基于探针DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器

摘要

本发明公开了一种基于探针DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器，包括电极和捕获探针DNA，电极采用金电极，捕获探针DNA采用巯基修饰的DNA，其特征是巯基修饰的DNA在室温下与金电极通过Au-S键的化学键合作用以及探针碱基部分与金的吸附作用而修饰到金电极表面使捕获探针DNA平躺于金电极表面形成捕获探针DNA组装层；在捕获探针DNA组装层的表面有牛血清白蛋白作为封闭剂和保护剂。通过杂交前后阻抗值的变化作为指示信号，该方法利用表面组装化学技术构建“平躺”型DNA探针识别界面，同时使探针的形态不受空白杂交条件的影响而保持平躺于电极表面；该方法不仅具有灵敏度高、特异性好等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及基于DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器的制备方法，属于生物传感技术领域。

背景技术

交流阻抗法是利用电极表面电阻的变化反应电极表面形态变化的过程，用电化学阻抗谱研究被修饰电极，用Randle电路进行模拟，所得到的Nyquist图包括半圆和斜线两个部分，其中半圆部分为高频区，由电子传递过程控制；线性部分为低频区，代表扩散控制步骤。通过Nyquist图的变化可以反映出电极表面电子传递速率的大小，从而了解有关DNA杂交动力学与电极界面结构性质的信息。该方法减小了酶法中由于加入信标物质而引起的非特异性吸附，且无需使用杂交指示剂，因此在传感器的研究中受到越来越多的关注。

影响电极表面电子传递电阻的因素有两种，一种是电荷效应，即电极表面电负性物质增加引起与电解质溶液中负电性的电化学活性物质[Fe(CN)₆]^3-/4-的排斥作用的增加，电极表面Ret值增大；另一种是通道效应，即当电极表面组装层有孔隙时，使电解质溶液中的[Fe(CN)₆]^3-/4-容易通过孔隙通道到达电极表面，加快了电子转移速率，电极表面Ret值减小。

传统的交流阻抗型DNA电化学传感器的原理和检测过程为：（1）将单链DNA探针通过巯基与金的结合以低温自组装的方式固定到金电极表面，此时与金表面结合的除了巯基以外还有少量的DNA碱基；（2）用巯基己醇（MCH）作为封闭剂进行二次组装，MCH在封闭暴露的金位点的同时，其末端巯基争夺DNA碱基所结合的金位点，使DNA链脱离电极表面而处于相对直立的状态；（3）当电极表面的探针DNA组装层与目标DNA溶液在杂交条件下发生杂交反应后，电极表面的DNA链增加，磷酸骨架产生的负电荷数量增加，同时空间位阻也增加，对[Fe(CN)₆] ^3-/4-等负电荷电化学探针在电极表面的电子交换产生更大的阻碍作用，电阻Ret增大。

然而由于电极表面的DNA探针密度较高，传统的交流阻抗型DNA电化学传感器在DNA杂交前就存在着明显的空间位阻效应与电荷效应，当所检测目标DNA浓度较低时，所增加的空间位阻和电荷非常有限，杂交反应的交流阻抗值虽然有所增加但变化不明显，使得方法灵敏度不高。

本发明设计了一种新的方法，利用表面组装化学技术构建“平躺”型DNA探针识别界面，通过控制电极表面DNA杂交前后的形态变化对目标DNA进行检测，大大提高了方法的灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于表面组装化学技术构建“平躺”型DNA探针识别界面及相应的高灵敏度交流阻抗型DNA电化学传感器及其制备方法，其原理与检测过程如图1所示。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案，本发明所述的一种基于DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器，包括电极和捕获探针DNA，电极采用金电极，捕获探针DNA采用巯基修饰的DNA，其特征是巯基修饰的DNA在室温下与金电极通过Au-S 键的化学键合作用以及探针碱基部分与金的吸附作用而修饰到金电极表面使捕获探针DNA平躺于金电极表面形成捕获探针DNA组装层；在捕获探针DNA组装层的表面有牛血清白蛋白作为封闭剂和保护剂。

本发明所述的基于DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：

（一）“平躺”型探针DNA识别界面的构建

根据文献[1]报道，巯基修饰的DNA除了巯基之外碱基部分也会与金发生相互作用，其中碱基与金的作用相对较弱，但速度较快。根据这一原理，将巯基修饰的单链捕获探针DNA，在室温下进行快速组装，通过Au-S 键的化学键合作用以及探针碱基部分与金的吸附作用将其修饰到金电极表面，此时捕获探针DNA平躺于电极表面形成捕获探针DNA组装层，大量的金位点被占据，将该带有捕获探针DNA组装层的组装电极置于铁氰电对溶液中，[Fe(CN)₆]^3-/4-难以通过捕获探针DNA组装层到达组装电极的金表面，电子转移速率较慢，交流阻抗值Ret很大（图2）。

文献[1]：Tonya M. Herne, and Michael J. Tarlov, Characterization of DNA Probes Immobilized on Gold Surfaces, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119 (38), 8916-8920.

