原伊鲁烷型倍半萜酯类及其用途

摘要

本发明揭示了由蜜环菌的菌丝所纯化出的新的原伊鲁烷型倍半萜酯类，及其应用在治疗肿瘤或增生性疾病如乳癌、肺癌、结肠癌或白血病的用途。

说明书

技术领域

本发明是有关于药学领域，且特别是有关于从蜜环菌(Armillaria  mellea)的菌丝纯化原伊鲁烷型倍半萜酯类的方法及其治疗药。

背景技术

属于白磨科(Tricholomataceae)真菌的蜜环菌(Armillaria mellea (Vahl.ex Fr.))是为医药用菌类，其与中药的天麻共生(Gastrodia  elata Blume)。蜜环菌的子实体已经运用在传统中药中，其可用来治疗 高血压、头痛、失眠、头晕以及晕眩。

蜜环菌的菌丝可分离出具有保护脑活性的分子N⁶-(5-羟基-2-吡啶 基甲氨)-9-β-D-呋喃核糖嘌呤 (N⁶-(5-hydroxy-2-pyridylmethylamino)-9-β-D- ribofuranosylpurine)(Lee et al.，(1998)Chinese Journal of  Medicinal Chemistry 8(2)：116；Junhuaet al.，(1990)Fitoterapia  61：207-214；以及Watanabe et al.，(1990)Planta Med 56：48-52)。 先前的化学研究中，已鉴定出蜜环菌的菌丝的多数倍半萜的芳香酯具有 原伊鲁烷型的结构(Watanabe et al.，supra；Yang et al.，(1984) Planta Med 50：288-290；Yang et al.，(1989)Planta Med 55：479-481； Yang et al.，(1989)Planta Med 55：564-565；Obuchi et al.，(1989) Planta Med 56：198-201；以及Yang et al.，(1991)Planta Med 57： 478-480)。部分的倍半萜也已证实对革兰氏阳性细菌和菌类(Yeast)具 有抗菌效果(Obuchi et al.，supra)。

由于可利用液态培养基，以人工大量培养蜜环菌的菌丝，所以上述 的倍半萜可大量地生产。本发明解决从蜜环菌的菌丝中纯化具有疗效的 倍半萜的方法。总共鉴定出17个活性化合物，其中的7个化合物为新 的，且7个化合物皆可成为抗血管生成剂中的有潜力的新化合物。

发明内容

下列将广泛地讨论本发明的实施方式。本发明揭示了纯化蜜环菌的 菌丝的原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯及其抗血管生成剂的用途。藉由重 复地使用液相色谱分析(Liquid chromatography)法纯化蜜环菌的菌丝， 共可得17个活性化合物，其中的7个化合物(mellendonal B、melleolide  N、melleolide Q、melleolide P、melleolide R、melleolide S及 melleolide T)是为新颖的化合物，其余的化合物皆为已知。17个化合 物也陆续地确认出具有抗血管生成活性，且因此其可成为抗血管生成 剂中有潜力的新化合物。

因此，本发明一方面揭示了纯化原伊鲁烷型倍半萜酯类的方法。方 法包括以醇类溶剂萃取蜜环菌的菌丝，以得有机溶剂萃取液；以乙酸乙 酯与水的混合溶液重新分配该有机溶剂萃取液，以得一乙酸乙酯层及和 一水溶液层；以高效液相色谱分析(HPLC)分离该乙酸乙酯层，以得一原 伊鲁烷型倍半萜酯类，HPLC是使用一正己烷与乙酸乙酯的混合溶液，其 比例约20∶1-0∶1。

在一实施方式中，上述醇类溶剂为乙醇。

由上述纯化方法所得的原伊鲁烷型倍半萜酯类的化学式为下面化 学式之一：

纯化出的原伊鲁烷型倍半萜酯类中，其中新的化合物为 mellendonal B、melleolide N、melleolide Q、melleolide P、melleolide  R、melleolide S以及melleolide T。

因此，本发明另一方面揭示了有关于医药用治疗增生性疾病如肿瘤 的药物组合物。药物组合物包括有效治疗剂量的原伊鲁烷型倍半萜酯类 以及医药上可接受的赋型剂。其中，原伊鲁烷型倍半萜酯类具有抗血管 生成活性以及缩小肿瘤(tumor)的效用。在部分的实施方式中，组成物 更包括一化学药物，其是选自由5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)、长春碱 (vinblastin)、阿霉素(doxorubicin)以及顺铂(cisplatin)所组成的群 组。

因此，本发明又一方面揭示了治疗增生性疾病如肿瘤的方法。上述 方法包括施予受体有效剂量的原伊鲁烷型倍半萜酯类。其中，纯化原伊 鲁烷型倍半萜酯类的方法如上所述，且其化合物具有抗血管生成活性以 及具有缩小肿瘤的功效。

在部分的实施方式中，肿瘤或增生性疾病可为乳癌、肺癌、结肠癌 或白血病。

上述发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭 示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其 用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。 在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻 易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手 段与实施方式。

附图说明

为让本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂， 所附图式的说明如下。

图1显示了本发明的一实施方式的一种化合物CH-205对内皮细胞 的迁移活性的伤口愈合试验。

图2A和图2B显示了本发明的一实施方式的一种化合物CH-205-O 活性对H460人类肺癌异种移植肿瘤的影响。

图3显示了本发明的一实施方式的一种化合物CH-205-O活性对 H460人类肺癌异种移植肿瘤的肿瘤抑制速率。

图4A和图4B显示了本发明的一实施方式的一种化合物CH-205-K 活性对H460人类肺癌肿瘤异种移植的影响。

图5显示了本发明的一实施方式的一种化合物CH-205-K活性对 H460人类肺癌异种移植肿瘤的肿瘤抑制速率。

具体实施方式

下列将详细说明本发明的实施方式，且是有关于从蜜环菌纯化原伊 鲁烷型倍半萜酯类的方法及其治疗用途。

首先，萃取蜜环菌的菌丝，以得有机溶剂萃取液。萃取方法是为任 何熟知此技术领域的方法，溶剂是使用适合的有机溶剂。有机溶剂包括， 但不限制于醇类(如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇)、酯类(如乙酸乙酯)、 烷类(如己烷及环己烷)、烷基卤化物(如单/二氯甲烷(mono-or  di-chloromethane)、单/二氯乙烷(mono-or di-chloromethane)。较 佳的有机溶剂为醇类，更佳的有机溶剂为乙醇。

