蝗虫微孢子虫株系及其在防治蝗虫中的应用

摘要

本发明公开了一种蝗虫微孢子虫株系及其在防治蝗虫中的应用。本发明提供的将蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)，命名为AL2008L-04株系，是从田间患病的东亚飞蝗中分离筛选得到的，已于2011年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No.4901。蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)AL2008L-04株系CGMCC No.4901简称AL2008L-04株系。本发明提供的蝗虫防治剂可用于防治草原蝗虫、飞蝗等多种蝗虫。该产品属于生物农药，对环境和人、畜、禽无毒害作用，对天敌安全，应用前景广阔。本发明对于提高我国蝗虫防治技术水平具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蝗虫微孢子虫株系及其在防治蝗虫中的应用。

背景技术

蝗虫灾害与水、旱灾常交替发生，一直是严重威胁我国农业生产、影响人民生活 的三大自然灾害。我国已记录的蝗虫600多种，其中对农、林、牧业可造成危害的约 60余种。

目前防治蝗虫的方法主要是采用化学农药防治，尽管化学防治可以迅速压低蝗虫 的虫口密度，但是往往造成污染环境、杀伤大量有益动物、人畜中毒和害虫产生抗药 性等不良后果等。

生物农药治蝗不但可以有效控制蝗害，而且不杀伤天敌、对环境友好、对人畜安 全，具有十分广阔的应用前景。已有关于利用绿僵菌防治蝗虫的技术，但是因其生产 成本高、保存期短、使用的环境条件要求苛刻、对有些生物不安全等，而限制了使用 范围。

蝗虫微孢子虫是蝗虫的专性寄生原生动物，只对蝗虫等直翅目昆虫有致病性，因 此十分安全。而且该病原物在田间使用过程受环境条件的限制较小、生产成本低，因 此很有竞争性。但是，蝗虫微孢子虫的致病力一般较弱，因此提高蝗虫微孢子虫的毒 力十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种蝗虫微孢子虫株系及其在防治蝗虫中的应用。

本发明提供的将蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)，命名为AL2008L-04株 系，是从田间患病的东亚飞蝗中分离筛选得到的，已于2011年5月23日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No.4901。蝗虫微孢子虫(Antonospora  locustae)AL2008L-04株系CGMCC No.4901简称AL2008L-04株系。

本发明还提供了一种制备蝗虫防治剂的活性成分的方法，包括如下步骤：

(1)将涂有所述AL2008L-04株系的孢子液的植物叶片饲喂蝗蝻；

(2)改用正常植物叶片饲喂直至死亡；

(3)取死亡虫体中的所述AL2008L-04株系的孢子，即为蝗虫防治剂的活性成分。

步骤(1)中，所述孢子液与所述植物叶片的质量比具体可为1∶1。

步骤(1)中，所述孢子液的浓度具体可为1×10⁶孢子/毫升。

步骤(1)中，用所述植物叶片饲喂所述蝗蝻的时间具体可为2天。

步骤(1)中，用所述植物叶片饲喂所述蝗蝻的饲喂条件具体可为：25-32℃，相 对湿度60-70％，光照时间16小时/天(光源为白炽灯)，每天饲喂2次。

步骤(1)和/或步骤(2)中，所述植物具体可为玉米和/或小麦。

步骤(3)中，具体可通过如下方法取所述死亡虫体中的所述AL2008L-04株系的 孢子：将所述死亡虫体研磨、再用120目的网筛过滤；将所有过滤得到的组织液用等 体积的水(最好为蒸馏水)稀释后，进行如下差速离心：500-1000转/分钟离心15 分钟取上清，将上清液3000转/分钟离心30分钟取沉淀，即为所述AL2008L-04株系 的孢子。

所述蝗蝻具体可为4龄蝗蝻。所述4龄蝗蝻具体通过如下方法得到：将蝗虫(如 东亚飞蝗)的卵在28-30℃条件下孵化，在28-32℃，相对湿度60-70％条件下每天饲 喂植物叶片，饲养至4龄蝗蝻。所述植物具体可为玉米和/或小麦。

以上任一所述方法制备得到的活性成分也属于本发明的保护范围。

本发明还保护含有所述活性成分的蝗虫防治剂。每毫克蝗虫防治剂中具体可含有 10⁷个所述AL2008L-04株系的孢子。所述蝗虫防治剂具体可由所述活性成分、吐温-80、 蔗糖和水组成；所述蝗虫防治剂中，所述AL2008L-04株系的孢子的浓度具体可为10⁷孢子/毫升，吐温-80的质量百分含量具体可为4％，蔗糖的质量百分含量具体可为3％。 所述蝗虫防治剂在应用时采用喷雾，喷雾可以一次也可多次。

本发明提供的蝗虫防治剂可用于防治草原蝗虫、飞蝗等多种蝗虫。该产品属于生 物农药，对环境和人、畜、禽无毒害作用，对天敌安全，应用前景广阔。本发明对于 提高我国蝗虫防治技术水平具有重要意义。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

实施例1、蝗虫微孢子虫AL2008-01株系的获得

将田间采集的患病的东亚飞蝗，研磨、过滤、镜检，之后离心纯化，从虫体分离 得到不同株系的野生蝗虫微孢子虫。将各个野生蝗虫微孢子虫株系以一系列的浓度涂 抹在玉米叶片上，之后喂饲东亚飞蝗4龄蝗蝻2天，收获死亡较早的虫体，经过研磨、 过滤、离心等，得到纯化的蝗虫微孢子虫。连续筛选30代，得到蝗虫微孢子虫 (Antonospora locustae)AL2008L-04株系。

