基于MAGE-C2/CT10基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于MAGE-C2/CT10基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括针对MAGE-C2/CT10基因的特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本发明的试剂盒，不仅可以应用于定性诊断多发性骨髓瘤，还可以通过内参基因，测定患者MAGE-C2/CT10基因的表达水平。本发明为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于MAGE-C2/CT10基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测 试剂盒。

背景技术

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是威胁生命的浆细胞性恶性肿瘤，在血液 恶性肿瘤中发病率位于第二位。尽管干细胞移植以及新型药物治疗可以使病情得到有 效控制，但很少有患者能够取得完全缓解甚至治愈，复发和死亡的结局仍不可避免。

分子生物学的发展使越来越多的肿瘤相关基因为人们所认知，这些重要的分子标 志已在血液系统恶性肿瘤的诊断和治疗中发挥了极大的作用，在MM中虽然已发现涉及 免疫球蛋白基因重排、C-MYC、RAS癌基因突变及人类端粒酶逆转录酶mRNA过度表达 等，但缺乏公认的肿瘤相关的特异性诊断、微小残留病检测和预后评估的分子靶标。

癌睾丸抗原(Cancer testis antigen，CT抗原)基因是与恶性肿瘤相关的基因 家族，编码免疫原性蛋白质，在过去15年间已鉴定了40多个家族，表达特点是限制 性表达于正常组织睾丸、卵巢和胚胎滋养层细胞，其他正常组织几乎不表达，而在多 种肿瘤组织中有不同频率的表达，且可诱导抗体介导和T细胞介导的免疫反应。基于 其在肿瘤患者及正常组织中的表达特点和免疫原性，CT抗原已被认为是有应用前景的 人类恶性肿瘤免疫治疗的靶标，并有可能成为重要的诊断和预后标志。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于MAGE-C2/CT10基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的 定量检测试剂盒。

本发明提供了一种辅助诊断多发性骨髓瘤患者的试剂盒，包括特异性引物对甲和 探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA 组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。

所述试剂盒还包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有MAGE-C2/CT10基因(NCBI基因 库序列号：NM_016249)或其片段的重组质粒。所述阳性质粒可为含有序列表的序列7 所示的MAGE-C2/CT10基因片段的重组质粒。所述阳性质粒具体可为将pMD18-T载体与 序列表的序列7所示的MAGE-C2/CT10基因片段连接得到的重组质粒。

所述试剂盒还可包括针对内参基因的特异性引物对乙和探针乙；所述内参基因为 ABL基因(NCBI基因库序列号：NM_005157)。所述特异性引物对乙具体可为序列表的 序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列 具体可如序列表的序列6所示。

所述试剂盒还可包括内参质粒；所述内参质粒为含有ABL基因或其片段的重组质 粒。所述内参质粒可为含有序列表的序列8所示的ABL基因片段的重组质粒。所述内 参质粒具体可为将pMD18-T载体与序列表的序列8所示的ABL基因片段连接得到的重 组质粒。

所述特异性引物对甲和所述探针甲可用于制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。

在多发性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，MAGE-C2/CT10基因表达，而在正常人 的骨髓或外周血中，MAGE-C2/CT10基因不表达。本发明的试剂盒，不仅可以应用于 定性辅助诊断多发性骨髓瘤，还可以通过内参基因，测定患者MAGE-C2/CT10基因的 表达水平。MAGE-C2/CT10基因的表达水平有希望成为MM辅助诊断、预后和疗效监测 指标，对其进行深入研究有助于了解MM的病理机制，寻求新的治疗策略。本发明为多 发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病 的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