接下来，藉由乙酸乙酯与水的混合溶液来分配有机溶剂溶剂萃取 液，以制备乙酸乙酯层与水溶液层。再利用高效液相色谱分析 (high-performance liquid chromatography)纯化原伊鲁烷型倍半萜醇 芳香酸酯，将其分成多个部分。之后，藉由UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR 以及2D-NMR分析每一个部分，以确认其中的活性化合物的结构。每一 个部分的原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯皆在试管内(in vitro)进行其对 癌细胞的细胞毒性测试，以及测试化合物对内皮细胞(edothelial cell； ECs)迁移的抑制作用(inhibitory effects)测试。同时，也测体内(in  vivo)试化合物对异种移植肿瘤(xenograft tumors)的抑制生长作用。 在HPLC的纯化步骤中，是使用正己烷和乙酸乙酯的混合溶液来冲洗出 活性化合物。其中，正己烷和乙酸乙酯的混合溶液比例是约20∶1至0∶ 1(v/v)。在一实施例中，正己烷和乙酸乙酯混合物的比例约为20∶1、 5∶1、3∶1、1∶1或0∶1时，可总共自管柱中冲洗出10个小部分。在 一实施例中，正己烷与乙酸乙酯的混合物比例是约为20∶1。在另一实 施方式中，正己烷与乙酸乙酯的混合物比例是约为5∶1。在又一实施方 式中，正己烷与乙酸乙酯的混合物比例是约为3∶1。在又一实施方式中， 正己烷与乙酸乙酯的混合物比例是约为1∶1。在又一实施方式中，正己 烷与乙酸乙酯的混合物比例是约为0∶1。

根据本发明揭示的一种方法所纯化出的原伊鲁烷型倍半萜酯类，其 化学式可为下面化学式之一：

在纯化出的17个原伊鲁烷型倍半萜酯类中，化合物CH-205-G-2 (melleolide S)、CH-205-H(melleolide N)、CH-205-J(melleolide Q)、 CH-205-K(melleolide P)、CH-205-N(melleolide T)、CH-205-Q (melledonal B)以及CH-205-R(melleolide R)是为新颖的化合物，其 余为已知化合物。依据上述纯化方法所得的化合物，其皆在试管内(in  vitro)对癌细胞具有细胞毒性作用，以及其对内皮细胞迁移具有抑制作 用，亦即具有抗血管生成的活性。此外，鉴定出化合物可在体内(in vivo) 缩小异种移植肿瘤至少30％，亦如具有抑制肿瘤成长的效果。

因此，本发明的另一目的是揭示治疗增生性疾病如肿瘤的药物组合 物。组成物包含有效治疗剂量的原伊鲁烷型倍半萜酯类，以及医药上可 接受的赋型剂。其中，原伊鲁烷型倍半萜酯类是由上述的纯化方法所得， 且相较于控制组，其具有抗血管生成活性以及缩小肿瘤至少约10％，如 约10％、20％、30％、40％或50％。

纯化出的原伊鲁烷型倍半萜酯类皆被鉴定具有抗血管生成活性。

在一较佳的实施方式中，在组成物中的原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸 酯化合为melleolide K(化合物CH-205-K)。

药物组合物可更包含一化学药物是选自由5-氟脲嘧啶 (5-fluorouracil)、长春碱(vinblastin)、阿霉素(doxorubicin)以及 顺铂(cisplatin)所组成的群组。在一特定的实施方式中，上述化学药 物为顺铂(cisplatin)。在部分的实施方式中，增生性疾病是为乳癌、 肺癌、结肠癌或白血病。

在本发明的一药物组合物中，其被施予至受体的方式可为口服、注 射(如肌肉注射，腹腔注射、静脉注射、皮下注射或植入)、鼻腔用、舌 下含服、外用或经皮吸收路径，以及其可被处方(formulation)成为各 种适合施予方式的剂型。下列将讨论较佳的剂型，但并不包括所有可能 的剂型。熟知此技术领域的人士能了解不同剂型是适合不同的施予方 式。在任何情况下，合适的施予方式会依照疾病或正在接受治疗的情况 的性质或严重程度而有所不同。

由如上所述的纯化方法所得的鉴定过的原伊鲁烷型倍半萜酯类，皆 可与至少一种以上的医药可接受的赋型剂混合。

在部分的实施方式中，本发明所揭露的一药物组合物为固态口服剂 型。固态剂型可为胶囊、香包(sachets)、锭片、药丸、含片、粉末或 颗粒。在上述的剂型中，活性成份(如verapamil)可与至少一种以上的 医药上可接受的赋型剂混合。上述的任何固态剂型可选择性地包含外膜 或外壳，如包衣层，以作为调控成份释放速率的外膜。熟知此技术领域 者皆知外膜的实施方式。在一实施例中，药物组合物可为锭片，如快速 释放型锭片。在又一实施方式中，可将药物组合物配方成为缓释 (sustained release)剂型。在另一实施方式中，药物组合物可为包覆 在软或硬明胶胶囊中的粉末。

在部分的实施方式中，药物组合物可为口服液剂。液剂可更包括可 维持所需pH值的缓冲剂。填充液剂的配方可为将其填入至软明胶胶囊 中。举例来说，上述的液剂可为溶液、悬浮液(suspension)、乳剂 (emulsion)、微乳液(microemulsion)、沉淀或以任何液体介质携带原 鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯化合物。此外，上述的液剂也可包含有医药上 可接受的原鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯化合物的衍生物、盐、溶剂或上述 的组合。此类含药的乳液或分散相的液体主要用是用来提升药物释放后 的溶解度。