在光学显微镜(400倍)可见AL2008L-04株系的孢子呈卵圆形，大小为(6.13 ±1.37)μm×(3.17±0.53)μm，比已有的株系(5.40±0.50)μm×(3.11±0.37) μm略大。

2011年5月23日将蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)AL2008L-04株系保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.4901。蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)AL2008L-04株系CGMCC No.4901 简称AL2008L-04株系。

实施例2、AL2008-01株系的致病性鉴定

实施例中的玉米叶片均可用小麦叶片代替。

一、AL2008-01株系的孢子的制备

1、将东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)的卵在28-30℃条件下孵化， 在28-32℃，相对湿度60-70％条件下每天饲喂新鲜玉米叶片，饲养至4龄蝗蝻。

2、将AL2008L-04株系的孢子液(1×10⁶孢子/毫升)涂抹在新鲜玉米叶片上， 玉米叶片与孢子液的质量比为1∶1，用于饲喂4龄蝗蝻，连续饲喂2天，之后用新鲜 玉米叶正常饲养直至蝗虫死亡；饲养条件：温度保持在25-32℃，相对湿度保持在60％ 左右，光照时间16小时/天(光源为白炽灯)，每天饲喂玉米叶片2次。

3、将死亡后的蝗虫虫体研磨、再用120目的网筛过滤；将所有过滤得到的组织 液用等体积的蒸馏水稀释后，进行如下差速离心：第一次1000转/分钟(500-1000 转/分钟均可)离心15分钟，取上清；之后再将上清液3000转/分钟的离心30分钟 取沉淀)，即为AL2008L-04株系的孢子。

二、AL2008-01株系的致病性鉴定

(一)AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LD₅₀

1、将东亚飞蝗的卵在28-30℃条件下孵化，在28-32℃，相对湿度60-70％条件下 每天饲喂新鲜玉米叶(玉米叶也可用小麦叶代替)，饲养至3龄蝗蝻。

2、将不同浓度的AL2008L-04株系的孢子液涂抹在新鲜玉米叶片上，玉米叶片与 孢子液的质量比为1∶1，用于饲喂3龄蝗蝻，连续饲喂2天，之后用新鲜玉米叶正常 饲养26天，统计死亡率，计算AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LD₅₀(半数致 死量)；饲养条件：温度保持在25-32℃，相对湿度保持在60％左右，光照时间16小 时/天，每天饲喂玉米叶2次。

AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LD₅₀(半数致死量)为2.5×10⁶个孢子/ 克3龄蝗蝻。

(二)AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LT₅₀

1、将东亚飞蝗的卵在28-30℃条件下孵化，在28-32℃，相对湿度60-70％条件下 每天饲喂新鲜玉米叶(玉米叶也可用小麦叶代替)，饲养至3龄蝗蝻。

2、将AL2008L-04株系的孢子液涂抹在新鲜玉米叶片上，玉米叶片与孢子液的质 量比为1∶1，用于饲喂3龄蝗蝻，连续饲喂2天，饲喂剂量为5×10⁶个孢子/克3龄 蝗蝻；之后用新鲜玉米叶正常饲养直至蝗虫死亡，统计死亡率，计算AL2008L-04株 系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LT₅₀(半数致死时间)；饲养条件：温度保持在25-32℃，相 对湿度保持在60％左右，光照时间16小时/天，每天饲喂玉米叶2次。

在5×10⁶个孢子/克3龄蝗蝻的剂量下：AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的 LT₅₀(半数致死时间)为17天。

步骤(一)和步骤(二)的结果表明，AL2008-01株系具有良好的致病力。

实施例3、制剂的制备及其应用

一、用AL2008-01株系制备制剂

用实施例2的步骤一制备的AL2008L-04株系的孢子、吐温-80、蔗糖和水制备可 溶性悬浮剂，AL2008L-04株系的孢子的浓度为10⁷孢子/毫升，吐温-80的质量百分含 量为4％，蔗糖的质量百分含量为3％。

二、制剂的应用

分别在河北、山东、河南、安徽、海南、内蒙古、新疆、甘肃、青海、辽宁、广 西、广东、山西、陕西进行大田试验，方法如下：

将步骤一制备的可溶性悬浮剂在蝗虫处于2龄盛发期时进行大田喷雾(设置至少 三个重复，每个重复的面积至少为1公顷大田)，每公顷使用3000毫升制剂，作为实 验组；设置不采用制剂进行喷雾的大田作为平行对照(设置至少三个重复，每个重复 至少为1公顷大田)，即对照组；喷雾后第20天统计进行喷雾的实验组大田和对照组 大田中的蝗虫数量，实验组大田和对照组大田各设置30个调查样点，每个调查样点 大小为1平方米，实验组和对照组的蝗虫数量均取30个调查样点的平均值。蝗虫的 死亡率＝(对照组的蝗虫数量-实验组的蝗虫数量)/对照组的蝗虫数量*100％。结果见 表1。

表1各个地域的大田试验蝗虫的死亡率

  地区   蝗虫的死亡率   地区   蝗虫的死亡率   河北   81％   山东   78％   河南   73％   安徽   77％   海南   80％   内蒙古   72％   新疆   73％   甘肃   70％   青海   73％   辽宁   76％   广西   76％   广东   82％   山西   73％   陕西   71％

各个地区采用步骤一制备的制剂喷雾后，蝗虫死亡率均达70％以上。