一种毛冬青提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的新用途

摘要

本发明涉及毛冬青提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的新用途，可有效解决制备提高脑缺血耐受作用的药物，以提高脑缺血耐受作用的问题，其解决的技术方案是，将毛冬青粉碎成干药粉，用乙醇回流2次，合并滤液，浓缩后再用水分散成药液，药液静置，过滤，再离心后得毛冬青提取液；毛冬青提取液再分别经聚酰胺柱，由乙醇、碳酸钠水溶液洗脱，调pH为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得毛冬青提取物，提取物质量含量总黄酮以芦丁计≥54.0％，本发明方法简单，易制备，所得毛冬青提取物总黄酮，重点是毛冬青提取物总黄酮有效用于制备提高脑缺血耐受作用的药物，是毛冬青提取物的新用途，开拓了毛冬青新的药用价值，是中药上的创新。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种毛冬青提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的新用途。

背景技术

毛冬青为冬青科冬青属植物Ilex pubescens Hook.et Arn.的干燥根，生于山坡灌木丛中，具 有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效，临床上广泛应用于治疗冠心病、心绞痛和脉管炎、 中心性视网膜炎、扁桃体炎、咽喉炎、小儿肺炎等，有较好的疗效，国内外学者广泛重视。 近年来发现毛冬青在治疗心脑血管疾病方面起着重要的作用，毛冬青对脑血管保护作用，对 脑血管有一定的扩张作用，这对促进脑循环调整脑血流，防治脑血管疾病有一定作用。毛冬 青中含有黄酮类成分、酚性成分、香豆素类、二萜类成分、甾醇、鞣质、糖类及氨基酸多种 化学成分，主要成分是毛冬青黄酮苷等。研究表明毛冬青黄酮对缺血脑组织有好的保护作用。 但抗脑缺血与提高脑缺血耐受是两个不同的概念。

脑缺血耐受(ischemic tolerance，IT)是指预先给予一次或多次的亚致死性短暂缺血性损 伤(缺血预处理，ischemic preconditioning，IP)，可以增进脑组织对再次发生的更严重的缺血 性损伤的抵抗，减轻脑损伤程度。脑缺血耐受与脑缺血有本质的区别。目前，药物对脑血管 疾病的干预治疗已成为社会和医学界关注的重要课题，寻找有效的治疗药物来提高脑缺血耐 受的研究越来越得到重视。

目前认为脑缺血耐受的机制可能与兴奋性氨基酸(EAA)、炎症介质、炎症细胞因子、腺 苷、调亡相关基因、即刻早期基因、热休克蛋白(HSP)等有关。近年的研究发现，许多在缺血 再灌注后表达增加或活性上调并在缺血再灌注损伤中发挥细胞毒性作用的生物活性物质，如 炎症介质NO、iNOS和炎症细胞因子TNF-α、IL-1β等在BIT的诱导中却发挥重要作用。

中药可通过多条路径提高脑缺血耐受。脑缺血属于中医“中风”的范围，中医学认为中风 的发生主要与风、火、痰、瘀、虚等因素有关，而与瘀关系最为密切。主张以“活血化瘀”为 主的治则来治疗本病，“活血化瘀”是提高脑缺血耐受的基本方法，改善“微循环”是提高脑缺 血耐受的基本原因，这为中药对脑缺血的干预作用提供了依据。现代医学认为脑缺血的病因 和发病机理倾向于微血栓和血液动力学、血液流变性障碍，这与中医的“血瘀”观是一致的， 血瘀是脑缺血的病理基础。中医药利用活血化瘀方药治疗脑缺血都取得了较好的效果，得到 了较广泛的肯定。但用毛冬青提取物制备提高脑缺血耐受作用的药物，至今未见有公开报导。 提高脑缺血耐受与抗脑缺血也有本质的区别。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种毛冬青提取物在制 备提高脑缺血耐受药物中的新用途，可有效解决制备提高脑缺血耐受作用的药物，以提高脑 缺血耐受作用的问题。

本发明解决的技术方案是，将毛冬青粉碎成干药粉，用乙醇回流2次，合并滤液，浓缩 后再用水分散成药液，药液静置，过滤，再离心后得毛冬青提取液；毛冬青提取液再分别经 聚酰胺柱，由乙醇、碳酸钠水溶液洗脱，调pH为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得毛冬青提 取物(总黄酮)，提取物质量含量总黄酮以芦丁计≥54.0％。

本发明方法简单，易制备，所得毛冬青提取物总黄酮，重点是毛冬青提取物总黄酮有效 用于制备提高脑缺血耐受作用的药物，是毛冬青提取物的新用途，开拓了毛冬青新的药用价 值，是中药上的创新。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的实施方式作详细说明。