在部分的实施方式中，药物组合物可被处方为注射剂，其包括但不 限制于皮下注射、推注、肌肉注射、腹腔注射及静脉注射。药物组合物 可被处方为等渗透压(isotonic)的悬浮液、溶液或是以油或水相为载体 的乳液，并可包含配方用剂(formulatoary agents)，如悬浮剂、稳定 剂或分散剂。另外，药物组合物可为干式粉末、结晶物或冻干的固体。 在服用之前，固态组合物可与已消毒无热原(pyrogen-free)的水或等渗 透压(isotonic)的盐水混合，且其可被装置在已消毒的安瓶或瓶子内。

在部分的实施方式中，本发明所揭示的药物组合物可被配方为鼻内 用剂型或吸入用剂型。药物组合物可为溶液或悬浮液，其可装入至压喷 式的容器内。药物组合物也可为干粉形式，其可与推进剂装入至加压容 器或喷雾器内。推进剂可为二氯二氟甲烷(dichlorodifluoromethane)、 三氯氟甲烷(trichlorofluoromethane)、二氯四氟乙烷 (dichlorotetrafluoromethane)、氢氟烷(如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A^TM)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA^TM))、二氧化碳或其它适 合的气体。就加压喷雾而言，喷压阀可决定剂量单位。本发明揭示的组 成物可被配方成为溶液或悬浮液，使其可装置在加压容器或喷雾器内。 活性化合物可被配方成为粉末混合物，使其可装入吸入用或吹入的胶囊 或药桶(cartridges)内。

在部分的实施方式中，本发明揭示的药物组合物可配方成适用于外 用或经皮吸收剂型。配方可为喷剂、药膏、贴料、乳霜、溶液、凝胶、 溶液及皮肤药贴。配方也可选择性地包括赋型剂，其可为动物及植物脂 肪、油脂、蜡、石蜡、淀粉、树液(tragacanth)、细胞萃取物、硅酮 (silicons)、膨润土(bentonites)、硅酸(silicic acid)，滑石粉(talc)、 氧化锌或上述的组合。喷剂也可含有赋型剂，如滑石、硅酸、氢氧化铝 或硅酸钙。此外，喷剂也可含有推进剂。推进剂可为氯氟碳氢化合物 (chlorofluoro-hydrocarbons)及挥发性碳氢化合物，例如丁烷及丙烷。 药物组合物可溶解、分散或整合于适当的介质中，以作为皮肤药贴布， 其中介质可为弹性基材。此外，也可加入吸收促进剂至上述的剂型中， 以增加混合物穿透皮肤的量。另外，可配方组成物成为乳液或乳霜。

本发明的另一方面揭示了有关于治疗增生性疾病(如肿瘤)的方法。 上述的治疗方法包括施予受体有效治疗剂量的原伊鲁烷型倍半萜酯类。 其中，原伊鲁烷型倍半萜酯类是由上述的纯化方法所得，且化合物具有 抗血管生成活性以及具有缩小肿瘤至少30％的功效。

肿瘤或增生性疾病可为乳癌、肺癌、结肠癌或白血病。在一实施例 中，蜜环菌乙素(armillaridin；化合物CH-205-O)是用来治疗此类疾病。 在另一实施方式中，蜜环菌乙素(化合物CH-205-O)与一化学药物并用， 上述的化学药物是选自由5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)、长春碱 (vinblastin)、阿霉素(doxorubicin)以及顺铂(cisplatin)所组成的群 组。

下列将详细的叙述本发明的实施方式。

实施例

细胞培养

在标准培养条件下培养内皮细胞(人类内皮样细胞；Eahy926)以及4 种癌细胞株(MCF-7、H460、HT-29及CEM)，其细胞来自于美国标准生物 品收藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)。细胞培养液 为DMEM或RPMI(来自于Life Technologies)，并供给2mM左旋-谷酰 氨酸(L-glutamine)和10％热失活小牛血清(fetal bovine serum；FBS) (来自于Life Technologies)。使用甲苯胺蓝排除试验(Trypan Blue  dye-exclusion)来决定细胞数目与存活率。

高效液相色谱分析(HPLC)

高效液相色谱分析的配备为HP/Agilent既1100UV分光光度计。 在室温下原料是由Cosmosil 5C-18 MS-II(5μm，10×250mm)管柱所 纯化，且在此纯化的过程中使用四种流动相(A-D)，其分别地列示在表 一中。

表一

统计分析

使用Student’s t test进行统计分析。数据是以平均±标准误差 (mean±SEM)表示。统计显著性(Statistical significance)定义为 P＜0.05。

