一种用于药物载体的多孔微球、制备方法及药物负载方法

摘要

本发明涉及多孔微球的制备领域，具体地，本发明涉及一种用于药物载体的多孔微球、制备方法及药物负载方法。所述方法包括以下步骤：1)将可降解两嵌段两亲性聚合物材料溶于有机溶剂中，形成油相O；2)将油相O加入到含有稳定剂的水相中W，形成O/W的预乳；3)将步骤2)所得的O/W预乳通过微孔膜，得到O/W乳液；4)将步骤3)所得到的乳液中的有机溶剂去除、固化，再经离心洗涤和冷冻干燥，得到多孔载药微球；所述步骤1)中有机溶剂至少含有一种在水中溶解度低于2％的溶剂；所述油相O和水相W的体积比1∶5～20。本发明克服了传统缓释多孔微球在后期不能完全释放的问题，并且在装载药物，释放和储存过程中都能有效保持药物活性。

说明书

技术领域

本发明涉及多孔微球的制备领域，具体地，本发明涉及一种用于药物载体的多 孔微球、制备方法及药物负载方法。

背景技术

随着新兴生物技术和基因工程发展，蛋白质和多肽类大分子生化医药(如生长 激素、胰岛素、肝素、干扰素、白细胞介素等)由于在侏儒症、糖尿病、肝硬化以 及癌症等难以治愈疾病的治疗过程中表现出药理作用强、副作用少且很少引起过敏 反应的特点而倍受重视。由于多肽和蛋白质类药物稳定性差，在肠胃中易被降解， 且存在生物利用度低的问题，故多采用注射剂。但是由于此类药物的体内半衰期短， 临床应用时常常需要多次注射给药。针对这些问题，研究者们基本遵循两种解决途 径，第一是寻找一条蛋白质药物高生物利用率的给药途径；第二是通过化学修饰来 优化蛋白质的代谢动力学特性，以延长其半衰期，达到长效稳定的目的。其中，利 用生物可降型聚合物为骨架材料制备微球给药系统，可以达到长效缓释，减少给药 次数和药物刺激，降低毒副作用，提高疗效的目的。通常包埋药物采用复乳法，在 制备过程中蛋白与有机溶剂和油水界面的接触，都可能影响蛋白质的结构；且搅拌， 超声处理这些外界因素的干扰，易使其发生聚集、吸附、沉淀、氧化、脱酰胺、水 解等一系列物理或化学变化。蛋白质结构一旦遭到破坏，不但药效下降，而且可能 在体内产生免疫原性和其他不良反应。为了增加蛋白药物在微球化过程中的稳定性， 一般需要将其与一些保护剂溶液混合后进行冻干处理，常用的保护剂主要有两类： 聚乙二醇类和糖类，但对残留的测定和去除带来困难，不利于大规模的工业化生产。

为了克服包埋过程中蛋白质及其他药物活性易被破坏的问题，可用有多孔结构 的微球吸附药物来达到载药目的。因为具有多孔结构的微球相比同等粒径大小的常 规微球，能提供更多的比表面积，在以吸附法制备载药微球制剂时，能显著提高药 物的装载量。粒径的均一性是微球应用的关键问题，因为粒径不均一势必造成制备 重复性和治疗重复性差的问题，难以报批临床。中国专利(公开号CN101361716A) 中使用搅拌法制备的聚乳酸多孔微球粒径和孔径分布不均一，难以提高载药率和准 确调控药物释放及实验批次间的重复性。

装载药物的可完全释放也是限制载药聚合物微球进入临床应用的主要问题，疏 水性的聚合物材料与所装载的蛋白药物之间易发生非特异性吸附，导致药物的不完 全释放，造成药物的浪费和生物利用度降低。中国专利(授权公告号CN100388970C) 中使用的吸附药物的微球材料是疏水性的聚乳酸(PLA)共聚物，这种疏水性材料 在蛋白类药物的后期释放中，容易造成药物的不完全释放。而且膜材与蛋白之间的 非特异性吸附作用易使蛋白发生聚集，降低药物的活性。