本发明在具体实施时，首先制备毛冬青提取液，方法是，将毛冬青粉碎成干药粉，药粉 加8倍重量的质量浓度为70％的乙醇(又称为70％乙醇，以下同)，加热回流2次，每次1小 时，过滤，合并滤液，回收乙醇并浓缩到50℃相对密度为1.10～1.20的浓缩液，浓缩液用 水分散(或称为稀释)为毛冬青重量体积(w/v)的药液(药材∶药液＝1∶1)，重量体积是指 毛冬青用g计，药液用ml计，药液静置，过滤，滤液以10000转/分的速度离心，离心液超 滤，得毛冬青提取液，再将毛冬青提取液通过聚酰胺柱，先用2倍柱体积的10％乙醇洗脱， 再用8倍柱体积50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱液备用，另换8倍柱体积0.1mol/L的 碳酸钠水溶液洗脱，收集洗脱液，用盐酸调pH为中性，减压浓缩，60℃干燥粉碎，得毛冬青 提取物，提取物质量含量总黄酮以芦丁计≥54.0％。

本发明提取物总黄酮具有提高脑缺血耐受作用，可有效用于制备提高脑缺血耐受作用的 药物，并经试验得到了充分的证明，有关试验资料如下：

实验一、毛冬青总黄酮对大鼠脑缺血耐受模型的影响

1.1实验药物

本发明的提取物毛冬青总黄酮(简称为毛冬青总黄酮)。

金纳多(银杏叶提取物片)，德国威玛舒博士药厂，批号：9900908。

1.2试剂

水合氯醛，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号20071018；氯化钠注射液，郑州永和 制药有限公司，批号09073105；医用酒精，郑州晟弘工贸有限公司，批号20090801；甲醛， 莱阳市双双有限公司，批号20090701；NO、NOS、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，由南京建 成生物工程研究所提供，批号均为20090810；IL-1β、TNF-αELISA试剂盒，由上海森雄科技 实业有限公司提供，批号分别为：0910056，0910058。

1.3仪器

1202080019电子分析天平，奥豪斯(上海)公司；KDC-160HR高速冷冻离心机，科大 创新股份有限公司中佳分公司；自动血流变检测仪，重庆迈科仪器仪表有限公司，型号 XLB201；UV-2000型紫外可见分光光度计，尤尼卡(上海)仪器有限公司。

1.4实验动物

大鼠，SD，雄性，清洁级，体重280～300g；由河北省实验动物中心提供，合格证编号 907048。

2实验方法

2.1动物分组及给药

取体重为280～300g雄性SD大鼠98只，随机分为7组，每组14只，分别为假手术组、 预处理模型组、缺血再灌注组、阳性对照药金纳多组(0.02g/kg)及毛冬青总黄酮大、中、小 剂量组(分别为：0.2、0.1、0.05g/kg)。从预处理后第1d开始灌胃给药，阳性对照药金纳多 组与毛冬青总黄酮大、中、小剂量组分别给予相应的药物灌胃；假手术组、预处理模型组与 缺血再灌注组同时给予同体积生理盐水灌胃。所有大鼠灌胃体积为1ml/100g。每日1次，连 续给药4d。

2.2造模方法

首先建立全脑缺血模型：采用Simon等^[2]方法略加改进对大鼠进行脑缺血预处理。所有 大鼠于术前12h禁食不禁水，用10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉，将其仰卧固定，用 酒精擦拭干净颈部，颈部正中切口，逐层分离暴露双侧颈总动脉(CCA)，用微动脉夹阻断双 侧CCA血流10min，观察大鼠瞳孔散大，翻正反射消失，即产生全脑缺血。(假手术组、缺 血再灌注组只暴露双侧CCA，不作处理)。

接着建立局灶性脑缺血模型：参照Koizumi等与Nagasawa等方法略加改进制作大脑中动 脉阻塞模型(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)。于最后一次给药1h，禁食12h后，再次 麻醉大鼠，将其仰卧固定，逐层分离暴露左侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA) 并挂线备用，结扎ECA与CCA，以动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA分叉处 作一切口，从切口处插入头端1mm处涂有硅酮胶的光滑尼龙线(直径0.25～0.26mm，距头端 2cm处作标记)，向上深入至分叉以上约20mm，直至有阻力，即实现大脑中动脉阻塞导致脑 缺血。结扎入口处，尼龙线外留约1cm，缝合皮肤。2h后轻轻提拉所留线头至略有阻力，实 现大脑中动脉再灌注。假手术组仅暴露CCA和ECA，不作其它处理，其余大鼠栓塞左侧大 脑中动脉。脑缺血及再灌注过程中保持室温23～25℃。模型成功的标志为以大鼠手术麻醉清 醒后出现左侧肢体瘫痪，站立不稳，提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。最终建立大 鼠全脑-局灶脑缺血耐受模型。实验最初纳入大鼠98只，两次手术后共计死亡29只，最终有 69只大鼠进入结果分析。