实施例1萃取以及鉴定蜜环菌的原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯

1.1萃取以及纯化蜜环菌的原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯

使用95％乙醇萃取9kg蜜环菌的菌丝(CH-205)三次。浓缩95％乙醇 的可溶解部分，以得到乙醇萃取液。再藉由乙酸乙酯与水的混合溶液来 分配(partition)乙醇萃取液。使用硅胶管柱色谱分析乙酸乙酯层，再 用正己烷-乙酸乙酯(20∶1→0∶1)冲洗出10个部分(Fr-1-Fr-10)。 接下来，将Fr-3(正己烷/乙酸乙酯＝5∶1)以甲醇结晶，以得到 CH-205-A(114mg)。再利用半制备式反相HPLC(Condition A)纯化Fr-4 (正己烷/乙酸乙酯＝5∶1)，以得到3种化合物，其分别为CH-205-O-1 (Rt＝17.14分钟)、CH-205-O(Rt＝18.53分钟)和CH-205-O-2(Rt＝23.97 分钟)。接下来，再重复地使用硅胶以及Sephadex LH-20管柱色谱分析 Fr-6(正己烷/乙酸乙酯＝3∶1)，以得到化合物CH-205-6-4-D(120mg) 以及2个次部分(Fr-6-1及Fr-6-2)。再次地使用半制备式反相HPLC (Condition B)纯化Fr-6-1，以得到2个化合物CH-205-6-4-B-1 (Rt＝25.28分钟)及CH-205-6-4-B-2(Rt＝30.48分钟)。且重复地使用硅 胶以及Sephadex LH-20管柱色谱分析Fr-7(正己烷/乙酸乙酯＝1∶1)， 以得到5个化合物，其为CH-205-P(675.5mg)、CH-205-N(42.9mg)、 CH-205-K(57.7mg)、CH-205-L以及CH-205-L-1。重复地使用硅胶以 及Sephadex LH-20管柱色谱分析Fr-8(正己烷/乙酸乙酯＝1∶1)，以得 到3个化合物，其为CH-205-U(538mg)、CH-205-V(185.2mg)以及 CH-205-W(47.9mg)。重复地使用硅胶、Sephadex LH-20和RP-18管柱 色谱分析Fr-9(正己烷/乙酸乙酯＝0∶1)，以得到6个化合物，其为 CH-205-C(12.6mg)、CH-205-D(16.2mg)、CH-205-J(35.7mg)、 CH-205-E(3.504g)、CH-205-H(100.7mg)以及CH-205-I(54.2mg) 以及1个次部分Fr-9-1。再纯化Fr-9-1使用RP-18管柱[H₂O∶甲醇(2∶ 8)]，以得到2个化合物，其为CH-205-G-1(5.5mg)和CH-205-G-2(46.3 mg)，以及1个次部分Fr-9-1-1。再更进一步地使用半制备式反相HPLC (Condition C)纯化次部分Fr-9-1-1，以得到2个化合物，其为 CH-205-G-3-1(Rt＝29.79分钟、8.8mg)以及CH-205-G-3-2(Rt＝31.95 分钟、69.6mg)。再重复地使用硅胶、Sephadex LH-20以及RP-18管 柱色谱分析Fr-10(正己烷/乙酸乙酯＝0∶1)，以得到3个化合物，其为 CH-205-R(595.1mg)、CH-205-Q(118.4mg)及CH-205-T(308.7mg) 以及1个次部分Fr-10-1。再次地使用半制备式反相HPLC(Condition D) 纯化Fr-10-1，以得到2个化合物CH-205-S-1(Rt＝32.34分钟、17.3 mg)和CH-205-S-2(Rt＝34.76分钟、22.7mg)。

1.2鉴定实施例1.1的已纯化的化合物

经由上述实施例1.1的纯化步骤，总共可得28个化合物。利用光 谱分析上述化合物，光谱分析包括UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR以及 2D-NMR分析。化合物中的17个化合物中，其中的7个化合物为新的化 合物，其各为CH-205-G-2(S；melleolide S)、CH-205-H(melleolide  N)、CH-205-J(melleolide Q)、CH-205-K(melleolide P)、CH-205-N (melleolide T)、CH-205-Q(melledonal B)及CH-205-R(melleolide  R)，其余的皆为已知的化合物。

下列将详细的提供17个化合物光谱分析资料：

CH-205-H(melleolide N)

((2R，2aS，4aS，7aS，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-2，2a-二羟 基-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-3-基)甲基3-氯-4，6-二羟基-2-甲基 苯甲酸

((2R，2aS，4aS，7aS，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahydro-2，2a- dihydroxy-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-3-yl)methyl 3-chloro-4，6-dihydroxy-2-methylbenzoate

无色固体，熔点148-149℃；[α]₂₅-25°(c 1.0、MeOH)；

UV(MeOH)λmax(logε)307(3.65)、261(3.91)、213(4.45)nm；

IR(KBr)_max3528，1631，1592，1461，1425，1310、1243，1128， 1081cm^-1；

¹H NMR(acetone-d₆，500MHz)δ0.97(3H，s，CH₃-14 or CH₃-15)、 0.98(3H，s，CH₃-15 or CH₃-14)、1.16(3H，s，CH₃-8)、1.34-1.49(4H， m，H-6，H₂-10、and H-12)、1.76(1H，dd，J＝8.5，10.5Hz，H-6)、 1.84(1H，dd，J＝8.5，13.0Hz，H-12)、2.15(1H，m，H-9)、2.63(3H， s，CH₃-8’)、2.75(1H，m，H-13)、4.35(1H，dd，J＝8.5，15.0Hz，H-5)、 4.95(1H，d，J＝12.5Hz，H-1)、5.08(1H，d，J＝12.8Hz，H-1)、5.88 (1H，br s，H-3)、6.44(1H，s，H-4’)、10.76(1H，s，OH-3’)；

¹³C NMR(acetone-d₆，500MHz)δ19.7(CH₃-8’)、22.3(CH₃-8)、 32.1(CH₃-14 or CH₃-15)、32.3(CH₃-15 or CH₃-14)、36.4(C-6)、38.0 (C-7)、38.5(C-11)、40.2(C-13)、42.3(C-10)、45.4(C-9)、48.3 (C-12)、67.8(C-1)、76.9(C-5)、78.1(C-4)、102.7(C-4’)、109.1 (C-2’)、114.7(C-6’)、132.0(C-2)、136.1(C-3)、140.4(C-7’)、 158.2(C-3’)、161.8(C-5’)、170.5(C-1’)；

ESIMS m/z(％)：459[M+Na]⁺；以及

HRFAB m/z 437.1732(calcd 437.1731 for C₂₃H₃₀O₆Cl)。

CH-205-J(melleolide Q)

(2R，4S，4aR，7aS，7bR)-2，4，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-4-羟基-3-(羟 甲基)-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2- 甲基苯甲酸

(2R，4S，4aR，7aS，7bR)-2，4，4a，5，6，7，7a，7b-octahydro-4-hydrox y-3-(hydroxymethyl)-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-y l)3-chloro-6-hydroxy-4-methoxy-2-methylbenzoate