针对不同的疾病，所需的释药速度不同，例如，用于治疗抗癌的药物需要及时 的大量释放，以达到有效的药物浓度；而用于治疗糖尿病的胰岛素等药物，需要缓 慢释放来保证稳定的药物浓度，减少注射次数减轻病人的痛苦。因此，制备释放速 度可控的载药微球十分必要。中国专利(公开号CN1939281A)中使用乙基纤维素为 膜材制备粒径可控的多孔微球，但没有对微球的降解速度进行调控和研究，不利于 药物使用的普遍性。总的来说，在制备多孔载药微球时，需要添加制孔剂，造成后 期残留测定困难，并且降低生物安全性；且现有的技术制备得到的微球粒径和孔径 不均一，载药率低，重复性差；释放过程中蛋白药物容易与微球骨架发生非特异性 吸附，导致药物不完全释放并产生聚集体，从而产生免疫原性，导致失去活性；微 球降解过程不可控，不利于扩展应用于多种疾病的治疗。

本发明针对多孔微球粒径和孔径分布不均一，载药率低、不能控制释放和药物 活性低等问题，提出采用一种两嵌段的两亲性聚合物为材料，制备多孔微球作为药 物载体解决上述难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于药物载体的多孔微球。

本发明的再一目的在于提供一种用于药物载体的多孔微球的制备方法。

本发明的还一目的在于提供一种用于药物载体的多孔微球的药物负载方法。

根据本发明的用于药物载体的多孔微球，所述微球的制备方法包括以下步骤：

1)将可降解两嵌段两亲性聚合物材料溶于有机溶剂中，形成油相O；

2)将油相O加入到含有稳定剂的水相中W，形成O/W的预乳；

3)将步骤2)所得的O/W预乳通过微孔膜，得到O/W乳液；

4)将步骤3)所得到的乳液中的有机溶剂去除、固化，再经离心洗涤和冷冻干 燥，得到多孔载药微球；

所述步骤1)中有机溶剂至少含有一种在水中溶解度低于2％的溶剂，所述有机 溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、二硫化碳和二甲苯中的一种或多种；

所述步骤2)中油相O和水相W的体积比1∶5～20。

根据本发明的用于药物载体的多孔微球，所述的预乳液的粒径大小最好大于膜 孔径，预乳液的制备方法，可通过普通的乳化方式如均质、超声、机械搅拌等方法 制备，所述的乳液中的有机溶剂的去除可采用减压蒸发、常温常压搅拌挥发或溶剂 萃取等方法中的一种或者几种。

根据本发明的用于药物载体的多孔微球，所述的压力可在1-2000kPa之间调节， 这主要由制备过程中使用的微孔膜孔径的大小及目标微球大小的制备要求所决定。

根据本发明的用于药物载体的多孔微球，所述的微孔膜包括疏水和亲水的膜， 优选亲水的膜，如采用亲水性的SPG膜，该SPG膜为商品化产品，在制备过程中， 可通过选择不同膜孔径的SPG膜来控制产品的粒径大小，常用的微孔膜孔径为 0.5-200μm，优选的为1.4-50μm，更优选的为2.8-18μm。

根据本发明的用于药物载体的多孔微球，所述的聚合物材料的选择面很广，不 仅可以选择两亲性材料，如聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚原酸 酯、聚酸酐、聚磷腈分别与聚乙二醇共聚所得的聚合物材料中的任意一种，也可以 将其不同种类不同分子量的聚合物复配混合使用。

根据本发明的用于药物载体的多孔微球，所述的有机溶剂可选自水中的溶解度 低于2％(不包括2％)的有机溶剂，如二氯甲烷、三氯甲烷、二硫化碳和二甲苯等 有机溶剂中的任意一种或多种，具体种类或体积需视所用膜材等制备参数而定。

根据本发明的用于药物载体的多孔微球，所述的步骤3)可重复多次，即将步骤 3)所得的乳液作为预乳用压力再次通过微孔膜，直至得到的乳液的粒径大小与均一 性满足要求。

根据本发明的用于药物载体的多孔微球，所述的外水相稳定剂可选自聚乙烯醇、 聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween80)、聚氧乙烯山梨糖醇酐 月桂酸酯(Tween20)、十二烷基磺酸钠(SDS)等一种或几种，稳定剂使用浓度优 选为0.1％～10wt％。