2.3检测指标

2.3.1神经功能缺失评分

按照Zea Longa 5级评分法，于术后24h(即再灌注22h)进行评定，0分及昏迷不醒者 剔除。0分：无神经功能缺损症状；1分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展右侧前爪；2分： 中度局灶性神经功能缺损，向右侧转圈；3分：重度局灶性神经功能缺损，向右侧倾倒；4分： 不能自发行走，意识水平下降。

2.3.2全血黏度和血浆黏度

所有大鼠在术后24h断头取血，肝素抗凝，测全血黏度和血浆黏度。

2.3.3脑组织的形态学观察

于术后24h，神经评分完成后，腹腔注射10％水合氯醛麻醉动物(0.3ml/100g体重)，开颅 取全脑，冠状位取视交叉向尾端3mm～4mm组织块，用10％甲醛溶液固定，做切片用HE染 色，并观察脑组织形态学变化。

2.3.4脑组织匀浆制备及检测造模后24h断头取脑，去小脑、嗅球及低位脑干，取手 术缺血侧大脑的脑前极到视交叉连线中点处至视神经根部位的脑组织，准确称取其重量，按 重量体积比加生理盐水制备成10％的脑组织匀浆，匀浆液经2300r/min，4℃离心10min，取 上清液至-20℃冰箱冻存，用于iNOS和NO，IL-1β和TNF-α的测定。采用考马斯亮蓝蛋白测 定试剂盒测定脑组织蛋白含量，应用NOS试剂盒，按照试剂盒操作说明测iNOS活力，单位 为U/mgprot。应用NO试剂盒采用硝酸还原酶法按照试剂盒操作说明，通过比色法检测大鼠 脑组织匀浆中NO₂^-/NO₃^-的含量，用以表示NO的水平，以μmol/g表示。

2.3.4.1考马斯亮兰蛋白的测定方法

测定原理：蛋白质分子具有-NH₃⁺基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或 样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH₃⁺结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度 可计算出蛋白含量。

试剂的组成及配制：

考马斯亮兰贮备液：60ml×1瓶。临用时按所需量用蒸馏水1∶4稀释(即5倍稀释)，配成 应用液(现用现配)；蛋白标准：0.563g/l蛋白标准液0.5ml。

操作程序：按下表操作：

考马斯亮兰蛋白测定操作程序

混匀，静置10分钟，于595nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管OD值。

计算公式：

2.3.4.2iNOS的测定方法

测定原理：NOS催化L-Arg和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物， 在530nm波长下测定吸光度，根据吸光度的大小可计算出NOS活力。

NOS主要有两种类型：即结构型(cNOS)和诱导型(iNOS)。结构型(cNOS)主要存 在于神经元和内皮细胞内，依赖钙；诱导型(iNOS)主要存在于巨噬细胞内，不依赖钙。根 据此原理可以分型。

试剂的组成及配制：

试剂一：底物缓冲液6ml×4瓶。临用前化冻摇匀；

试剂二：促进剂淡黄色或白色粉剂×6支，稀释液0.6ml×6支。测试前取稀释液一支0.6ml 加入一支粉剂中充分混匀(即将1.5ml小离心管反复颠倒，并将小离心管尖部的液体弹下来)；

试剂三：黄色显色剂6ml×2瓶；

试剂四：透明剂6ml×2瓶；

试剂五：终止剂60ml×4瓶；

试剂六：液体10ml×1瓶。

操作程序：按下表操作：

iNOS测定操作程序

混匀，530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管的吸光度值。

注：本实验选取a^*＝50μl

计算公式：

2.3.4.3NO的测定方法

测定原理：NO化学性质活泼，在体内代谢很快转为NO₂^-和NO₃^-，而NO₂^-又进一步转化 为NO₃^-，本法利用硝酸还原酶特异性将NO₃^-还原为NO₂^-，通过显色深浅测定其浓度的高低。

试剂的组成及配制：

试剂一：液体6ml×2瓶，用前放37℃水浴或室温使溶解后再用；

试剂二：液体6ml×2瓶，用前放37℃水浴或室温使溶解后再用；

混合试剂的配制：按试剂一∶试剂二＝1∶1配制，配好后充分混合后待用；

试剂三：液体12ml×1瓶；

试剂四：液体6ml×1瓶；

试剂五：粉剂×1支，用时加100℃热双蒸水20ml，充分溶解；

试剂六：粉剂×1支，用时加双蒸水20ml；

试剂七：液体8ml×1瓶；

显色剂的配制：一次配成。试剂五∶试剂六∶试剂七＝2.5∶1∶1；

1mol/L标准品0.5ml×1支；

100μmol/L标准应用液的配制：取0.1ml标准品用双蒸水定容稀释至10ml(即100倍稀 释)，混匀，即为100μmol/L标准应用液，现用现配；

另附：配试剂五、试剂六及标准品的双蒸水40ml×2瓶。

操作程序：按下表操作：

NO测定操作程序

混匀，室温静置10分钟，蒸馏水调零，550nm，0.5cm光径，测各管的吸光度值。

计算公式：

2.3.4.4L-1β和TNF-α的测定采用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定脑组织蛋白含量。 采用ELISA方法测定脑组织匀浆中IL-1β、TNF-α的含量。

