病毒感染)、过敏反应、自身免疫病或移植排 斥。

本发明的诊断或预后方法包括，检测例如生物样品中如从正经历所 述诊断或预后的患者或个体采集的生物样品中的至少一种本发明的突变 蛋白或至少一种本发明的核酸。

该检测可以例如通过对所述样品中所含的蛋白或核酸进行测序来进 行。

例如，可以通过利用与至少一种本发明的突变蛋白结合的抗体、肽 适体或寡核苷酸适体，特别是利用本发明的抗体、肽适体或寡核苷酸适 体，检测所述至少一种突变蛋白，来进行该检测。

例如，可以通过利用与至少一种本发明的核酸结合的核酸、肽适体 或寡核苷酸适体，特别是利用与本发明的核酸、本发明的肽适体或寡核 苷酸适体互补的核酸，检测所述至少一种核酸，来进行该检测。

本申请还涉及所述抗体、肽适体、寡核苷酸适体、互补核酸在诊断 或预后合胞体形成不足或相反合胞体形成过量的方法中的用途。

生物技术应用(筛选)：

本申请还涉及筛选能减少或阻断合胞体形成的化合物的方法，特别 是体外方法。本发明的方法包括，使候选化合物与表达至少一种本发明 的突变蛋白的细胞接触，以便确定所述候选化合物是否减少或阻断所述 细胞的融合(例如通过比较在所述候选化合物存在时实现的融合程度与在 其不存在时所实现的融合程度)。

这类化合物是用于治疗和/或预防和/或减轻与细胞融合性过度如包 膜病毒感染、过敏反应、自身免疫病或移植排斥有关的疾病或状况的候 选活性成分。

生物技术应用(骨髓瘤、杂交瘤)

本申请还涉及肿瘤细胞，特别是骨髓瘤，其包含至少一种本发明的 突变蛋白，优选在其表面包含至少一种此类突变蛋白，和/或包含至少一 种本发明的核酸，和/或包含至少一种本发明的载体，特别是本发明的表 达载体。

特别地，这类肿瘤细胞，特别是这类骨髓瘤可以用于产生杂交瘤(通 过使该肿瘤细胞与B淋巴细胞融合)，特别是用于产生生成抗体的杂交 瘤。

本申请还涉及杂交瘤，特别是生成抗体的杂交瘤，其包含至少一种 本发明的突变蛋白，和/或至少一种本发明的核酸，和/或至少一种本发 明的载体。特别是，可通过使至少一种B淋巴细胞与至少一种肿瘤细胞 特别是骨髓瘤接触，产生这类杂交瘤，所述肿瘤细胞特别是骨髓瘤包含 至少一种本发明的突变蛋白，优选在其表面包含至少一种此类突变蛋 白，和/或包含至少一种本发明的核酸，和/或包含至少一种本发明的载 体。此类肿瘤细胞具有固有的融合能力：其因此能与所述至少一种B淋 巴细胞融合，而无需使用聚乙二醇(PEG)或电穿孔手段或在现有技术中 通常用来诱导肿瘤细胞与B淋巴细胞融合旨在产生杂交瘤的任何其他手 段。

生物技术应用(干细胞或祖细胞)：

本申请还涉及干细胞或祖细胞，其包含至少一种本发明的突变蛋 白，优选在其表面包含至少一种此类突变蛋白，和/或包含至少一种本发 明的核酸，和/或包含至少一种本发明的载体，特别是本发明的表达载 体。

这类干细胞或祖细胞具有固有的融合能力：其因此能通过融合形成 合胞体。

如果该干细胞或祖细胞也具有分化成肌细胞的能力，则其能形成肌 纤维(通过细胞融合并形成合胞体)。

因此，本发明还涉及此类干细胞或祖细胞在肌纤维的产生，例如在 体外产生中的用途。

可以通过使多个所述干细胞或祖细胞在允许干细胞或祖细胞(如果 合适的话)增殖的培养基上或中彼此接触，实施该产生，从而行使所述 干细胞或祖细胞的融合能力，由此诱导合胞体特别是肌纤维的形成。允 许干细胞或如果合适，允许祖细胞增殖且还适于表达它们可能的分化成 肌细胞特别是肌纤维的能力的培养基的实例，对本领域技术人员而言是 已知的；一个实例是MCDB培养基。