本发明还提供了采用所述多孔微球进行药物负载的方法，该方法包括以下步骤：

按1∶2～100的质量比将药物与多孔微球混合，振荡使多孔微球对药物吸附， 离心收集微球，洗去未吸附的药物，冷冻干燥，得到吸附有药物的多孔载药微球；

所述药物为选自多肽、蛋白类、多糖、核酸、疫苗中的一种，本发明制备得到 的载药微球对于药物具有很高的释放率以及保持良好的生物活性，尤其对于多肽、 蛋白类物质效果更加明显，很好的解决了上述难题。由于多糖、核酸和疫苗类药物 在超声、搅拌等强烈的制备条件下及与有机溶剂接触时结构和多肽、蛋白类物质一 样，极易破坏而导致失活，因此，在本发明中通过多孔微球对这类药物进行吸附制 备载药微球，能很好的保持药物活性，同样具有良好的效果。

本发明还提供了一种用于药物载体的多孔微球的制备方法，所述方法包括以下 步骤：

1)将可降解两嵌段两亲性聚合物材料溶于溶剂中，形成油相O；

2)将油相O加入到含有稳定剂的水相中W，形成O/W的预乳；

3)将步骤2)所得的O/W预乳通过微孔膜，得到O/W乳液；

4)将步骤3)所得到的乳液中的有机溶剂去除、固化，再经离心洗涤和冷冻干 燥，得到多孔载药微球；

所述步骤1)中溶剂至少含有一种在水中溶解度低于2％的有机溶剂，所述有机 溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、二硫化碳和二甲苯中的一种或多种；

所述步骤2)中油相O和水相W的体积比1∶5～20。

本发明提供的尺寸均一的多孔微球，该微球尺寸均一、可控、直径分布系数(CV) 值在20％以内，更优选的在15％以内。药物装载率最高可达50％，释放过程中蛋白多 肽类药物活性保持率在90％以上，能瞬间释放或持续释放1周至12周。粒径分布系数 (Coefficient of Variation，CV)采用数球法测定，测定300个粒子的粒径，按下面的公 式计算粒子的粒径分布系数(CV)。

$\mathrm{CV}={\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}\frac{{(d_i-\bar{d})}^2}{N}\right)}^{\frac{1}{2}}/\bar{d}$

其中d_i为单个粒子的粒径，为粒子的数均粒径，N为粒子的总数，N＞300个。

根据本发明的用于药物载体的多孔微球，所述微球的平均粒径范围在500 nm-100μm，所述的聚合物微球在制备过程中至少采用了一种两嵌段的两亲性聚合 物材料并且至少采用了一种在水中的溶解度低于2％(不包括2％)的有机溶剂，更 有利于提高药物的装载率、保持生物活性和可持续释放。

本发明中采用快速膜乳化方法制备出粒径和孔径均一可控，载药率高，能控制 释放，且药物活性高的多孔微球。其中，膜乳化技术保证了载药微球粒径均一可控， 制备乳液时首先选用普通的乳化方式如均质、超声、机械搅拌等方法制备，通过这 些常规的方法制得的乳液粒径大于膜孔径，然后在压力的作用下将这些粒径大于膜 孔径的预复乳通过微孔膜后，便可以得到粒径和微孔膜一致的复乳液，可以多次重 复的操作直至得到的乳液的粒径大小与均一性满足要求。

其次，采用的两嵌段共聚物含有亲水性链段，在固化过程中，由于有机溶剂在 微球表面产生快速爆沸而成孔，因为亲水性链段在微球表面均一分布，因此爆沸速 度相同，产生的孔道孔径均一；同时，通过采用不同亲水性链段所占比例的膜材和 控制油水比例，能控制微球的孔径。

再次，因为多孔微球的比表面积相对于光滑的微球明显提高，因而吸附的位点 增加，能获得较高的载药率。通过控制膜材的分子量和在有机溶剂中的浓度能控制 微球的降解速率，膜材分子量、聚合物中亲水嵌段所占比例、油水比以及聚合物在 有机溶剂中的浓度都会影响微球的降解速率，从而可以通过调节以上参数来控制药 物的释放速率。聚合物分子量越低，聚合物在有机溶剂中的浓度越低，微球骨架越 疏松，利于微球的降解，从而药物释放速率较快；反之，提高聚合物分子量和聚合 物在有机溶剂中的浓度，微球骨架紧实，微球降解慢，释药速率也慢。聚合物中其 中亲水嵌段所占的比例越高，微球与周围水环境接触的机会越多，亲水链降解的速 率越快，而且微球孔径也随着亲水嵌段的比例增加而增加，从而提高释药速度；反 之降低聚合物中其中亲水嵌段所占的比例，释药速率随之降低。外水相体积越大， 微球孔径越大，突释越大；反之，外水相体积减小，孔径越小，突释降低，因此可 以根据病情需要，制备不同的多孔载药微球，从而达到控制药物释放速率的目的； 同时，亲水性链段分布在微球表面，避免了疏水性微球与蛋白的非特异性吸附而导 致的不完全释放。吸附法制备载药微球避免了超声、搅拌等制备条件以及有机溶剂 和油水界面对药物活性的影响，很好的保持药物活性。