无色固体，熔点；[α]₂₅-112°(c 1.0、MeOH)；

UV(MeOH))λmax(logε)305(3.52)、267(4.07)、213(4.42)nm；

IR(KBr)_max3528，1647，1603，1556，1461，1401，1267，1215，1108 cm^-1；

¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ0.94(3H，s，CH₃-15)、0.99(3H，s， CH₃-8)、1.03(3H，s，CH₃-14)、1.14(1H，t，J＝9.5Hz，H-12)、1.1.29 (1H，m，H-10)、1.41(1H，dd，J＝7.5，12.5Hz，H-12)、1.79(1H， dd，J＝7.0、11.5Hz，H-12)、1.93(1H，dd，J＝6.5，11.5Hz，H-6)、 2.26(2H，m，H-9及H-13)、2.50(3H，s，CH₃-8’)、2.60(1H，m，H-6)、 3.89(3H，s，OCH₃-5’)、4.17(1H，dd，J＝2.0、8.0Hz，H-3)、4.30 (2H，dd，J＝12.0、25.0Hz，H-1)、5.97(1H，t，J＝9.0Hz，H-5)、 6.36(1H，s，H-4’)、12.06(1H，s，OH-3’)；

¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)δ21.1(CH₃-8)、24.6(CH₃-8’)、26.9 (CH₃-14)、29.5(CH₃-15)、38.8(C-7)、40.1(C-11)、40.8(C-10)、 46.2(C-12)、46.5(C-6)、47.3(C-9)、49.9(C-13)、56.2(OCH₃-5’)、 58.9(C-1)、70.6(C-5)、74.5(C-3)、106.3(C-2’)、106.6(C-4’)、 107.3(C-6’)、133.6(C-2)、141.4(C-7’)、142.4(C-4)、158.9 (C-5’)、159.8(C-3’)、170.6(C-1’)；and

ESIMS m/z(％)：475(30)、473[M+Na]⁺(100).

CH-205-G-2(melleolide S)

((2R，2aR，3R，4S，4aR，7aS，7bR)-decahydro-2，2a，4-tri羟基 -6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-3-基)甲基3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2- 甲基苯甲酸

((2R，2aR，3R，4S，4aR，7aS，7bR)-decahydro-2，2a，4-trihydroxy-6 ，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-3-yl)methyl 3-chloro-6-hydroxy-4-methoxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(acetone-d₆，500MHz)δ0.98(3H，s，CH₃-15)、1.07(3H， s，CH₃-8)、1.10(3H，s，CH₃-14)、1.45(2H，m，H₂-10)、1.53(3H， m，H-6，and，H₂-12)、1.72(1H，t，J＝8.5Hz，H-6)、1.96(1H，m，H-13)、 2.08(1H，m，H-9)、2.40(1H，m，H-2)、2.58(3H，s，CH₃-8`)、3.78 (1H，t，J＝11.0Hz，H-3)、4.20(1H，t，J＝8.5Hz，H-5)、4.72(2H， m，H₂-1)、6.46(1H，s，H-4’)：

¹³C NMR(acetone-d₆，125MHz)δ18.9(C-8`)、22.5(C-8)、32.4 (C-15)、32.7(C-14)、36.6(C-11)、36.9(C-6)、37.6(C-7)、43.5 (C-12)、43.7(C-2)、44.6(C-10)、47.8(C-13)、48.2(C-9)、56.6 (OCH<sub>3</sub>-5`)、66.1(C-1)、68.6(C-3)、73.4(C-5)、81.7(C-4)、99.6 (C-4`)、110.3(C-2`)、115.2(C-6`)、139.8(C-7`)、159.3(C-5`)、 160.8(C-3`)、169.0(C-5`)

FAB m/z(％)：469[M+H]⁺；HRFAB m/z 469.1991(calcd 469.1991 for C₂₄H₃₄O₇Cl).

CH-205-N(melleolide T)

((2R，2aS，4aR，7aR，7bR)-3-醛基-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢 -2a，4a-二羟基-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-4，6-二羟基 -2-甲基苯甲酸

((2R，2aS，4aR，7aR，7bR)-3-formyl-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahy dro-2a，4a-dihydroxy-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-y l)3-chloro-4，6-dihydroxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ0.93(3H，s，CH₃-14)、1.12(3H，s， CH₃-15)、1.25(1H，d，J＝13.5Hz，H-10)、1.28(3H，s，CH₃-8)、1.67 (1H，dd，J＝7.0；13.5Hz，H-10)、1.92(2H，br，s，H₂-12)、2.01(1H， dd，J＝8.5，11.5Hz，H-6)、2.28(2H，m，H-6及H-9)、2.43(3H，s， CH₃-8)、5.56(1H，t，J＝8.5Hz，H-5`)、6.49(1H，s，H-4`)、6.70(1H， s，H-3)、9.53(1H，s，H-1)、11.09(1H，br，s，OH-3’)：

¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)δ20.0(C-8`)、21.4(C-8)、30.8(C-14)、 30.9(C-15)、31.7(C-6)、34.6(C-7)、37.6(C-11)、43.2(C-10)、 50.3(C-9)、58.2(C-12)、75.2(C-13)、75.3(C-5)、77.8(C-4)、 102.1(C-4`)、107.1(C-2`)、113.8(C-6`)、136.8(C-2)、139.0(C-7`)、 153.1(C-3)、156.0(C-5`)、162.7(C-3`)、169.9(C-1`)、196.2(C-1)

ESIMS m/z(％)：475(35)、473[M+Na]⁺(100).