2.4统计学处理方法

数据分析采用spss13.0 for windows统计软件，计量资料组间比较采用单因素方差分析， 以均数±标准差表示。等级资料采用Ridit检验。

3.实验结果

3.1对脑缺血耐受模型大鼠神经功能缺失评分的影响结果见表1。

表1毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠神经功能缺失评分的影响

与预处理模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01，与缺血再灌注组比较^△P＜0.05^△△P＜0.01

由上表可以看出：假手术组大鼠没有神经功能缺损表现，其他组大鼠缺血24h后均出现 了不同程度的神经功能障碍。表现为右侧前爪不能完全伸展，行走时向右侧旋转或倾倒，甚 至不能行走。与假手术组相比，预处理模型组、缺血再灌注组有显著的统计意义(P＜0.01)， 说明造模成功。与预处理模型组相比，毛冬青总黄酮大剂量组神经功能缺失评分明显降低 (P＜0.05)；与缺血再灌注组相比，毛冬青总黄酮大剂量组和阳性对照药金纳多组有显著的统 计意义(P＜0.01)，毛冬青总黄酮中、小剂量组差异明显(P＜0.05)。但预处理模型组仅有降 低神经功能缺失评分的趋势，没有统计学差异(P＞0.05)。结果提示毛冬青总黄酮可明显降 低实验大鼠神经功能缺失评分。

3.2对脑缺血耐受模型大鼠全血黏度和血浆黏度的影响结果见表2。

表2毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠全血黏度和血浆黏度的影响

与预处理模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01，与缺血再灌注组比较^△P＜0.05^△△P＜0.01

由上表可以看出：与假手术组相比，预处理模型组、缺血再灌注组的全血黏度和血浆黏 度显著升高(P＜0.01)，说明造模成功，实验大鼠有明显的血瘀证。与预处理模型组相比，毛 冬青总黄酮大剂量组和阳性对照药金纳多组的全血黏度和血浆黏度显著降低(P＜0.01)；与缺 血再灌注组相比，毛冬青总黄酮大剂量组和阳性对照药金纳多组的全血黏度和血浆黏度显著 降低(P＜0.01)，毛冬青总黄酮中剂量组的全血黏度和血浆黏度显著或明显降低(P＜0.01或 P＜0.05)，毛冬青总黄酮小剂量组的全血黏度显著降低(P＜0.01)。预处理模型组无统计学差 异。结果提示：毛冬青总黄酮可显著改善实验大鼠的血液流变学各项指标，降低全血黏度和 血浆黏度。

3.3对脑缺血耐受模型大鼠脑组织的协同保护作用结果见表3。

表3毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑组织的协同保护作用

根据实验动物脑神经细胞出现不同的病理改变可将分为四级：“-”脑神经细胞体大、胞 浆丰富、细胞核均正常；“+”大部分脑神经细胞、胞浆、细胞核均正常，个别脑神经细胞萎缩； “++”少部分脑神经细胞萎缩，大部分脑神经细胞、胞浆、细胞核均正常；“+++”大部分实验 动物脑神经细胞明显萎缩，胞浆明显减少、细胞核及核仁模糊不清。根据半定量的标准对实 验各组动物脑神经病理改变进行测定。

由上表可以看出：假手术组实验大鼠脑神经细胞、胞浆、细胞核均正常；胞浆丰富，胞 核明显；预处理模型组实验大鼠脑神经细胞部分体积缩小，胞浆减少，细胞核淡染或消失； 缺血再灌注损伤组脑神经细胞明显萎缩，胞浆明显减少，细胞核模糊不清或消失；毛冬青总 黄酮大剂量组和阳性对照药金纳多组实验大鼠大部分脑神经细胞体积增大，个别细胞萎缩， 胞浆减少，细胞核淡染或消失；毛冬青总黄酮中剂量组实验大鼠脑神经细胞体积缩小，胞浆 减少，细胞核均正常；毛冬青总黄酮小剂量组实验大鼠脑神经细胞体积缩小，胞浆减少，部 分细胞核淡染或消失。见附录1病理照片毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑组织HE染 色。

经Ridit检验，与假手术组相比，预处理模型组、缺血再灌注组有显著的统计意义 (P＜0.01)，说明造模成功。与预处理模型组相比，毛冬青总黄酮大剂量组和阳性对照药金纳 多组可显著减轻缺血侧脑组织的病理损伤程度(P＜0.01)，毛冬青总黄酮中剂量组有明显的统 计学意义(P＜0.05)；与缺血再灌注组相比，毛冬青大、中剂量组和阳性对照药金纳多组差异显 著(P＜0.01)，预处理模型组无统计学意义(P＞0.05)。结果提示：毛冬青总黄酮可明显减轻 缺血侧脑组织的病理损伤程度。