本发明中利于制备多孔微球的条件是：使用在水中溶解度低于2％的有机溶剂， 油相与水相比小于1∶5，两亲性聚合材料中亲水嵌段所占比例为4～20％。若使用的 有机溶剂在水中溶解度高于2％，油水比大于1∶5，两亲性聚合材料中亲水嵌段所占 比例低于4％，不利于制备多孔微球。若油水比小于1∶20，两亲性聚合材料中亲水嵌 段所占比例高于20％，不利于制备规则球形的微球。因为两嵌段的两亲性聚合物(由 疏水性的链段和亲水性的链段交替聚合而成的线性共聚物，该聚合物同时具备亲水 性和疏水性)，可以很好的解决蛋白类药物与微球膜材之间的非特异性吸附，保证药 物的完全释放；另外，以两亲型聚合物为微球材料还可以稳定制备孔径均一的微球， 从而可以获得较高的载药率。由于两亲性材料中的亲水性部分本身具有类似于制孔 剂的性质，在制备过程中不需要额外添加制孔剂，降低了生产成本，解决了残留测 定的困难，利于提高生物安全性。采用快速膜乳化法可实现制备出粒径均一，大小 可控的多孔微球，因为粒径大小与药物释放有紧密联系，从而可以通过调节微球粒 径大小达到控制释放周期的目的。

本发明公开的制备方法与现有技术相比，具有以下优点：

本发明方法制备效率很高，乳液过膜时的流速大小高达10mls^-1，因而制备过程 大多瞬间完成。

本发明提供了一种多孔载药微球，其特征在于，所述微球的直径分布系数在20％ 以内，药物载药率最高达50％，释放过程中蛋白多肽类药物活性保持率在90％以上， 能瞬间释放或者持续释放1周至12周。