附图说明

图1为内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线。

图2为阳性对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线。

图3为MAGE-C2/CT10基因相对表达量与浆细胞数和CD38+/CD138+浆细胞数的相 关性结果。

图4为MAGE-C2/CT10基因相对表达量与患者生存时间的相关性结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。kits：购自Invitrogen公司。RNAsin：购自华美生物技 术公司。dNTP：购自Pharmecia公司。Mo-MLV逆转录酶、5×标准缓冲液：购自Promega 公司。DNA连接酶：购自TakaRa公司。Universal PCR Master mix：购自天根生物技术 有限公司。Phusion High-Fidelity PCRKit：购自New EnglandBiolabs公司。RPMI8226 细胞：购自美国ATCC(美国标准生物品收藏中心)，产品目录号为CCL-155。U266细胞： 购自美国ATCC，产品目录号为TIB-196。KM3细胞：购自上海拜力生物科技有限公司。 KG-1细胞：购自中国科学院昆明细胞库，产品目录号为KCB 200552YJ。HL60细胞：购 自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu23。CEM细胞：购自美国ATCC，产品目录号为 CCL-119。Nalm-6细胞：购自北京大学疾病基因研究中心。

多发性骨髓瘤诊断及分期标准参照文献：Greipp PR，San Miguel J，Durie BG，et  al.Internati onal Staging System for Multiple Myeloma.Journal of Clinical  Oncology，2005，15：3412-3420.。疗效的评价标准参照文献：Durie BG，Harousseau  JL，Miguel JS，et al.International uniform response criteria for multiple  myeloma.Leukemia.2006，20：1467-1473.。统计分析应用SPSS软件v.13.0。计量 资料采用方差分析，计数资料采用卡方检验。临床资料与CT抗原基因表达间的相关性 用直线相关分析。p＜0.05被认为是有统计学意义。通过单因素和多因素分析评价因素 与生存的相关性，采用Log-rank检验鉴定生存相关因素，p＜0.05的变量纳入Cox回 归分析，p＜0.2定义为与生存预后相关的因素。

实施例3至8中的PCR参数均如下：

PCR反应体系(10μl)：上游引物0.9μM，下游引物0.9μM，探针0.25μM，2 ×TaqMan通用PCR公共体系5μl(ABI公司，美国)，质粒1μl；其余为去离子水。

PCR反应条件：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃1min， 50个循环。

实施例1、特异性引物对和探针的设计

针对MAGE-C2/CT10基因(NCBI基因库序列号：NM_016249)的特异性引物对甲((由 上游引物MAG-FP和下游引物MAG-RP组成，扩增产物为137bp)和探针甲(探针 MAG-T-probe)：

上游引物MAG-FP(序列表的序列1)：5’-GTGTGAGGCACACAGCCTAAAG-3’；

下游引物MAG-RP(序列表的序列2)：5’-GGAGGCATGACGACTTCTTCA-3’；

探针MAG-T-probe(5’→3’)：

FAM-AGGAGTCAAGGCCTGTTGGATCTCATCA-BHQ(核苷酸序列为序列表的序列3)。

针对ABL1基因(内参基因；NCBI基因库序列号：NM_005157)设计的特异性引物 对乙(由上游引物ABL1-F和下游引物ABL1-R组成，扩增产物为124bp)和探针乙(探 针ABL1-T-probe)：

上游引物ABL1-F(序列表的序列4)：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’；

下游引物ABL1-R(序列表的序列5)：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’；

探针ABL1-T-probe(5’→3’)：

FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(核苷酸序列为序列表的序列6)。

分别合成特异性引物对甲、探针甲、特异性引物对乙和探针乙。(可参考文献合成： Gabert J，Beillard E，van der Velden VH，et al.Standardization and quality  control studies of’real-time’quantitative reverse transcriptase polymerase  chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in  leukemia-a Europe Against Cancer program.Leukemia.2003，17：2318-57.)。

实施例2、相关质粒的制备

一、阳性对照质粒(含有MAGE-C2/CT10基因片段的质粒)的制备

以MAGE-C2/CT10基因表达阳性的多发性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓单个核细 胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列7所示 (884bp)，扩增产物经纯化后，克隆入pMD18-T质粒(pMD18-T载体系统，上海皓嘉公 司，产品目录号：D101A)，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α(天根生化公司，产品目录 号：CD101-02)感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了 阳性对照质粒(骨架质粒为pMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列7所示cDNA)。

PCR扩增所用的引物对如下：

上游引物：5’-CGGATCGGA GGCATTTGTGAG-3’；

下游引物：5’-ATGAACTCACGGGCTCTCTTGAG-3’。

二、内参对照质粒(含有ABL基因片段的质粒)的制备

以正常人(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的 核苷酸序列如序列表的序列8所示(124bp)，扩增产物经纯化后，克隆入pMD18-T质粒， 将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结 果表明得到了内参对照质粒(骨架质粒为pMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列8所示 cDNA)。

