一种甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法

摘要

本发明提供一种甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，以经分离得到的甲型副伤寒沙门菌为分析样品，依次进行以下各步骤：胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳；其中，所述的胶块制备、细胞裂解、洗胶块和加样步骤都按照常规脉冲场凝胶电泳方法进行；所述的胶块内DNA的酶切是以Spe I作为首选酶，Xba I作为次选酶，Xho I作为第三种酶；所述的电泳参数中，Spe I酶对应的脉冲时间为1-20s，19-20h；Xba I酶对应的脉冲时间为1.5-29s，19-20h；Xho I酶对应的脉冲时间为2.2-29s，19-20h。本发明的方法对甲型副伤寒沙门菌的分辨率相对现有技术显著提高，能够有效的应用于甲型副伤寒沙门菌的分子分型或基因组变异的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种凝胶电泳方法，具体涉及一种用于甲型副伤寒沙门菌的脉冲场凝胶电泳 方法。

背景技术

甲型副伤寒沙门菌(S.paratyphi A)的潜伏期长，一般为8-10天。当发生一起甲型副伤 寒沙门菌的暴发时，追踪溯源是很困难的。如果脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法的区分能 力不强，就加大了追踪溯源的难度。因此发展适用性强的甲型副伤寒沙门菌的PFGE方法是 非常必要的。

以前有研究已经证明许多因素可以影响PFGE的结果，如胶块的制备，细胞的裂解，胶 块的水洗时间，限制性内切酶和电泳参数等，但其中最重要的因素是酶和参数的选择。菌株 之间的亲缘关系的判断是根据比较酶切片段带型的能力。一种合适的酶应当有最合适的片段 数目和足够的流行病学相关区分能力。电泳参数(包括脉冲时间和总电泳时间)直接影响酶 切片段在电泳胶中的分布。当一株甲型副伤寒沙门菌染色体DNA用同一种酶酶切后，其所 得的限制性片段是固定的，不同菌株之间限制性片段的差异就是固定的，但不同的电泳参数 对他们这种固有差异的表现能力不同。因此当电泳参数发生改变时，原位置相似的条带在新 的胶中的相对位置差别可能会加大，从而显示出差异，因而不同的电泳参数会显示出不同的 菌株区分能力。

目前，国际上的甲型副伤寒沙门菌的PFGE实验方案是根据PulseNet的标准化方案，但 它是针对沙门菌属的非伤寒沙门菌血清型，而不是针对甲型副伤寒沙门菌的。该非伤寒沙门 菌PFGE标准化方案中将Xba I作为了首选酶，Bln I次选酶，Spe I第三种酶；用Xba I和Spe I酶切的电泳参数都是：脉冲时间为2.2-63.8s，18-19h。以往有研究者应用这种标准化方案分 析甲型副伤寒沙门菌时面临严峻挑战，只能将甲型副伤寒分离株分出有限的型别：S.Paratyphi  A isolates had limited genetic diversity(Goh，Puthucheary et al.2002；Li，Cui et al.2006)。因此提 示有可能是这种标准化方案不适合甲型副伤寒沙门菌。这种标准化方案在分析甲型副伤寒沙 门菌时分型能力不够强，不能有效将流行株和非流行株区分开，当甲型副伤寒暴发时很难开 展病原的分子溯源工作。因此这种标准化方案不适合甲型副伤寒沙门菌。

本发明在上述背景下，提出一种适合于甲型副伤寒沙门菌的PFGE方案，使其对甲型副 伤寒沙门菌具有更强的分型区分能力。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，对于甲型副伤寒 沙门菌具有更强的分型区分能力。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

提供一种甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，以经分离并培养得到的甲型副伤寒沙 门菌为分析样品，依次进行以下各步骤：胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶 切、加样和电泳；所述的胶块制备、细胞裂解、洗胶块和加样步骤都按照常规脉冲场凝胶电 泳方法进行；其特征在于：所述的胶块内DNA的酶切是以Spe I作为首选酶，Xba I作为次选 酶，XhoI作为第三种酶；所述的电泳参数中，Spe I酶对应的脉冲时间为1-20s，总电泳时间 为19-20h；Xba I酶对应的脉冲时间为1.5-29s，总电泳时间为19-20h；Xho I酶对应的脉冲时 间为2.2-29s，总电泳时间为19-20h。