3.4对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中iNOS活性和NO水平的影响结果见表4。

表4毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中iNOS活性和NO水平的影响

与预处理模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01，与缺血再灌注组比较^△P＜0.05^△△P＜0.01

由上表可以看出：与假手术组相比，预处理模型组、缺血再灌注组大鼠缺血侧脑组织iNOS 活性和NO水平显著升高(P＜0.01)。与预处理模型组相比，毛冬青总黄酮各剂量组iNOS活 性无统计学差异；与缺血再灌注组相比，预处理模型组、毛冬青总黄酮大、中、小剂量组和 阳性对照药金纳多组可显著升高大鼠缺血侧脑组织中iNOS的活性(P＜0.01)。与预处理模型 组相比，毛冬青总黄酮大剂量组和阳性对照药金纳多组显著升高缺血侧脑组织中的NO水平 (P＜0.01)；与缺血再灌注组相比，预处理模型组、毛冬青总黄酮大、中、小剂量组和阳性对 照药金纳多组可显著升高NO的水平(P＜0.01)。此结果提示：炎症介质iNOS、NO参与了 BIT的产生，毛冬青总黄酮通过适度提高iNOS活性和NO的水平而实现提高脑缺血耐受的作 用。

3.5毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中IL-1β和TNF-α含量的影响结果见表 5。

表5毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中IL-1β和TNF-α含量的影响

与预处理模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01，与缺血再灌注组比较^△P＜0.05^△△P＜0.01

由上表可以看出：与假手术组相比，预处理模型组、缺血再灌注组大鼠缺血侧脑组织 IL-1β、TNF-α含量显著或明显升高(P＜0.01或P＜0.05)。与预处理模型组相比，毛冬青总黄 酮大、中、小剂量组和阳性对照药金纳多组有升高IL-1β、TNF-α含量的趋势，但无统计学差 异(P＞0.05)；与缺血再灌注组比较，毛冬青总黄酮大剂量组和阳性对照药金纳多组可显著 升高缺血侧脑组织中IL-1β、TNF-α含量(P＜0.01)，毛冬青总黄酮中、小剂量组可显著或明 显升高缺血侧脑组织中IL-1β、TNF-α含量(P＜0.01)，预处理模型组可明显升高缺血侧脑组 织中IL-1β、TNF-α含量(P＜0.05)。此结果提示：炎症细胞因子IL-1β、TNF-α参与了BIT 的产生，毛冬青总黄酮通过适度提高IL-1β、TNF-α的含量而实现提高脑缺血耐受的作用。

实验二、毛冬青总黄酮对小鼠脑缺血耐受模型的影响

1实验材料

1.1实验药物

毛冬青总黄酮，由河南中医学院分析化学实验室提供，含量54％以上，同实验一。金纳 多(银杏叶提取物片)，德国威玛舒博士药厂，批号9900908。

1.2试剂

水合氯醛，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号20071018；氯化钠注射液，郑州永和 制药有限公司，批号09073105；医用酒精，郑州晟弘工贸有限公司，批号20090801；甲醛， 莱阳市双双有限公司，批号20090701；碘[¹²⁵I]血栓烷B₂放射免疫分析药盒，北京普尔伟业 生物科技有限公司解放军总医院科技开发中心放免所，批号20091225；碘[¹²⁵I]6-酮-前列腺素 F_1α放射免疫分析药盒，北京普尔伟业生物科技有限公司解放军总医院科技开发中心放免所， 批号20091225。

1.3仪器

JT6001电子天平，上海精天电子仪器厂；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂； SN-695B型智能放免γ测量仪，上海原子核研究所日环仪器一厂。

1.4实验动物

小鼠，昆明种，雄性，清洁级，体重25～30g；由河北省实验动物中心提供，合格证编 号912103。

2实验方法

2.1动物分组及给药

取体重为25～30g雄性昆明种小鼠126只，随机分为7组，每组18只，分别为假手术组、 预处理模型组、缺血再灌注组、阳性对照药金纳多组(0.04g/kg)及毛冬青总黄酮大、中、小 剂量组(分别为：0.3、0.15、0.075g/kg)。从预处理后第1d开始灌胃给药，阳性对照药金纳 多组与毛冬青总黄酮大、中、小剂量组分别给予相应的药物灌胃，假手术组、预处理模型组 与缺血再灌注组同时给予同体积生理盐水灌胃。所有小鼠的灌胃体积是0.1ml/10g。每日1次， 连续给药5d。