CH-205-R(melleolide R)

((2R，2aR，3R，4S，4aR，7aS，7bR)-decahydro-2a，4-二羟基-3-(羟甲 基)-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-4，6-二羟基-2-甲基苯 甲酸

((2R，2aR，3R，4S，4aR，7aS，7bR)-decahydro-2a，4-dihydroxy-3-(h ydroxymethyl)-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-yl) 3-chloro-4，6-dihydroxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(acetone-d₆，500MHz)δ0.98(3H，s，CH₃-15)、1.09(3H， s，CH₃-14)、1.16(3H，s，CH₃-8)、1.44(2H，m，H₂-10)、1.51(1H，dd， J＝7.6，14.0Hz，H-12)、1.85(1H，m，H-6)、1.96(2H，m，H-6及H-12)、 2.07(1H，m，H-2)、2.10-2.20(2H，m，H-9及H-13)、2.61(3H，s， CH₃-8`)、3.73(1H，t，J＝11.2Hz，H-3)、3.90(1H，dd，J＝5.2，10.8 Hz，H-1)、4.03(1H，dd，J＝4.0，11.2Hz，H-1)、5.33(1H，t，J＝8.4 Hz s，H-5)、6.44(1H，s，H-4`)

¹³C NMR(acetone-d₆，125MHz)δ19.9(C-8`)、22.3(C-8)、32.4 (C-15)、32.7(C-14)、34.4(C-6)、36.7(C-7)、39.0(C-11)、43.4 (C-12)、44.4(C-10)、46.3(C-13)、47.4(C-2)、48.0(C-9)、62.8 (C-1`)、68.9(C-3)、77.1(C-5)、81.3(C-4)、102.4(C-4`)、108.3 (C-2`)、114.7(C-6`)、140.2(C-7`)、158.4(C-5`)、162.2(C-3`)、 171.0(C-1`)

ESIMS m/z(％)：479(30)、477[M+Na]⁺(100).

CH-205-K(melleolide P)

((2R，2aS，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-2a-羟基-3-(羟甲 基)-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-4，6-二羟基-2-甲基苯 甲酸

((2R，2aS，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahydro-2a-hydroxy-3- (hydroxymethyl)-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-yl) 3-chloro-4，6-dihydroxy-2-methylbenzoate

无色固体；熔点68-69℃；[α]₂₅ 28°(c 1.0、MeOH)；

UV(MeOH)λmax(logε)311(3.72)、263(3.91)、212(4.42)nm；

IR(KBr)_max3530、1655，1611，1445，1382，1318，1239，1124cm^-1；

¹H NMR(acetone-d₆，500MHz)δ1.00(3H，s，CH₃-14 or CH₃-15)、 1.01(3H，s，CH₃-15 or CH₃-14)、1.29(3H，s，CH₃-8)、1.40-1.44(2H， m，H₂-10)、1.50(1H，m，H-12)、1.68(1H，m，H-6)、1.86(1H，m，H-12)、 1.99(1H，m，H-6)、2.20(1H，m，H-9)、2.51(3H，s，CH₃-8’)、2.78 (1H，t，J＝7.5Hz，H-13)、4.08(1H，d，J＝12.5Hz，H-1)、4.36(1H， d，J＝12.5Hz，H-1)、5.55(1H，t，J＝9.0Hz，H-5)、5.78(1H，br s， H-3)、6.45(1H，s，H-4’)、10.75(1H，s，OH-3’)；

¹³C NMR(acetone-d₆，125MHz)δ19.6(CH₃-8’)、22.1(CH₃-8)、 32.2(CH₃-14 or CH₃-15)、32.3(CH₃-15 or CH₃-14)、33.8(C-6)、39.6 (C-7)、38.4(C-11)、39.9(C-13)、42.0(C-10)、45.4(C-9)、48.4 (C-12)、65.3(C-1)、77.3(C-4)、80.2(C-5)、102.5(C-4’)、108.2 (C-2’)、114.9(C-6’)、132.9(C-3)、135.2(C-2)、140.3(C-7’)、 158.5(C-5’)、162.3(C-3’)、170.7(C-1’)；and

ESIMS m/z(％)：459[M+Na]⁺(100).

CH-205-A(armillaricin)

((2R，7aS，7bR)-3-醛基-6，6，7b-三甲基 -2，5，6，7，7a-hexahydro-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-4，6-二羟基-2-甲 基苯甲酸

(2R，7aS，7bR)-3-formyl-6，6，7b-trimethyl-2，5，6，7，7a-hexahyd ro-1H-cyclobuta[e]inden-2-yl 3-chloro-4，6-dihydroxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ0.92(3H，s，CH₃-14)、1，12(3H，s， CH₃-15)、1.13(3H，s，CH₃-8)、1.37(1H，t，J＝12.0Hz，H-10)、1.49 (1H，m，H-10)、2.00(1H，dd，J＝7.6，11.2Hz，H-6)、2.04(1H，d， J＝18.0Hz，H-12)、2.35(1H，d，J＝18.0Hz，H-12)、2.60(3H，s， 8’-CH₃)、2.66(1H，dd，J＝6.8，11.2Hz，H-6)、2.87(1H，m，H-9)、 3.89(3H，s，5’-OCH₃)、6.16(1H，br s，H-3)、6.34(1H，t，J＝8.0 Hz，H-5)、6.41(1H，s，H-4’)、9.75(1H，s，H-1)、11.37(1H，s， 3’-OH)；and

¹³C NMR(CDCl₃，400MHz)δ16.4(CH₃-8)、20.1(CH₃-8’)、27.4 (CH₃-14)、29.2(CH₃-15)、36.3(C-7)、37.3(C-11)、39.3(C10)、 40.8(C-6)、45.6(C-12)、48.5(C-9)、56.3(5’-OCH₃)、72.3(C-5)、 98.5(C-4’)、105.5(C-2’)、110.2(C-3)、115.9(C6’)、129.3(C-2)、 139.5(C-7’)、150.2(C-13)、160.0(C-5’)、160.7(C-4)、163.4 (C-3’)、170.1(C-1’)、187.5(C-1)；EIMS m/z(％)：432(1)、 430(3)、391(5)、232(4)、214(20)、201(40)、200(13)、199(100)、 187(5).