PCR扩增所用的引物对如下：

上游引物：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’；

下游引物：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’。

三、阴性对照质粒

pMD18-T质粒。

实施例3、检测阳性对照质粒的灵敏度检测

将实施例2得到的阳性对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释得到各个 稀释液(每微升分别含有10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰个拷贝的MAGE-C2/CT10 基因片段)；将实施例2得到的内参对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释 得到各个稀释液(每微升分别含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰个拷贝的ABL基 因片段)；通过测定吸光度值计算MAGE-C2/CT10基因片段或ABL基因片段的拷贝数)。

将各个阳性对照质粒稀释液采用实施例1得到的特异性引物对甲和探针甲在荧光 实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。将各个内参对照质粒 采用实施例1得到的特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司 7500-FAST型)上进行RQ-PCR。

内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线见图1(阈值为0.082)，函数为log₁₀ABL1＝(Ct-38.46)/-3.22，相关系数均达到0.99以上，检测内参基因的灵敏度达10 个拷贝。阳性对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线见图2(阈值为0.082)，函数为 log₁₀MAGE-C2/CT10＝(Ct-40.41)/-3.43，相关系数均达到0.99以上，检测MAGE-C2/CT10 基因片段的灵敏度可达10个拷贝。

实施例4、检测细胞系及多发性骨髓瘤患者

一、试剂盒的组装

试剂盒由如下组件组成：实施例1制备的针对MAGE-C2/CT10基因的特异性引物对 甲和探针甲、针对ABL1基因的特异性引物对乙和探针乙；实施例2制备的阳性对照质 粒和内参对照质粒。

二、应用步骤一的试剂盒检测细胞系

分别检测各个细胞系中的MAGE-C2/CT10基因的表达水平。每个细胞系样本皆重 复检测3次。步骤如下：

1、提取各个细胞的总RNA，反转录为cDNA。

2、以cDNA为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI 公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR；以cDNA为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧 光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结 果时阈值均固定为阈值为0.082。

PCR反应体系和PCR反应条件同实施例3。

分别用阳性对照质粒和内参对照质粒制作标准曲线。对照标准曲线得到各细胞系 中MAGE-C2/CT10基因和ABL1基因的拷贝数。以MAGE-C2/CT10基因的拷贝数与ABL1 基因的拷贝数的比值表示MAGE-C2/CT10基因的相对表达水平(％)。结果见表1。

表1在血液肿瘤细胞系中MAGE-C2/CT10基因的相对表达水平

  细胞系   来源   MAGE-C2/CT10基因的相对表达水平   RPMI8226   多发性骨髓瘤患者   13.52   U266   多发性骨髓瘤患者   16.37   KM3   多发性骨髓瘤患者   2.97   KG-1   急性髓性白血病患者   0.00   HL60   急性髓性白血病患者   0.00   CEM   T细胞急性淋巴细胞白血病患者   0.00   Nalm-6   B系急性淋巴细胞白血病患者   0.00

三、应用步骤一的试剂盒检测多发性骨髓瘤患者

分别对若干多发性骨髓瘤患者(志愿者)及其他志愿者进行检测。步骤如下：

1、用TRIzol试剂盒(购自美国Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书在无菌条 件下提取各个志愿者的骨髓标本的RNA(或外周血标本的RNA也可)，反转录为cDNA。

2、以cDNA为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI 公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR；以cDNA为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧 光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结 果时阈值均固定为阈值为0.082。

PCR反应体系和PCR反应条件同实施例3。

分别用阳性对照质粒和内参对照质粒制作标准曲线。对照标准曲线得到各患者中 MAGE-C2/CT10基因和ABL1基因的拷贝数。以MAGE-C2/CT10基因的拷贝数与ABL1基 因的拷贝数的比值表示MAGE-C2/CT10基因的相对表达水平(％)。结果见表2。