2.2造模方法

首先对小鼠进行脑缺血预处理。所有小鼠于术前12h禁食不禁水，用10％水合氯醛 0.03ml/10g腹腔注射麻醉，将其仰卧固定，颈部正中切口，钝性分离双侧颈总动脉。除假手 术组、缺血再灌注组外，其余各组小鼠用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，分别阻断血流10min， 然后恢复灌流；假手术组、缺血再灌注组只暴露双侧颈总动脉，但不阻断血流。接着于第5 天给药后1h，禁食12h后，再次麻醉小鼠，将其仰卧固定，颈部正中切口，钝性分离双侧颈 总动脉，除假手术组外，其余小鼠均用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，分别阻断血流30min， 然后恢复灌流；假手术组只暴露双侧颈总动脉，但不阻断血流。手术过程中保持室温23～25℃。 最终建立小鼠全脑-全脑脑缺血耐受模型。手术过程中保持室温23～25℃。实验最初纳入小鼠 126只，两次手术后共计死亡41只，最终有85只小鼠进入结果分析。

2.3检测指标

所有小鼠于末次手术后24h处死。处死前摘眼球取血，放入加有消炎痛-EDTA.Na₂液的 试管中，即刻混匀，3500r/min，4℃离心15min，分离血浆，放-20℃保存，采用放射免疫法 检测血浆中血栓烷B₂(TXB₂)和6-酮-前列腺素F_1α(6-keto-PGF_1α)的含量，并计算 TXB₂/6-keto-PGF_1α的比值；动物处死后，迅速剥取脑组织，10％甲醛溶液固定，冠状切取做 HE染色，并采用免疫组织化学染色法，检测脑组织中c-fos，COX-2的表达。

2.3.1放射免疫法检测血浆中血栓烷B₂(TXB₂)和6-酮-前列腺素F_1α(6-keto-PGF_1α)的含量， 并计算TXB₂/6-keto-PGF_1α的比值。

2.3.1.1血栓烷B₂的测定方法

测定原理：利用液相竞争抑制原理，采用平衡法对样品进行测定。待测样品或标准与限 量的抗血清及标记抗原加在一起进行竞争性结合反应，反应完全后，加入免疫分离剂，分离 出抗原-抗体复合物，测定复合物的放射性(B)，计算各标准管的结合率(B/Bo％)。作出标 准曲线，查出样品浓度。

药盒组成及配制：

缓冲液A：1瓶(液体)，10ml，摇匀后直接使用；

缓冲液B：1瓶(蓝色，液体)，30ml，摇匀后直接使用；

TXB₂标准品：1支(白色，冻干粉)。临用前加缓冲液A 2ml溶解，浓度为800pg/ml， 作为S₇，另取试管6支编号S₆-S₁。各加缓冲液A 1ml，从S₇中取1ml加到S₆，依次倍比 稀释至S₁，浓度为12.5，25，50，100，200，400，800pg/ml；

TXB₂抗血清：1瓶(白色，冻干粉)，用缓冲液B 10ml溶解；

¹²⁵I-TXB₂：1瓶(白色，冻干粉)，用缓冲液B 10ml溶解；

PR分离剂：1瓶(液体)，60ml，使用前充分混匀，直接使用。

操作程序：

本实验采用平衡法，取聚苯乙烯试管编号，按下表操作：

TXB₂RIA加液程序(μl)

数据处理：以γ计数仪预先编制的程序直接给出有关参数、校准曲线及样品浓度。

2.3.1.26-酮-前列腺素F_1α的测定方法

测定原理：利用液相竞争抑制原理，采用非平衡法对样品进行测定。先将待测样品或标 准与限量的抗血清加在一起反应一段时间后，再加入标记抗原进行竞争性结合反应，反应完 全后，加入免疫分离剂，分离出抗原-抗体复合物，测定复合物的放射性(B)，计算各标准 管的结合率(B/Bo％)。作出标准曲线，查出样品浓度。

药盒组成及配制：

缓冲液A：1瓶(液体)10ml，摇匀后直接使用。

缓冲液B：1瓶(红色，液体)30ml，摇匀后直接使用。

6-Keto-PGF₁α标准品：1支(白色，冻干粉)。临用前加缓冲液A 2ml溶解，浓度为 1600pg/ml，作为S₇，另取试管6支编号S₆-S₁。各加缓冲液A 1ml，从S₇中取1ml加到S₆， 依次倍比稀释至S₁，浓度为25，50，100，200，400，800，1600pg/ml。

6-Keto-PGF₁α抗血清：1瓶(白色，冻干粉)，用缓冲液B 10ml溶解。

¹²⁵I-6-Keto-PGF₁α：1瓶(白色，冻干粉)，用缓冲液B 10ml溶解。

PR分离剂：1瓶(液体)，60ml，使用前充分混匀，直接使用。

操作程序：

本实验采用非平衡法，取聚苯乙烯试管编号，按下表操作：

6-Keto-PGF₁αRIA加液程序(μl)