所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法可以按照以下几种方式进行：

方法一：包括1-3次单独的脉冲场凝胶电泳过程，即将分离并培养得到的甲型副伤寒沙 门菌样品依次采用所述的首选酶及其相应的电泳参数、所述的次选酶及其相应电泳参数和/或 第三种酶及其相应电泳参数，按照所述各步骤(胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA 的酶切、加样和电泳)分别处理1-3遍。

即，以分离和培养得到的相同批次的菌株为分析样品，先用所述首选酶及其相应的电泳 参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理；如果得到的带型数目足够多， 能将流行株和非流行株很好的区分开，分辨率较高，能获得理想的分子分型，即结束电泳； 如果得到的带型数目较少，同一带型包含的菌株数目较多，分辨率较低，不能很好的区分流 行株和非流行株时，则启用所述的次选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样 品再做脉冲场凝胶电泳处理一遍；如果次选酶及其相应的电泳参数得到的分子型别分辨率较 高时，即结束电泳；如果依然不能满足分子溯源的需要，就再启用所述的第三种酶及其相应 电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理。通常情况下，启用次选酶 及其相应电泳参数处理后，得到的带型数目就足够多了。

方法二：由2-3个连续的脉冲场凝胶电泳过程组成，即以分离并培养得到的甲型副伤寒 沙门菌为样品，依次采用所述的首选酶及其相应的电泳参数、所述的次选酶及其相应电泳参 数和/或所述的第三种酶及其相应电泳参数中的两种或三种，按照上述各步骤(胶块制备、细 胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳)进行连续处理。具体包括以下步骤：

1)用所述的首选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电 泳处理；

2)用所述的次选酶及其相应的电泳参数，将经过步骤1)处理后得到的胶块进行所述的 洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳处理；

和/或

3)采用所述的第三种酶及其相应电泳参数将经过步骤2)处理后得到的胶块进行所述的 洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳处理。

本发明还提供所述甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法在甲型副伤寒沙门菌分型或基 因组变异检测中的应用。

将上述首选酶、次选酶和/或第三种酶及其相应的参数电泳后的结果组合应用，用 BioNumerics软件分析，以UPGMA方法聚类，按100％相似性系数可以分成的亚带型明显增 多，分辨率比单一酶的要高，这将有助于为流行病学调查提供更可靠的实验室证据。

本发明中，作为分析样品的甲型副伤寒沙门菌可以按照常规方法从疑似病例的血、骨髓、 粪便样本或污染的水、食品中分离得到。所述的分离方法在诸多公开出版物上都有记载，例 如人民卫生出版社2006年出版的《伤寒、副伤寒防治手册》(第二版)45-55页。将分离得到 的甲型副伤寒沙门菌按照常规的细菌培养方法培养后，即可作为本发明脉冲场凝胶电泳方法 的分析样品。

本发明从酶的选择和电泳参数两方面优化了现有技术中的标准化的非伤寒沙门菌PFGE 标准化方案，使其成为一种适用于甲型副伤寒沙门菌的PFGE的最佳方案。与现有技术中的 非伤寒沙门菌PFGE标准化方案相比，本发明方法对甲型副伤寒沙门菌的区分能力显著提高。 这对于甲型副伤寒疫情暴发时病原的追踪溯源，以及指导后续的防控来说无疑是具有重大意 义的进步。

附图说明

图1是实施例1中，通用分子量标准株H9812与表4中的S.paratyphi AGXS04-1876和 GZ9A06198以本发明的电泳方法的首选酶为内切酶，分别用本发明和PulseNet标准化方案的 电泳参数处理得到的电泳图。

图2是实施例2的第二次PFGE中，通用分子量标准株H9812与表4中的S.paratyphi A  GXS04-1876和GZ9A06198以本发明的电泳方法的次选酶为内切酶，分别用本发明和 PulseNet标准化方案的电泳参数处理得到的电泳图。

图3是实施例3的第三次PFGE中，通用分子量标准株H9812与表4中的S.paratyphi A  GXS04-1876和GZ9A06198以本发明的电泳方法的第三种酶为内切酶，分别用本发明和 PulseNet标准化方案的电泳参数处理得到的电泳图。