表2在血液肿瘤患者和正常人骨髓中MAGE-C2/CT10基因的相对表达水平

注：如果相对表达量检测结果大于0，为阳性结果；否则为阴性结果，记为“—”。

多发性骨髓瘤患者骨髓中MAGE-C2/CT10基因的阳性率和表达水平均高于CML患者、 AML患者和B-ALL患者，在22例健康供者的检测结果均为阴性。

实施例5、MAGE-C2/CT10基因与疗效的相关性

一、MAGE-C2/CT10基因在不同疗效患者中的阳性率

共检测138例多发性骨髓瘤患者(志愿者)的138份骨髓样本。138例多发性骨 髓瘤患者中，初治患者60例，治疗后患者78例。治疗后患者中，难治复发患者10 例，治疗有效患者(部分缓解和完全缓解)17例。

各个基因的相对表达量检测方法同实施例4的步骤三。如果相对表达量检测结果 大于0，为阳性结果；否则为阴性结果。结果见表3。

表3MM患者中MAGE-C2/CT10基因表达的阳性率(p＜0.01)

  阳性患者个数   阳性率   多发性骨髓瘤患者(n＝138)   99   71.7％   初治患者和难治复发患者(n＝60+10＝70)   59   84.3％   治疗有效患者(n＝17)   6   35.3％

二、患者病程中MAGE-C2/CT10基因的阳性率变化

MAGE-C2/CT10基因检测方法同实施例4的步骤三。如果相对表达量检测结果大 于0，为阳性结果；否则为阴性结果。

33例MAGE-C2/CT10基因检测结果阳性的多发性骨髓瘤初治患者(志愿者)进行 跟踪观察：24例患者(72.7％)治疗有效，该部分患者在部分缓解或完全缓解后，12 例患者(50％)MAGE-C2/CT10基因检测结果为阳性；9例患者治疗无效(27.3％)，且 MAGE-C2/CT10基因检测结果持续为阳性。

实施例6、MAGE-C2/CT10基因表达量与浆细胞数和CD38+/CD138+浆细胞数的相关 性

MAGE-C2/CT10基因检测方法同实施例4的步骤三。

117例MAGE-C2/CT10基因检测结果阳性的多发性骨髓瘤初治患者(志愿者)。

通过的形态学统计各个患者的骨髓样本中骨髓浆细胞占骨髓有核细胞的数量百分 比，发现骨髓浆细胞数与MAGE-C2/CT10基因的mRNA表达水平显著正相关(P＜0.01， r＝0.30)。通过流式细胞仪检测统计各个患者的骨髓样本中CD38+/CD138+浆细胞占骨 髓有核细胞的数量百分比，显示骨髓中CD38+/CD138+细胞和MAGE-C2/CT10基因mRNA 水平显著正相关(P＜0.01，r＝0.33)。结果见图3。

实施例7、MAGE-C2/CT10基因的表达量与患者病程的相关性

对若干多发性骨髓瘤患者(志愿者)治疗前后获得的107份骨髓样本进行分析。 根据疗效，分为治疗有效组和治疗无效组。治疗有效组包括完全缓解(CR)，未完全缓 解(nCR)或部分缓解(PR)的患者。治疗无效组，包括复发或疾病进展的患者。方法 同实施例4的步骤三。结果见表4。

表4治疗有效患者组和治疗无效患者组中MAGE-C2/CT10基因表达水平的变化

注：n值为样本量，p值为治疗前、治疗后组各基因表达水平的检验值。

结果表明，在个体患者的骨髓跟踪样本中MAGE-C2/CT10基因表达水平的变化趋势 与该患者的临床病程一致。初治患者随着治疗介入获得完全缓解(CR)或部分缓解(PR) 时，上述MAGE-C2/CT10基因表达水平下降。而治疗无效的患者，MAGE-C2/CT10基因 稳定高表达，复发或疾病进展时，基因表达水平升高。

实施例8、MAGE-C2/CT10基因的表达量与患者生存时间的相关性

检测75例多发性骨髓瘤患者(志愿者)骨髓中MAGE-C2/CT10基因的表达量和患 者生存时间的关系。方法同实施例4的步骤三。结果见图4。

MAGE-C2/CT10基因的相对表达水平大于1％的患者的生存时间限制少于 MAGE-C2/CT10基因的相对表达水平小于1％的患者。