允许观察干细胞或祖细胞分化成肌细胞特别是分化成肌纤维的细胞 标志物的实例，对本领域技术人员而言也是已知的，例如CD56。

在本申请中，“包括”或“含有”同义的术语“包含”是开放式术语，其 不排除没有被清楚指出的一个或多个其他元件、成分或步骤的存在，而 术语“由……组成”或“组成为”是封闭式术语，其排除没有被清楚指出的 任何其他元件、步骤或成分的存在。术语“基本上由……组成”或“基本上 组成为”是部分开放式术语，其不排除一个或多个其他元件、成分或步 骤的存在，只要这些其他元件、成分或步骤不在本质上影响基于本发明 的特性。

因此，术语“包含(comprising)或包含(comprise(s))”包括术语“由…… 组成”、“组成为”以及术语“基本上由……组成”和“基本上组成为”。

本申请所引用的文献和参考书目的内容在此通过引用并入。

下列实施例仅以说明的方式给出，并非以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：突变体的构建和其融合性的测量

方法和设备：

细胞和病毒

细胞系LLC-MK2(恒河猴(Macaca mulatta)肾细胞系)从美国菌种保 藏中心获得，登录号为CCL-7。

细胞系A549(人肺癌细胞系)从ATCC获得，登录号为CCL-185。

重组系HuH7-Tat(人肝细胞瘤细胞系)通过HIV-1Tat转导HuH-7系 的细胞获得。

HuH-7系可从日本研究生物资源收藏中心(Japanese Collection of  Research Bioresources)获得，参考号为JCRB0403。

利用转导Tat质粒的逆转录病毒LXSN-tat，实施通过HIV-Tat转导 HuH-7系。

将细胞LLC-MK2、A549和HuH7-Tat培养于具有5％胎牛血清的 EMEM(Eagle’s Minimum Essential Medium)或DMEM(Dulbecco/Vogt Modified Eagles′Essential Minimal Medium)中。

PIV-5WR毒株从ATCC(编号ATCC VR-288)获得，并如Terrier et  al，2008所述培养于LLC-MK2细胞中。

RNA的提取、RT-PCR和克隆

按照供应商提供的说明书，利用Absolutely RNAMicroprep Kit (Stratagene，USA)，从获自PIV-5感染的LLC-MK2细胞的上清液提取病 毒RNA。利用pd(N)6随机六聚体(Amersham Biosciences，GB)和禽成髓 细胞瘤病毒AMV的逆转录酶(Reverse Transcriptase；RT)(AMV-RT逆转 录酶可从Promega获得)，进行逆转录。

用可从数据库(GenBank登录号AB021962)获得的PIV-5的核苷酸序 列设计的引物对，扩增PIV-5F的完整序列。

所用的引物如下：

有义引物(SEQ ID NO：1)：

5′TTGCGGCCGCATGGGTACTATAA 3′

反义引物(SEQ ID NO：2)：

5′CCGCTCGAGTTATGATAAACAAAATTCTCC 3′

根据以下方案进行扩增：95℃2min(分钟)，接着39个循环 (95℃/30s、55℃/1min，72℃/3min)，最后于72℃延伸10min。

将PIV-5F的互补DNA克隆到表达质粒pcDNA3.1(+)多克隆位点的 NotI和XhoI位点(参阅图4)。

按照供应商提供的说明书，利用NucleospinExtractII和 Nucleospin质粒试剂盒(Macherey Nagel，Germany)，分别纯化PCR产物 和质粒。

本研究的测序系列通过MWG Biotech(Ebersberg，Germany)实施 。

利用聚合酶链式反应(PCR)的定向诱变

PIV-5的F蛋白的突变蛋白通过在编码PIV-5F融合蛋白的质粒 pcDNA3.1中的定向突变产生。利用互补引物，按照供应商(可从 Stratagene获得的QuickChange定点诱变系统)所提供的方案，通过 PCR产生突变。所用的引物列表提供于下文的表2中。通过测序，检测 质粒的组装。