图4是实施例5中，表7中的甲型副伤寒沙门菌应用实施例2的方法进行第一次PFGE 得到的聚类图。

图5是实施例5中，表7中的甲型副伤寒沙门菌应用实施例2的方法进行第二次PFGE 得到的聚类图。

图6是实施例5中的表7中的甲型副伤寒沙门菌应用PulseNet标准化方案的首选酶(Xba I) 及其电泳参数(2.2-63.8s，19h)处理得到的聚类图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容进行详细说明。

其中所使用的普通化学试剂和仪器均为现有的市售产品，或按照公知的PFGE标准操作 规程配制；

所用到的通用分子量标准株H9812可购自军事医学科学院微生物流行病研究所或中国疾 病预防控制中心传染病控制所PulseNet网络中心实验室；

所用的限制性内切酶及其配套缓冲液均购自宝生物工程(大连)有限公司；

所用的甲型副伤寒沙门菌样品是按照人民卫生出版社2006年出版的《伤寒、副伤寒防治 手册》(第二版)45-55页记载的方法分离得到并经血清型确认的，基本信息如下表4：

表4实施例所用样品菌株的相关信息

实施例1.

对表4中的甲型副伤寒沙门菌进行PFGE，包括以下步骤：

[1].胶块的制备

[11]在Falcon 2054管内加入2ml细胞悬浮液(CSB)，用CSB湿润接种环，将事先分 离和培养好的甲型副伤寒沙门菌样品均匀悬浊于CSB中，测其OD值，并调整至3.6～4.5；

[1.2]取400μl步骤[11]得到的细菌悬浊液于相应的1.5ml试管中，置于37℃水浴中孵育 5分钟；将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中；

[1.3]从水浴箱中取出步骤[1.2]得到的试管，每管加入20μl储存液浓度为20mg/ml的蛋白 酶K混匀，使其终浓度为0.5mg/ml；

[1.4]在由90ml TE和10ml的10％十二烷基硫酸钠(SDS)配制成的溶液中加入1g市售 的SeaKem Gold Agarose琼脂糖(SKG)，配制成1％的凝胶溶液，放于56℃水浴箱中备用；

[1.5]在步骤[1.3]得到的试管中加入400μl步骤[1.4]制备的1％的凝胶溶液，混匀；

[1.6]将步骤[1.5]得到的混合物加入成胶模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟， 得到胶块；

[2].细胞的裂解

[2.1]配制细胞裂解液(CLB)：每5ml细胞裂解液加入25μl的20mg/ml的蛋白酶K，使 其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀；蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于 冰上备用；

[2.2]将5ml步骤[2.1]配制的蛋白酶K/CLB混合液加入50ml的螺旋盖试管中；

[2.3]将步骤[1.6]得到的胶块放入步骤[2.2]得到的试管中，用刀片削去模具表面多余的胶， 保证胶块在液面下而不在管壁上，做好标记；

[2.4]将步骤[2.3]得到的试管放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速170转/分钟；

[2.5]将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热；

[3].洗胶块

[3.1]从步骤[2.4]的水浴摇床中拿出螺旋盖试管，盖上绿色的滤筛盖，倒掉CLB；每管中 加入15ml预热的纯水，确保胶块在液面下，放回54℃水浴摇床中，摇10分钟；水浴结束后 将试管中的水倒掉，用纯水将胶再洗一次；

[3.2]将步骤[3.1]得到的试管中的水倒掉，加入15ml步骤[2.5]预热到50℃的TE，在54℃ 的水浴摇床中摇15分钟；倒掉TE，再用TE重复洗三次，每次10～15分钟；倒掉TE，加入 10ml TE，放在4℃冰箱保存备用；

[4].胶块内DNA的酶切

[4.1]按照表5中的比例配制与Spe I酶配套的缓冲液的稀释液，混匀置于冰上：

表5.缓冲液的稀释液的配制比例

 试剂   μl/胶块   μl/10胶块  纯水   180μl   1800μl  Spe I酶配套缓冲液   20μl   200μl  总体积   200μl   2000μl

[4.2]在1.5ml试管中加入200μl步骤[4.1]配制的缓冲液的稀释液；

[4.3]将步骤[3.2]得到的样品胶块放在干净的培养皿上，分别用刀片切成2mm宽的胶块， 放入步骤[4.2]中加入了稀释液的相应试管中，确保胶块在液面下面，将试管放在37℃水浴中 孵育10-15分钟，得到待酶切胶块；