数据处理：以γ计数仪预先编制的程序直接给出有关参数、校准曲线及样品浓度。

2.3.2脑组织切片的形态学观察：常规HE染色，并观察脑组织形态学改变。

2.3.3采用免疫组织化学染色法，观察脑组织中c-fos，COX-2的表达。

2.4统计学处理方法

数据分析采用spss13.0 for windows统计软件，计量资料组间比较采用单因素方差分析， 以均数±标准差表示。等级资料采用Ridit检验。

3.实验结果

3.1对脑缺血耐受模型小鼠血浆中TXB₂、6-keto-PGF_1α含量及T/K值的影响结果见表6。

表6毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型小鼠血浆中TXB₂、6-keto-PGF_1α含量及T/K值的影响

与预处理模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01，与缺血再灌注组比较^△P＜0.05^△△P＜0.01

由上表可以看出：与假手术组相比，预处理模型组和缺血再灌注组TXB₂显著升高 (P＜0.01)，6-keto-PGF_1α显著降低(P＜0.01)，TXB₂/6-keto-PGF_1α比值显著升高(P＜0.01)， 说明造模成功，实验小鼠有明显的血瘀证。与预处理模型组相比，毛冬青总黄酮大、中剂量 组和阳性对照药金纳多组TXB₂显著降低(P＜0.01)；毛冬青总黄酮大、中剂量组和阳性对照 药金纳多组6-keto-PGF_1α明显升高(P＜0.01或P＜0.05)，TXB₂/6-keto-PGF_1α比值明显降低 (P＜0.01或P＜0.05)；与缺血再灌注组相比，毛冬青总黄酮大、中剂量组和阳性对照药金纳 多组TXB₂显著降低(P＜0.01)；毛冬青总黄酮大、中、小剂量组和阳性对照药金纳多组 6-keto-PGF_1α明显升高(P＜0.01或P＜0.05)，TXB₂/6-keto-PGF_1α比值明显降低(P＜0.01或 P＜0.05)。结果提示：毛冬青总黄酮可显著降低TXB₂，升高6-keto-PGF_1α并降低TXB₂/6-keto-PGF_1α比值，改善实验小鼠的血小板功能。

3.2对脑缺血耐受模型小鼠脑组织的协同保护作用结果见表7。

表7毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型小鼠脑组织的协同保护作用

根据实验动物脑神经细胞出现不同的病理改变可将分为四级：“-”脑神经细胞体大、胞 浆丰富、细胞核均正常；“+”大部分脑神经细胞、胞浆、细胞核均正常，个别脑神经细胞萎缩； “++”少部分脑神经细胞萎缩，大部分脑神经细胞、胞浆、细胞核均正常；“+++”大部分实验 动物脑神经细胞明显萎缩，胞浆明显减少、细胞核及核仁模糊不清。根据半定量的标准对实 验各组动物脑神经病理改变进行测定。

由上表可以看出：假手术组实验小鼠脑神经细胞均正常，神经细胞胞浆丰富，核及核仁 均清析可见；预处理模型组实验小鼠脑神经细胞部分体积缩小，胞浆减少，细胞核淡染或消 失，还可见因脑缺血出现血管扩张；缺血再灌注组实验小鼠大部分脑神经细胞明显萎缩，胞 浆明显减少，细胞核模糊不清或消失，也可见因脑缺血出现血管扩张；毛冬青总黄酮大剂量 组和阳性对照药金纳多组大部分脑神经细胞、胞浆、细胞核均正常，个别脑神经细胞萎缩， 体积缩小，胞浆减少、细胞核及核仁模糊不清；毛冬青总黄酮中剂量组实验小鼠少部分脑神 经细胞体积缩小，胞浆减少，大部分脑神经细胞细胞核均正常；毛冬青总黄酮小剂量组实验 小鼠脑神经细胞体积缩小，胞浆减少，细胞核淡染或消失。经Ridit检验，与假手术组相比， 预处理模型组、缺血再灌注组有显著的统计意义(P＜0.01)，说明造模成功。与预处理模型组 相比，毛冬青总黄酮大剂量组和阳性对照药金纳多组可显著减轻脑组织的病理损伤程度 (P＜0.01)，毛冬青总黄酮中剂量组有明显的统计学意义(P＜0.05)；与缺血再灌注组相比，毛 冬青总黄酮大、中剂量组和阳性对照药金纳多组差异显著(P＜0.01)，毛冬青总黄酮小剂量组 有明显的统计学意义(P＜0.05)，预处理模型组无统计学意义(P＞0.05)。结果提示：根据病理 观察结果及上述数理统计分析，本次实验动物脑缺血耐受预处理模型组与缺血再灌注组相比 较，缺血再灌注组的病理改变要重，脑神经细胞明显萎缩，胞浆明显减少、细胞核模淡染、 模糊不清或消失；毛冬青总黄酮各剂量组均具有不同提高脑缺血耐受的作用，可减轻缺血损 伤改变。