理论上，突变443P预先存在于WR分离物的F蛋白中。然而，在 本发明人从ATCC收到的该分离物的样品中，该突变实际上并不存在。 因此本发明人必须引入该突变。

细胞的转染

在试剂ExGen500(Fermentas)的帮助下，按照供应商所提供的说明 书，用质料转染细胞。将1-3微克质粒DNA添加到细胞(70-80％汇合) 中，持续48h(小时)。利用编码绿色荧光蛋白GFP的质粒，评估转染效 率。

通过共聚焦显微镜进行的免疫荧光

利用磷酸盐缓冲液PBS中的多聚甲醛(1％v/v)，固定转染的细胞， 随后洗涤两次。在针对PIV-5F蛋白的、在PBS中稀释至1/10的单克隆 抗体存在的情况下，将细胞团孵育3h，在本次情况下，单克隆抗体为 Randall et al，1987所述的单克隆抗体F1a。通过针对PIV-5分离物(在本 次情况下为LN分离物)免疫小鼠、制备杂交瘤并选择特异性抗F抗体， 已获得单克隆抗体F1a。

随后洗涤细胞团，并用在PBS中稀释至1/200的抗小鼠IgG-Alexa Fluor633二抗(Invitrogen)孵育30分钟。漂洗后，将细胞用1/1000的 Dapi(4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚)孵育10分钟，所述Dapi在磷酸盐缓冲液 PBS中与1/200的偶联Alexa Fluor488的小麦胚芽凝集素(WGA) (WGA-Alexa Fluor可从Invitrogen获得)混合或不与之混合。利用TCS SP2共聚焦显微镜(Leica)获得图像。

流式细胞术

如文献(Horvat and Lamb 1992)中所述，进行流式细胞术。用编码各 种Fus的质粒转染A549细胞，并将其存放于冰上。用包含1％叠氮化钠 的磷酸盐缓冲液PBS，漂洗细胞团。随后将单克隆抗PIV-5的F蛋白抗 体(在本次情况下为单克隆抗体F1a)添加到细胞团(具有1％的胎牛血清的 1/500PBS磷酸盐缓冲液)，于4℃孵育30分钟。随后漂洗细胞团，并在 以1/1000偶联于Alexa Fluor488(Invitrogen)的抗小鼠二抗存在的情况 下孵育。漂洗后，利用500μL PBS磷酸缓冲液0.5mM，在EDTA(乙二 胺四乙酸)中轻轻地分离细胞。将细胞转移到含有500μL 1％多聚甲醛溶 液的专用的流式细胞计数管中。利用荧光激活的细胞分选术 (fluorescence-activated cell sorting，FACS)，在本次情况下利用来自 Becton Dickinson的FACSVantage^TM SE流，测量5000个细胞的荧光强 度。

半定量融合试验(确立为合胞体尺寸和细胞核数量的函数的融合得分)

被各种Fus表达质粒转染的和在荧光免疫中所观察到的细胞团，允 许进行半定量分析。该分析由利用下述标准确定每个突变体的融合得分 组成：

●融合或其他(简单凝聚)，表示为-/+；

●合胞体的尺寸，级别：1-5；

●细胞核的数量，级别：1-5。

由此计算的得分通过添加两个限度(mark)获得：最大理论限度因此 是10，并对应于具有最多数量的细胞核的合胞体的最大尺寸。

定量融合试验(荧光素酶活性测量)

为了定量细胞-细胞融合，“供体”A549细胞(6孔板的每个孔有2.5百 万个细胞)，用2μg编码各种Fus突变蛋白的质粒pcDNA3.1以及50ng 依赖长末端重复LTR表达荧光素酶的质粒共转染(Lavillette et al， 2007)。

用2μg空质粒pcDNA3.1共转染的细胞提供阴性对照。

转染后12小时，利用EDTA中0.5mM的磷酸盐缓冲液(PBS)，分 离“供体”细胞，并计数，随后放回新鲜的6孔板(10⁵个细胞/孔)中。利用 PBS-EDTA缓冲液，分离“指示剂”HuH7-Tat细胞(4×10⁵个细胞/孔)，然 后漂洗，并添加到“供体”细胞中。