[4.4]将所述的首选酶Spe I按照表6的比例配制酶切缓冲液，混匀置于冰上备用：

表6.酶切缓冲液的配置比例

 试剂   μl/胶块   μl/10胶块  纯水   175μl   1750μl  Spe I酶配套缓冲液   20μl   200μl  Spe I酶(10U/μl)   5μl   50μl  总体积   200μl   2000μl

[4.5]在步骤[4.3]孵育后的每个试管加入200μl步骤[4.4]配制的酶混合液，确保胶块在 液面的下面；在37℃水浴中孵育2～4小时；

[5].加样

[5.1]使电泳梳子齿与胶槽的底面相接触，用水平仪调整胶槽使其水平；

[5.2]从步骤[4.5]中的37℃水浴中取出胶块，平衡到室温，去除试管中的酶混合液，每 个试管加入200μl的0.5×TBE缓冲液；

[5.3]把电泳梳子平放在胶槽上，把步骤[5.2]取出的胶块加在电泳梳子齿上，除去胶块 附近多余的液体，在室温下风干3分钟；

[5.4]把步骤[5.3]加过样的电泳梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块 与胶槽的底面相接触，从胶槽的下部中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃～60℃平衡的1％的 Seakem Gold琼脂糖(1g的Seakem Gold琼脂糖溶于100ml的0.5％TBE)，避免气泡的生成， 在室温下凝固25～35分钟；

[6].电泳

[6.1]在电泳槽中加入2.2L 0.5×TBE，关上盖子，打开主机和泵的开关；

[6.2]打开冷凝机，确保预设温度在14℃；

[6.3]取步骤[5.4]凝固好的胶，放入经步骤[6.1]处理的电泳槽，关上盖子；设置电泳参数 为：脉冲时间1-20s，总电泳时间20h；

[6.4]开启电泳开关，按照步骤[6.3]设置的参数进行电泳，直至电泳结束，得到电泳后胶 块。

结束电泳后，取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内(EB储存液浓度为10mg/ml， 1∶10,000稀释，即在400ml水中加入40μl储存液)。将托盘放在摇床上摇25-30分钟。放掉电 泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。戴上手套将用后的EB溶液小心倒入 做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可 能每20-30分钟换一次纯水。用Gel Doc 2000拍摄图像，图像见图1，其中，S-a组是用Spe I 在现有技术中的Pulsenet标准化方案中的电泳参数下做的PFGE结果，S-c组是本实施例的 PFGE结果；1、2组分别代表表4中的两个菌株，M组是对照组，是通用分子量标准株H9812 在相同条件下的电泳结果。

实施例2.

先按照实施例1的方法进行第一次PFGE，然后再以同一批次分离培养得到的菌为样品， 以次选酶Xba I及其相应的电泳参数(脉冲时间为1.5-29s，总电泳时间为20h)按照所述过 程进行第二次PFGE处理，最终得到电泳后的胶块。

第二次电泳结束后，取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内(EB储存液浓度为 10mg/ml，1∶10,000稀释，即在400ml水中加入40μl储存液)。将托盘放在摇床上摇25-30分 钟。放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。戴上手套将用后的EB溶 液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分 钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。用Gel Doc 2000拍摄图像，图像见图2，其中，X-a 组是用Xba I在现有技术中的PulseNet标准化方案中的电泳参数下做的PFGE结果，X-c组是 本实施例的PFGE结果；1、2组分别代表表4中的两个菌株，M组是对照组，是通用分子量 标准株H9812在相同条件下的电泳结果。

实施例3.

先按照实施例2的方法进行2次PFGE，然后再以同一批次分离培养得到的菌为样品， 以第三种酶Xho I及其相应的电泳参数(脉冲时间为2.2-29s，总电泳时间为20h)按照所述 过程进行第三次PFGE处理，最终得到电泳后的胶块。

第三次电泳结束后，取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内(EB储存液浓度为 10mg/ml，1∶10,000稀释，即在400ml水中加入40μl储存液)。将托盘放在摇床上摇25-30分 钟。放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。戴上手套将用后的EB溶 液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分 钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。用Gel Doc 2000拍摄图像，图像见图3，其中，Xh-a 组是用Xho I在现有技术中的PulseNet标准化方案中的电泳参数下做的PFGE结果，Xh-c组 是本实施例的PFGE结果；1、2组分别代表表4中的两个菌株，M组是对照组，是通用分子 量标准株H9812在相同条件下的电泳结果。

实施例4.