2.3对脑缺血耐受模型小鼠脑组织中c-fos表达的影响结果见表8。

表8毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型小鼠脑组织中c-fos表达的影响

根据实验动物脑神经细胞不同的c-fos阳性强弱可将分为四级：“-”脑神经细胞细胞膜、 胞浆中c-fos阴性；“+”脑神经细胞细胞膜、胞浆中c-fos弱阳性；“++”脑神经细胞细胞膜、 胞浆中c-fos阳性；“+++”脑神经细胞细胞膜、胞浆中c-fos强阳性。

由上表可以看出：假手术组动物大部分脑神经细胞膜、胞浆c-fos呈阴性；预处理模型组 动物少部分脑神经细胞膜、胞浆c-fos呈阳性；缺血再灌注组动物脑神经细胞c-fos阳性染色 为细胞膜和细胞浆呈棕色，少部分脑神经细胞膜、胞浆c-fos呈强阳性；阳性对照药金纳多组 大部分脑神经细胞膜、胞浆c-fos呈弱阳性；毛冬青总黄酮大剂量组动物脑神经细胞c-fos阳 性染色为细胞膜和细胞浆呈棕色，大部分脑神经细胞膜、胞浆c-fos呈弱阳性；毛冬青总黄酮 中剂量组动物脑神经细胞c-fos阳性染色为细胞膜和细胞浆呈棕色，少部分脑神经细胞、胞浆 c-fos呈弱阳性；毛冬青总黄酮小剂量组动物脑神经细胞c-fos阳性染色为细胞膜和细胞浆呈 棕色，少部分脑神经细胞膜、胞浆c-fos呈阳性。c-fos阳性细胞主要分布于皮质，海马区也 略见表达。经Ridit检验，假手术组c-fos几乎未见表达；与假手术组相比，预处理模型组、 缺血再灌注组c-fos表达显著升高(P＜0.01)。与预处理模型组相比，毛冬青总黄酮大、中剂量 组和阳性对照药金纳多组c-fos表达明显降低(P＜0.05)；与缺血再灌注组相比，毛冬青总黄酮 大、中剂量组和阳性对照药金纳多组c-fos表达显著降低(P＜0.01)，预处理模型组、毛冬青总 黄酮小剂量组有明显的统计学意义(P＜0.05)。此结果提示：即早基因c-fos参与了BIT的产生， 毛冬青总黄酮通过抑制c-fos的过度表达而实现提高脑缺血耐受的作用。

2.4对脑缺血耐受模型小鼠脑组织中COX-2表达的影响结果见表9。

表9毛冬青总黄酮对脑缺血耐受模型小鼠脑组织中COX-2表达的影响

根据实验动物脑神经细胞不同的COX-2阳性强弱可将分为四级：“-”脑神经细胞细胞膜、 胞浆中COX-2阴性；“+”脑神经细胞细胞膜、胞浆中COX-2弱阳性；“++”脑神经细胞细胞膜、 胞浆中COX-2阳性；“+++”脑神经细胞细胞膜、胞浆中COX-2强阳性。

由上表可以看出：假手术组动物大部分脑神经细胞膜、胞浆COX-2呈阴性；预处理模型 组动物少部分脑神经细胞膜、胞浆COX-2呈阳性；缺血再灌注组动物脑神经细胞COX-2阳 性染色为细胞膜和细胞浆呈棕色，少部分脑神经细胞膜、胞浆COX-2呈强阳性；阳性对照药 金纳多组大部分脑神经细胞膜、胞浆COX-2呈弱阳性；毛冬青总黄酮大剂量组动物脑神经细 胞COX-2阳性染色为细胞膜和细胞浆呈棕色，大部分脑神经细胞膜、胞浆COX-2呈弱阳性； 毛冬青总黄酮中剂量组动物脑神经细胞COX-2阳性染色为细胞膜和细胞浆呈棕色，少部分脑 神经细胞、胞浆COX-2呈阳性；毛冬青总黄酮小剂量组动物脑神经细胞COX-2阳性染色为 细胞膜和细胞浆呈棕色，少部分脑神经细胞膜、胞浆COX-2呈强阳性。COX-2阳性细胞主要 分布于皮质，海马区也略见表达。经Ridit检验，假手术组COX-2几乎未见表达。与假手术 组相比，预处理模型组、缺血再灌注组COX-2表达显著升高(P＜0.01)。与预处理模型组相比， 毛冬青总黄酮大剂量组表达显著降低(P＜0.01)，阳性对照药金纳多组COX-2表达明显降低 (P＜0.05)；与缺血再灌注组相比，毛冬青总黄酮大剂量组和阳性对照药金纳多组COX-2表达 显著降低(P＜0.01)，预处理模型组、毛冬青总黄酮中剂量组表达明显降低(P＜0.05)。此结果提 示：即早基因COX-2参与了BIT的产生，毛冬青总黄酮通过抑制COX-2的表达而实现提高 脑缺血耐受的作用。