在共培养72h后，利用荧光素酶活性测量试剂盒，在本次情况下是 来自Promega的荧光素酶测定系统(Luciferase Assay System(E1500))试剂 盒，按照供应商所提供的说明，测量荧光素酶活性。

结果：

本发明人构建和产生的突变蛋白显示于上文的表3中。

在该表3中，本发明人已经整理多种突变作为归因于它们的功能的 函数，即：

●对于HN，参与自主性的功能：PIV-5的F蛋白的位置22、132和 290；

●参与融合前功能：PIV-5的F蛋白的位置49、402、443、447以 及449；

●参与融合后功能：PIV-5的F蛋白的位置147、158以及463。

图5A、5B、5C以及5D说明表3突变的位置。

本发明人因此构建、产生和测试了突变蛋白。

在构建和产生这些突变蛋白过程中所用的PIV-5的F蛋白序列是 WR分离物的可选F蛋白序列。该可选序列与SEQ ID NO：31的序列 (Genbank序列)相同，例外是位置443的氨基酸是S而不是P(可选序列 “在443处具有S的SEQ ID NO：31”)。

SEQ ID NO：47-79的序列因此是来自在所述可选序列“在443处具有 S的SEQ ID NO：31”内取代上文表3中这些序列中的每一序列所显示的 氨基酸的序列。

在半定量融合试验过程中，显微镜下所得到的观察结果的示例，呈 现于图6A中。

在半定量融合试验结束时所获得的得分，呈现图6B中。

突变蛋白Fus6、Fus6.1、Fus6.2以及Fus6.3导致许多细胞凝聚，但 不导致细胞融合。

突变蛋白Fus3.3、Fus3.1、Fus2、Fus1.1、Fus1.2以及Fus1产生的 融合得分为0。

突变蛋白Fus9、Fus7、Fus3、Fus5以及Fus4产生了低融合得分。

超过Fus4的融合得分，具有显著融合得分的一系列突变蛋白分离 开来，即：

●共同包含3个自主性突变和融合前突变449P的突变蛋白组：如突 变蛋白Fus8、Fus10、Fus10.4、Fus10.5、Fus11、Fus8.1、Fus8.2、 Fus8.4、Fus8.5、Fus8.6、Fus8.7、Fus10.1、Fus10.2、Fus10.3以及

●共同包含3个自主性突变、融合前突变447P以及至少一个融合后 突变(147V或158V)的突变蛋白组，如Fus7.1、Fus7.2或Fus7.3。

图7A和7B呈现了显微镜观察结果的说明，以及呈现了选择所测试 的突变蛋白的融合得分，即共同包含以下的突变蛋白组：

●3个自主性突变；

●融合前突变447P；以及

●位置147和/或158的至少一个融合后突变，以便在这一/这些位置 呈现疏水氨基酸，如V、I或L，例如融合后突变147V和/或融合后突变 158V；如突变蛋白Fus7.1、Fus7.2以及Fus7.3。

实施例2：转移性肿瘤组织所特异性表达的酶的切割位点取代天然 切割位点

之前已经通过取代天然F蛋白的天然切割位点，例如，用组织特异 性切割位点取代它，修饰了本发明的突变蛋白，特别是上文实施例1所 述的突变蛋白。

作为示例，PIV-5的F蛋白的天然切割位点已经被转移性肿瘤组织 所特异性表达的酶即基质金属蛋白酶9(MMP-9)的位点取代。

PIV-5的F蛋白的天然切割位点是：

(SEQ ID NO：23)。

包含PIV-5F蛋白天然切割位点的F蛋白序列的片段的实例是

IGENLETIRNQLIPTFAGVVIGL(SEQ ID NO：24)。

MMP-9切割位点的共有序列是：

(SEQ ID NO：27)