（二）探针DNA识别界面的封闭与保护

用牛血清白蛋白（BSA）作为封闭剂和保护剂，一方面封闭暴露的金位点以减小非特异吸附，另一方面保护探针DNA组装层不受其他因素（如加热，pH等）的影响而保持平躺于电极表面的状态。

（三）杂交与检测

由于探针DNA与其互补序列发生杂交反应后，形成刚性的DNA双螺旋结构，此时DNA碱基脱离电极表面，双螺旋结构直立于电极表面，暴露出原来被DNA链所占据的空间，形成离子可自由进出的通道，电子传递速率显著增加，电极Ret值显著减小。由于DNA链的宽度相对于其长度要小得多，因此即使是极少量的探针DNA由于杂交而发生构型的变化，也可暴露出较多的金表面位点并产生可供电化学探针离子自由进出的通道，检测灵敏度提高。如果所测序列与探针DNA不能发生杂交，则电极表面的组装层没有形态变化，此时阻抗值变化不明显。因此通过阻抗值变化的大小便能实现对互补与非互补DNA链的识别和检测。利用本发明对DNA的检测结果如图3，图4所示。

从图3A结果可以看出当捕获探针与完全互补的碱基序列杂交后（曲线a），阻抗值显著降低，说明探针能够很好的与其完全互补序列进行杂交形成双螺旋DNA，此时双链DNA直立于电极表面，在测定阻抗液中，[Fe(CN)₆] ^3-/4-快速通过DNA层之间的孔隙到达电极表面进行氧化还原反应，发生电子传递，电极表面阻抗值减小。当捕获探针与单碱基错配序列相互作用时（曲线b），电极表面阻抗虽然较空白信号显著减小，但与完全互补序列产生的信号有明显的增加，充分反映出单碱基错配序列与完全互补序列在杂交效率上的差异。而完全错配的人工合成序列产生的信号（曲线d）则与空白信号（曲线e）非常接近，说明所构建的DNA电化学传感器具有很好的序列特异性。此外，以鲑鱼精DNA考察了长链序列对测定结果的影响，实验结果表明只要不存在序列相关性，长链DNA所产生的信号（曲线c）即与空白值（曲线e）无明显差异，进一步证明了该方法良好的选择性。

从图4结果可以看出利用所构建的交流阻抗型DNA电化学传感器对特定基因序列进行定量检测，在一定范围内，随着目标DNA浓度的增加，阻抗值逐渐减小。互补链浓度在1.0×10^-13～1.0×10^–8 M范围内，阻抗值与DNA的浓度对数成线性关系，检测限为3.0×10^-14 M。

本发明提供了基于DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器的特异性检测方法，其特征是目标DNA的浓度在1.0×10^-13 ～1.0×10^–8 M范围内，阻抗值与DNA的浓度成线性对数函数关系，检测限为3.0×10^-14 M。

本发明所述的基于DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器用于识别单碱基错配序列与完全互补序列。

本发明的优点为：将巯基修饰的单链探针DNA在室温下与金电极进行快速组装，通过Au-S 键的化学键合作用以及探针碱基部分与金的吸附作用将其修饰到金电极表面，此时捕获探针DNA 平躺于金电极表面形成捕获探针DNA组装层，大量的金位点被占据，将该带有捕获探针DNA组装层的组装电极置于铁氰电对溶液中，[Fe(CN)₆]^3-/4-难以通过捕获探针DNA组装层到达组装电极的金表面，电子转移速率较慢，交流阻抗值Ret很大，见图2的探针DNA识别界面的交流阻抗图。在捕获探针DNA组装层的表面有牛血清白蛋白（BSA）封闭剂和保护剂；捕获探针DNA与其互补序列的目标DNA发生杂交反应后，形成刚性的直立于金电极表面的DNA双螺旋结构，在铁氰电对溶液中的阻抗减小。上述的基于表面组装化学所构建的阻抗型电化学DNA传感器对于识别互补序列具有高度的灵敏性，检测限达到3.0×10^-14 M，可对特定基因序列进行定量检测，用于识别单碱基错配序列与完全互补序列。

附图说明

图1为基于探针DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器的原理图。

其中：图中的捕获探针DNA标记为1，目标DNA标记为2，牛血清白蛋白（BSA）封闭剂和保护剂标记为3，电极标记为4。

图2为探针DNA识别界面的交流阻抗图：（a）裸金电极（b）25 ℃组装2 h。

图3A为探针DNA分别与10 nM不同序列DNA杂交后的交流阻抗图：完全互补DNA（a），单碱基错配DNA（b），完全错配DNA（c），鲑鱼精DNA（d），空白信号（e）。