CH-205-E(melledonal C)

((2R，2aS，4aR，7R，7bR)-3-醛基-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢 -2a，4a，7-tri羟基-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-6-羟基 -4-甲氧基-2-甲基苯甲酸

((2R，2aS，4aR，7R，7bR)-3-formyl-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahyd ro-2a，4a，7-trihydroxy-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2 -yl)3-chloro-6-hydroxy-4-methoxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.00(3H，s，CH₃-14)、1，16(3H，s， CH₃-15)、1.40(3H，s，CH₃-8)、1.85(1H，d，J＝14.4Hz，H-6)、2.06 (1H，d，J＝3.2Hz，H-12)、2.07(1H，d，J＝2.0Hz，H-12)、2.14(1H， d，J＝14.4Hz，H-6)、2.41(3H，s，CH₃-8’)、2.51(1H，d，J＝3.2Hz， H-9)、3.73(1H，d，J＝3.2Hz，H-10)、3.86(3H，s，OCH₃-5’)、5.69 (1H，t，J＝8.8Hz，H-5)、6.38(1H，s，H-4’)、6.82(1H，d，J＝0.4 Hz，H-3)、9.48(1H，s，H-1)、11.24(1H，s，OH-3’)；and

¹³C NMR(CDCl₃，400MHz)δ19.8(CH₃-8’)、20.8(CH₃-8)、23.2 (CH₃-14)、28.1(CH₃-15)、32.0(C-12)、35.7(C-7)、41.2(C-11)、 54.8(C-6)、55.1(C-9)、56.3(OCH₃-5’)、74.2(C-5)、74.5(C-13)、 81.4(C-10)、98.6(C-4’)、106.2(C-2’)、115.4(C-6’)、134.6 (C-2)、139.1(C-7’)、153.0(C-3)、159.6(C-5’)、162.9(C-3’)、 170.1(C-1’)、195.9(C-1)；E IMS m/z(％)：479[M-H]⁺(100)、346 (18)、215(30).

CH-205-I(armillaritin)

((2R，2aS，4aR，7aR，7bR)-3-醛基-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢 -2a，4a-二羟基-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)2，4-二羟基-6-甲 基苯甲酸

((2R，2aS，4aR，7aR，7bR)-3-formyl-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahy dro-2a，4a-dihydroxy-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-y l)2，4-dihydroxy-6-methylbenzoate

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ0.91(3H，s，CH₃-14 or CH₃-15)、1.10 (3H，s，CH₃-14 or CH₃-15)、1.23(3H，s，CH₃-8)、1.27(1H，d，J＝12.8 Hz，H-10)、1.60(1H，dd，J＝7.6，12.8Hz，H-10)、1.85-1.98(3H， m，H-6及H₂-12)、2.25(3H，s，CH₃-8’)、2.30(1H，dd，J＝6.4、12.8 Hz，H-9)、2.39(1H，dd，J＝8.8，11.2Hz，H-6)、5.60(1H，t，J＝8.8 Hz，H-5)、6.11(1H，d，J＝2.8Hz，H-4’or H-6’)、6.83(1H，d， J＝1.2Hz，H-3)、9.55(1H，s，H-1)；

¹³C NMR(CD₃OD，400MHz)δ22.2(C-8)、24.7(C-8’)、31.1(CH₃-14 or CH₃-15)、31.3(CH₃-14 or CH₃-15)、32.2(C-6)、35.3(C-11)、 38.9(C-7)、44.0(C-10)、50.7(C-9)、58.3(C-12)、75.3(C-5)、 76.2(C-13)、77.9(C-4)、101.7(C-4’)、105.4(C-2’)、112.4 (C-6’)、137.2(C-2)、144.4(C-7’)、152.9(C-3)、163.6(C-5’)、 166.2(C-3’)、171.9(C-1’)、196.9(C-1)；以及

ESIMS m/z(％)：439[M+Na]⁺.

CH-205-6-4-D(armillarinin)

((2R，2aS，4aR，7bR)-3-醛基-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-2a，4a- 二羟基-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-6-羟基-4-甲氧基 -2-甲基苯甲酸

((2R，2aS，4aR，7bR)-3-formyl-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahydro- 2a，4a-dihydroxy-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-yl) 3-chloro-6-hydroxy-4-methoxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(acetone-d₆，400MHz)δ0.91(3H，s，CH₃-14)、1.10(3H， s，CH₃-15)、1.24(3H，s，CH₃-8)、1.30(1H，d，J＝12.8Hz，H-10)、 1.63(1H，dd，J＝7.6，12.8Hz，H-10)、1.65-2.00(3H，m，H-6及 H₂-12)、2.30-2.35(1H，m，H-9)、2.41(3H，s，CH₃-8’)、2.54(1H， dd，J＝8.8，11.2Hz，H-6)、3.89(3H，s，OCH₃-5’)、5.58(1H，t，J＝8.8 Hz，H-5)、6.46(1H，s，H-4’)、6.94(1H，d，J＝1.2Hz，H-3)、9.63 (1H，s，H-1)、11.2(1H，s，OH-3’)；

¹³C NMR(acetone-d₆，400MHz)δ19.8(C-8’)、22.0(C-8)、 30.6(CH₃-14)、31.2(CH₃-15)、31.9(C-6)、34.7(C-11)、38.5(C-7)、 43.6(C-10)、50.4(C-9)、56.7(OCH₃-5’)、58.1(C-12)、75.7(C-13)、 76.2(C-5)、77.5(C-4)、99.3(C-4’)、107.5(C-2’)、115.5(C-6’)、 136.7(C-2)、139.5(C-7’)、153.4(C-3)、160.2(C-5’)、163.2 (C-3’)、170.6(C-1’)、197.0(C-1)；以及

ESIMS m/z(％)：487[M+Na]⁺.