本发明提供了一种快速制备尺寸均一的多孔载药微球的方法，并可通过控制制 备过程中的微孔膜孔径大小和操作压力来控制产品的粒径大小。

本发明克服了现有技术无法制备粒径均一的多孔载药微球的问题，保证了实验 的可重复性，利于药物疗效的稳定性和工业化放大生产。

本发明不需要在油相额外添加制孔剂，即可达到制备多孔微球的效果，免去了 后期测残留带来的困难，同时利于降低成本。

本发明克服了传统缓释多孔微球在后期不能完全释放的问题，并且在装载药物， 释放和储存过程中都能有效保持药物活性。

本发明方法操作简单、条件温和并且易于工业化放大生产。

附图说明

图1为本发明的载药微球的制备流程示意图；

图2为实施例1制备的微球的电镜图；

图3为实施例1制备的微球的粒径分布图；

图4为实施例2制备的微球的电镜图；

图5为实施例3制备的微球的电镜图；

图6为实施例4制备的微球的电镜图；

图7为实施例5制备的微球的电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明不仅仅限制于该实施例中。

实施例1

将孔径为2.8μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将0.4g的分 子量为1万的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)(亲水嵌段所占的比例为4％)溶于8 ml二氯甲烷中，作为油相，将该油相加入到80ml的1％wt的聚乙二醇(PVA)水溶 液中，油相和水相的比例为1∶10，磁力搅拌300rpm搅拌1min制备预乳，再将该 预乳液在400kPa的操作压力下压过微孔膜装置(如图1)，得到乳液，乳液过膜时间 小于10s，再将乳液在室温下搅拌24h以除去有机溶剂二氯甲烷，再经离心洗涤即 得到载药微球。将所得的微球真空干燥48h得到成品微球。干燥后的微球重新分散 在水中，利用场发射扫描电镜(JEOL SEM Company，Japan)观察微球的表面形貌(如 图2)。微球的体积平均粒径及其分布用激光粒度仪(Malvern Company，USA)测定 (如图3)，经测定微球的平均粒径为627nm，粒度分布系数CV值为12.53％。将0.2 g微球置于小离心管中，加入5mL胰高血糖素样肽-1(GLP-1)溶液，在一定温度下 吸附24h，然后将未吸附的GLP-1溶液在5000rpm下离心分离，测定未吸附的GLP-1 质量，通过计算定量得到微球对于GPL-1的载药率为37.8％。准确称量30mg冻干微 球，加入10ml pH7.4的PBS缓冲液(8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，1.81g Na₂HPO₄·H₂O，0.5g NaN₃，0.1g Tween20和1000ml蒸馏水)。样品管置于37℃水浴恒 温振荡器振摇(120rpm)。定期离心分离，取出1.0ml上清液，同时补入1.0ml新鲜 PBS缓冲液。上清液中蛋白含量以BCA试剂和micro-BCA试剂盒则定。经测定，6周 内微球持续释放GLP-1累积达到97.2％，且释放出的GLP-1活性保持率为96.5％。

实施例2

将孔径为7.2μm的亲水性膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将0.7g的分子量 为5万的聚乳酸-聚羟基乙酸和聚乙二醇共聚物(亲水嵌段所占的比例为10％)溶于 10ml三氯甲烷中，作为油相，将该油相加入到50ml的1.2％wt的PVA水溶液中，油 相和水相的比例为1∶5，磁力搅拌300rpm搅拌1min制备预乳，再将该预乳液在200 kPa的操作压力下压过微孔膜装置，得到乳液，乳液过膜时间小于10s，再将乳液在 室温下搅拌24h以除去有机溶剂三氯甲烷，再经离心洗涤即得到载药微球。将所得 的微球真空干燥48h得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用场发射扫 描电镜(JEOL SEM Company，Japan)观察微球的表面形貌(如图4)。微球的体积平 均粒径及其分布用激光粒度仪(Malvern Company，USA)测定，经测定，微球的平 均粒径为4.12μm，粒度分布系数CV值为12.67％。将0.2g微球置于小离心管中，加 入5mL胰岛素溶液，在一定温度下吸附46h，然后将未吸附的胰岛素溶液在5000rpm 下离心分离，测定未吸附的胰岛素质量，通过计算定量得到微球对于胰岛素的载药 率为36.9％。准确称量30mg冻干微球，加入10ml pH7.4的PBS缓冲液(8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，1.81g Na₂HPO₄·H₂O，0.5g NaN₃，0.1g Tween20和1000ml蒸馏水)。 样品管置于37℃水浴恒温振荡器振摇(120rpm)。定期离心分离，取出1.0ml上清 液，同时补入1.0ml新鲜PBS缓冲液。上清液中蛋白含量以BCA试剂和micro-BCA试 剂盒则定。经测定，5周内微球持续释放胰岛素累积达到95.8％，且释放出的胰岛素 活性保持率为94.7％。

实施例3

将孔径为9μm的亲水性膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将0.8g的分子量为 2万的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(亲水嵌段所占的比例为20％)溶于15ml二硫化碳中， 作为油相，将该油相加入到300ml的1.4％wt的PVA水溶液中，油相和水相的比例为 1∶20，磁力搅拌300rpm搅拌1min制备预乳，再将该预乳液在150kPa的操作压力 下压过微孔膜装置，得到乳液，乳液过膜时间小于10s，再将乳液在室温下搅拌24h 以除去有机溶剂三氯甲烷，再经离心洗涤即得到载药微球。将所得的微球真空干燥 48h得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用场发射扫描电镜(JEOL SEM  Company，Japan)观察微球的表面形貌(如图5)。微球的体积平均粒径及其分布用激 光粒度仪(Malvern Company，USA)测定，经测定，微球的平均粒径为4.17μm，粒 度分布系数CV值为13.74％。将0.2g微球置于小离心管中，加入5mL重组生长激素 溶液，在一定温度下吸附36h，然后将未吸附的重组人生长激素溶液在5000rpm下 离心分离，测定未吸附的重组人生长激素质量，通过计算定量得到微球对于重组人 生长激素的载药率为22.8％。准确称量30mg冻干微球，加入10ml pH7.4的PBS缓 冲液(8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，1.81g Na₂HPO₄·H₂O，0.5g NaN₃，0.1g Tween20 和1000ml蒸馏水)。样品管置于37℃水浴恒温振荡器振摇(120rpm)。定期离心分 离，取出1.0ml上清液，同时补入1.0ml新鲜PBS缓冲液。上清液中蛋白含量以BCA 试剂和micro-BCA试剂盒则定。经测定，7周内微球持续释放生长激素累积达到 94.8％，且释放出的生长激素活性保持率为95.4％。