图3B为探针DNA分别与不同序列DNA杂交后的交流阻抗值柱状图。

图4 A为探针DNA与不同浓度目标DNA杂交后的交流阻抗图；从a到f的浓度分别为10 nM，1 nM，100pM，10 pM，1 pM，100 fM。

图4B为阻抗值与目标DNA浓度的对数线性关系图（浓度范围10 nM~100 fM）。

具体实施方式

如图1所示，本发明所述的基于探针DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器，包括电极、捕获探针DNA和牛血清白蛋白，电极优选金电极4，捕获探针DNA 1优选巯基修饰的单链DNA，巯基修饰的DNA除了巯基之外碱基部分也会与金发生相互作用，其中碱基与金的作用相对较弱，但速度较快。将巯基修饰的单链探针DNA在室温下与金电极进行快速组装，通过Au-S 键的化学键合作用以及探针碱基部分与金的吸附作用将其修饰到金电极表面，此时捕获探针DNA 1平躺于金电极4表面形成捕获探针DNA组装层，大量的金位点被占据，将该带有捕获探针DNA组装层的组装电极置于铁氰电对溶液中，[Fe(CN)₆]^3-/4-难以通过捕获探针DNA组装层到达组装电极的金表面，电子转移速率较慢，交流阻抗值Ret很大，见图2的探针DNA识别界面的交流阻抗图。在捕获探针DNA组装层的表面有牛血清白蛋白（BSA）封闭剂和保护剂3；捕获探针DNA  1与其互补序列的目标DNA 2发生杂交反应后，形成刚性的直立于金电极表面的DNA双螺旋结构，在铁氰电对溶液中的阻抗减小。

实施例1：

基于探针DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器的制备步骤如下：

（1）金电极用Piranha溶液（30%的H₂O₂与浓度98%的浓H₂SO₄，以1:3的体积比混合）超声5 min，用去离子水超声清洗2次，每次5 min，然后分别用0.3 μm、0.05 μm Al₂O₃和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗。将超声好的电极置于0.5 M H₂SO₄中循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，N₂吹干后待用；

（2）取4 μl 探针DNA（寡核苷酸由宝生生物工程有限公司合成）溶液，滴涂到经预处理的裸金电极表面，室温放置2 h后，以PBS洗液、双蒸水分别冲洗电极表面，氮气吹干后将电极置于300 μl的0.5% BSA溶液中浸泡15 min，用双蒸水清洗，氮气吹干备用。

实施例2：

基于探针DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器对目标DNA的检测步骤如下：

（1）实施例1获得的固定在电极表面的捕获探针与目标DNA（寡核苷酸由宝生生物工程有限公司合成）在杂交缓冲溶液中37 ℃水浴杂交40 min，形成双链DNA，用10 mM 的PBS洗液（pH 7.4）冲洗电极表面，除去未杂交的DNA链，再用双蒸水冲洗后待测；

（2）将步骤（1）制得的电极浸入含有0.1 M KCl 的4 mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆] （1:1）的溶液中，开路电位为初始电位，频率范围10⁵Hz～1.0Hz，记录交流阻抗曲线。交流阻抗图见图3A的曲线a。

实施例3：

交流阻抗型DNA电化学传感器的制备以及对PML/RARα融合基因的检测步骤如下：

（1）金电极用Piranha溶液（30%的H₂O₂与浓度98%的浓H₂SO₄，以1:3的体积比混合）超声5 min，用去离子水超声清洗2次，每次5 min，然后分别用0.3 μm、0.05 μm Al₂O₃和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗。将超声好的电极置于0.5 M H₂SO₄中循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，N₂吹干后待用；

（2）5’端巯基标记的DNA捕获探针序列为：5’-SH-(CH₂)₆-T₁₀ CTTCA GAACT GCTGC TCTGG GTCTC AATGG-3’，配制成1 μM的溶液；

（3）取4 μl 步骤（2）的捕获探针DNA溶液，滴涂到经预处理的步骤（1）的裸金电极表面，室温放置2 h后，以PBS洗液、双蒸水分别冲洗电极表面，氮气吹干后将电极置于300 μl的0.5% BSA溶液中浸泡15 min，用双蒸水清洗，氮气吹干备用； 

（4）固定在电极表面的捕获探针与目标DNA在杂交缓冲溶液中37 ℃水浴杂交40 min，形成双链DNA，用10 mM 的PBS洗液（pH 7.4）冲洗电极表面，除去未杂交的DNA链，再用双蒸水冲洗后待测；

（5）将电极浸入含有0.1 M KCl 的4mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆] （1:1）的溶液中，开路电位为初始电位，频率范围10⁵Hz～1.0Hz，记录交流阻抗曲线。交流阻抗图见图4A，阻抗与浓度的关系见图4B。

由以上的实施例和附图的实验数据，可以证明本发明的巯基修饰的探针DNA在室温下能与金电极进行快速组装，通过Au-S 键的化学键合作用以及探针碱基部分与金的吸附作用将其修饰到金电极表面，此时捕获探针DNA  1平躺于金电极4表面形成捕获探针DNA组装层，即本发明所述的“平躺”型探针DNA识别界面，并依此构建DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器。