先按照实施例1的方法进行PFGE，然后将得到的电泳后胶块取出，用TE缓冲液冲洗至 不含有首选酶混合液，再按照实施例1的步骤以次选酶Xba I及其相应的电泳参数(脉冲时 间为1.5-29s，总电泳时间为20h)进行的，最终得到电泳后的胶块。

实施例5.应用实施例

采用实施例2的方法于对我国分离自不同年代和区域的33株甲型副伤寒沙门菌进行流行 病学分析。

一、样品信息

表7

*这些菌株的带型是最优势带型

二、分析方法和评价标准

我们应用实施例2的电泳方法对上表7中记载的中国分离自不同年代和不同区域的甲型副 伤寒沙门菌进行PFGE处理，然后对电泳后得到的图谱进行分析，并计算其相似性系数和D值， 再通过相似性系数对其聚类图进行分类和评价，分成的型别越多，即证明本发明这种酶和电 泳参数的区分能力更强，再用D值评价电泳参数的分辨能力，D值越大，说明本发明这种电泳 参数的分辨率越高。在选择测试株时，我们在菌株分离时间和地点上尽可能分散开，以体现 一般的甲型副伤寒沙门菌PFGE图谱的特征。由此证明本发明方法中的酶和电泳参数对目前流 行多年的甲型副伤寒沙门菌的区分更有代表性。

电泳图像和聚类分析：

用BioNumerics(Version5.1)软件对实施例2得到的图像进行处理和聚类分析。聚类采用 UPGMA方法，分析结果参见图4-5。

分辨力评价：

脉冲场凝胶电泳的方法的分辨力用Simpson差异指数量化表示。Simpson差异指数的计算 公式为：D＝1-∑[n_j(n_j-1)]/[N(N-1)]，其中n_j表示属于jth带型的菌株数量，N表示实验菌株 总数。用Simpson差异指数可以比较不同分型方法的分辨力，D值为1表示能将所有菌株分为 不同的型别，D值为0表示将所有菌株分为相同的型别。对于同一批菌株，分型方法的D值越 大，表明其分辨力越强。

三、分析结果

对于本发明的首选酶Spe I及其相应的电泳参数，表7中的33株甲型副伤寒沙门菌以 BioNumerics软件分析，以UPGMA方法聚类，按100％相似度，分辨率为0.964，分成型别最多， 分辨率最高；对于本发明的次选酶Xba I及其相应的电泳参数，33株甲型副伤寒沙门菌以 BioNumerics软件分析，以UPGMA方法聚类，按100％相似度，分辨率为0.877。

而使用现有技术中PulseNet的标准化方案时，同样是使用其首选酶(Xba I)及其相应的 电泳参数(脉冲时间为2.2-63.8s，19h)情况下，分辨率仅为0.764，相应聚类图见图6。

小结：由上述应用可见，与现有技术中的PulseNet的标准化方案相比，本发明的方法对甲 型副伤寒沙门菌的区分能力显著增强。

实施例6.应用实施例

我们利用本发明的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法对中国甲型副伤寒流行期间 (1998-2010)在不同省份分离到的106株甲型副伤寒沙门菌进一步评价，进行了回顾性的分析。 发现一些持续存在的优势流行菌株分子型别，在不同年份和地区也有散在分布的带型，提示 能够进行克隆分析，以及流行病学调查。其中应用首选酶SpeI及其相应参数对106株菌开展脉 冲场凝胶电泳，结果以BioNumerics软件分析，以UPGMA方法聚类，按100％相似性系数分为 31种型别，按95％的相似性系数，分辨率为0.852。而应用次选酶XbaI及其相应参数对106株菌 开展脉冲场凝胶电泳，结果分为20种型别，分辨率为0.750。

当首选酶SpeI和次选酶XbaI联合应用回顾性分析106株甲型副伤寒沙门菌时，结果以 BioNumerics软件分析，以UPGMA方法聚类，按100％相似性系数分为42种亚型，按95％的相 似性系数，分辨率为0.920。