实施例4

将孔径为18μm的亲水性膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将1g的分子量为 3万的聚己内酯-聚乙二醇共聚物(亲水嵌段所占的比例为15％)溶于20ml二甲苯中， 作为油相，将该油相加入到160ml的1.5％wt的PVA水溶液中，油相和水相的比例为 1∶8，磁力搅拌300rpm搅拌1min制备预乳，再将该预乳液在100kPa的操作压力下 压过微孔膜装置，得到乳液，乳液过膜时间小于10s，再将乳液在室温下搅拌24h 以除去有机溶剂三氯甲烷，再经离心洗涤即得到载药微球。将所得的微球真空干燥 48h得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用场发射扫描电镜(JEOL SEM  Company，Japan)观察微球的表面形貌(如图6)。微球的体积平均粒径及其分布用激 光粒度仪(Malvern Company，USA)测定，经测定，微球的平均粒径为7.62μm，粒 度分布系数CV值为14.65％。将0.2g微球置于小离心管中，加入5mL亮丙瑞林溶液， 在一定温度下吸附24h，然后将未吸附的亮丙瑞林溶液在5000rpm下离心分离，测 定未吸附的亮丙瑞林质量，通过计算定量得到微球对于亮丙瑞林的载药率为47.8％。 准确称量30mg冻干微球，加入10ml pH7.4的PBS缓冲液(8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，1.81g Na₂HPO₄·H₂O，0.5g NaN₃，0.1g Tween20和1000ml蒸馏水)。样品管置 于37℃水浴恒温振荡器振摇(120rpm)。定期离心分离，取出1.0ml上清液，同时 补入1.0ml新鲜PBS缓冲液。上清液中亮丙瑞林含量用液相则定。经测定，8周内微 球持续释放亮丙瑞林累积达到98.2％，且释放出的亮丙瑞林活性保持率为97.9％。

实施例5

将孔径为50.2μm的亲水性膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将1.2g的分子量 为4万的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(亲水嵌段所占的比例为6％)溶于30ml二氯甲烷 与三氯甲烷复配的溶剂(体积被为1∶1)中作为油相，将该油相加入到300ml的2wt％ 的PVA水溶液中，油相和水相的比例为1∶10，磁力搅拌300rpm搅拌1min制备预乳， 再将该预乳液在70kPa的操作压力下压过微孔膜装置，得到乳液，乳液过膜时间小 于10s，再将乳液在室温下搅拌24h以除去有机溶剂二氯甲烷，再经离心洗涤即得 到载药微球。将所得的微球真空干燥48h得到成品微球。干燥后的微球重新分散在 水中，利用场发射扫描电镜(JEOL SEM Company，Japan)观察微球的表面形貌(如 图7)。微球的体积平均粒径及其分布用激光粒度仪(Malvern Company，USA)测定， 经测定，微球的平均粒径为20.72μm，粒度分布系数CV值为14.16％。将0.2g微球 置于小离心管中，加入5mL乙肝疫苗溶液，在一定温度下超声吸附20h，然后将未 吸附的促黄体激素(LHRH)溶液在5000rpm下离心分离，测定未吸附的LHRH质量， 通过计算定量得到微球对于LHRH的载药率为39.2％。准确称量30mg冻干微球，加 入10ml pH7.4的PBS缓冲液(8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，1.81g Na₂HPO₄·H₂O， 0.5g NaN₃，0.1g Tween20和1000ml蒸馏水)。样品管置于37℃水浴恒温振荡器振摇 (120rpm)。定期离心分离，取出1.0ml上清液，同时补入1.0ml新鲜PBS缓冲液。 上清液中LHRH用BCA试剂和micro-BCA试剂盒则定。经测定，4周内微球持续释放 LHRH累积达到99.0％，且释放出的LHRH活性保持率为96.3％。