其中X＝任何氨基酸，以及

其中Hy＝任何疏水氨基酸(即选自F、M、V、L、I的任何氨基 酸)。

MMP-9切割位点的实例是：

(SEQ ID NO：28)。

包含MMP-9切割位点的本发明突变F蛋白序列的片段的实例是：

IGENLETIRNQLIPTFAGVVIGL(SEQ ID NO：29)。

方法和设备：

如上文实施例1所述，产生PIV-5的F蛋白的突变蛋白。

如下实施用所选的切割位点取代天然切割位点，在本次情况下是用 SEQ ID NO：28的MMP-9切割位点取代天然切割位点：

在编码融合蛋白F PIV-5的质粒pcDNA3.1中，通过3个连续定向 诱变，进行切割位点的取代。利用互补引物、按照供应商所示的方案 (QuickChange定点诱变系统可从Stratagene获得)，通过PCR产生突 变。通过测序检查质粒的组装。

第一突变R98P

有义5′CCAGTTGATTCCAACTCCGAGGAGACGCCGGTTTGC 3′(SEQ  ID NO：80)

反义5′GCAAACCGGCGTCTCCTCGGAGTTGGAATCAACTGG 3′ (SEQ ID NO：81)

第二突变R101I

有义5′GATTCCAACTCCGAGGAGAATCCGGTTTGCAGGAGTGGTG 3′(SEQ ID NO：82)

反义5′CACCACTCCTGCAAACCGGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3′ (SEQ ID NO：83)

第三突变R102T

有义

5′GATTCCAACTCCGAGGAGAATCACGTTTGCAGGAGTGGTGATTG G3′(SEQ ID NO：84)

反义

5′CCAATCACCACTCCTGCAAACGTGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3′(SEQ ID NO：85)

细胞转染

在试剂ExGen500(Fermentas)的帮助下，按照供应商所提供的说明 书，用质粒转染细胞。将1-3微克质粒DNA添加到细胞(70-80％汇 合)，持续48h。在编码绿色荧光蛋白GFP的质粒的帮助下，评估转染的 效率。

通过共聚焦显微镜进行的免疫荧光

在磷酸盐缓冲液PBS中的多聚甲醛(1％v/v)的帮助下，固定转染的 细胞，然后洗涤两次。在针对融合蛋白PIV-5F、在PBS中稀释至1/10 的单克隆抗体存在的情况下，将细胞团孵育3h，在本次情况下，所述单 克隆抗体是Randall et al，1987所述的单克隆抗体F1a。通过针对PIV-5 的分离物(在本次情况下为LN分离物)免疫小鼠、制备杂交瘤并选择特 异性抗F抗体，已获得单克隆抗体F1a。

随后洗涤细胞团，并用在PBS中稀释至1/200的抗小鼠IgG-Alexa Fluor633二抗(Invitrogen)孵育30分钟。漂洗后，将细胞用1/1000的 Dapi(4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚))孵育10分钟，所述Dapi在磷酸盐缓冲 液PBS中与1/200的偶联Alexa Fluor488的小麦胚芽凝集素WGA (WGA-Alexa Fluor可从Invitrogen获得)混合或不与之混合。利用 TCS SP2共聚焦显微镜(Leica)，获得图像。

参考文献

Baker et al，1999，Mol Cell.3(3)：309-19.

Chatziandreou et al，2004，Journal of General Virology 85：3007-3016.

Horvat and Lamb 1992，J.Virol.66(4)：2443-2455.

Ito et al 1997，J Virol.71(12)：9855-9858.

Ito et al，2000，J Gen Virol.81(Pt 3)：719-727.

Gardner and Dutch 2007，J.Virol.81(15)：8303-14.

Gardner et al，2007，Biochemistry 46(17)：5094-5105.

Lavillette D.et al，2007，J.Virol.81(16)：8752-8765.

Paterson et al，2000，Virology 270(1)：17-30.

Randall et al，1987，J.Gen.Virol.68(Pt 11)：2769-2780.

Russell et al，2003，J.Cell Biol.163(2)：363-74.

Terrier et al，2008，Journal of Clinical Virology，2008，43(1)：86-92.

West et al，2005，J Virol.79(3)：1543-1551.