CH-205-L(Dihydromelleolide，Melleolide F)

((2R，2aS，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-2a-羟基-3-(羟甲 基)-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)2，4-二羟基-6-甲基苯甲酸

((2R，2aS，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-oc tahydro-2a-hydroxy-3- (hydroxymethyl)-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-yl) 2，4-dihydroxy-6-methylbenzoate

¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ0.97(3H，s，CH₃-15)、0.98(3H，s， CH₃-14)、1.24(3H，s，CH₃-8)、1.31(1H，d，J＝12.5Hz，H-10)、1.38 (1H，dd，J＝6.5，12.5Hz，H-10)、1.46(1H，d，J＝13.0Hz，H-12)、 1.63(1H，t，J＝10.5Hz，H-6)、1.82(1H，dd，J＝8.5，13.5Hz，H-12)、 1.92(1H，dd，J＝9.0、11.0Hz，H-6)、2.14(1H，m，H-9)、2.27(3H， s，CH₃-8’)、2.72(1H，br t，J＝7.5Hz，H-13)、3.99(1H，d，J＝12.0 Hz，H-1)、4.27(1H，d，J＝12.0Hz，H-1)、5.52(1H，t，J＝9.0Hz， H-5)、5.76(1H，br s，H-3)、6.13(1H，d，J＝2.0Hz，H-6’)、6.21 (1H，d，J＝2.0Hz，H-4’)；

¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)δ21.1(CH₃-8)、24.0(CH₃-8’)、31.7 (CH₃-14)、31.9(CH₃-15)、32.4(C-6)、38.0(C-11)、38.7(C-13)、 39.0(C-7)、41.3(C-10)、44.1(C-9)、47.4(C-12)、66.0(C-1)、 77.6(C-4)、78.3(C-5)、101.3(C-4’)、104.6(C-2’)、111.9(C-6’)、 132.4(C-2)、136.2(C-3)、143.8(C-7’)、161.4(C-5’)、165.1 (C-3’)、171.3(C-1’)；以及

ESIMS m/z(％)：425[M+Na]⁺(100).

CH-205-O(Armillaridin)

((2R，2aS，7bR)-3-醛基-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-2a-羟基 -6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2-甲基 苯甲酸

((2R，2aS，7bR)-3-formyl-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahydro-2a-h ydroxy-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-yl) 3-chloro-6-hydroxy-4-methoxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ0.98(3H，s，CH3-15)、1.01(3H，s， CH3-14)、1.25(1H，d，J＝12.8Hz，H-10)、1.31(3H，s，CH3-8)、 1.48(1H，dd，J＝6.8，12.8Hz，H-10)、1.53-1.58(2H，m，H-6及 H-12)、2.00(1H，dd，J＝9.6，13.6Hz，H-6)、2.06(1H，dd，J＝8.8， 11.2Hz，H-12)、2.26(1H，m，H-9)、2.42(3H，s，CH3-8’)、3.00 (1H，br t，J＝2.0Hz，H-13)、3.86(3H，s，OCH3-5’)、5.61(1H，t， J＝8.8Hz，H-5)、6.38(1H，s，H-4’)、6.78(1H，d，J＝2.0Hz，H-3)、 9.45(1H，s，H-1)、11.33(1H，s，OH-3’)；

13C NMR(CDCl3，100MHz)δ19.8(CH3-8’)、21.1(CH3-8)、31.1 (CH3-14)、31.5(CH3-15)、33.1(C-12)、37.6(C-11)、38.0(C-7)、 40.3(C-13)、41.7(C-10)、44.1(C-9)、46.6(C-6)、56.3(OCH3-5’)、 75.0(C-4)、77.7(C-5)、98.6(C-4’)、106.3(C-2’)、115.4(C-6’)、 137.3(C-2)、139.1(C-7’)、158.3(C-3)、159.5(C-5’)、162.9 (C-3’)、170.2(C-1’)、195.9(C-1)；以及

ESIMS m/z(％)：471[M+Na]⁺(100)、437(75).

CH-205-O-1(Armillarin)

((2R，2aS，7bR)-3-醛基-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-2a-羟基 -6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)2-羟基-4-甲氧基-6-甲基苯甲酸

((2R，2aS，7bR)-3-formyl-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahydro-2a-h ydroxy-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-yl) 2-hydroxy-4-methoxy-6-methylbenzoate

¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ0.98(3H，s，CH3-15)、1.01(3H，s， CH3-14)、1.26(1H，d，J＝10.0Hz，H-10)、1.31(3H，s，CH3-8)、 1.48(1H，m，H-10)、1.55(2H，m，H-6及H-12)、1.97-2.06(2H，m， H-6及H-12)、2.26(1H，m，H-9)、2.28(3H，s，CH3-8’)、3.00(1H， br t，J＝6.0Hz，H-13)、3.78(3H，s，OCH3-5’)、5.63(1H，t，J＝7.2 Hz，H-5)、6.18(1H，br s，H-4’)、6.29(1H，br s，H-6’)、6.77 (1H，br s，H-3)、9.45(1H，d，J＝1.2Hz，H-1)、11.64(1H，s，OH-3’)；

13C NMR(CDCl3，125MHz)δ21.2(CH3-8’)、24.5(CH3-8)、 31.1(CH₃-14)、31.6(CH₃-15)、33.1(C-12)、37.5(C-11)、38.0(C-7)、 40.3(C-13)、41.7(C-10)、44.1(C-9)、46.6(C-6)、55.3(OCH₃-5’)、 75.1(C-4)、77.2(C-5)、98.8(C-4’)、105.0(C-2’)、111.1(C-6’)、 137.5(C-2)、142.5(C-7’)、158.1(C-3)、163.9(C-5’)、165.7 (C-3’)、170.8(C-1’)、195.8(C-1)；以及

ESIMS m/z(％)：437[M+Na]⁺(100).

CH-205-P(Armillarikin)

((2R，2aS，7R，7bR)-3-醛基-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-2a，7-二 羟基-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-6-羟基-4-甲氧基-2- 甲基苯甲酸

((2R，2aS，7R，7bR)-3-formyl-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahydro-2 a，7-dihydroxy-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2-yl) 3-chloro-6-hydroxy-4-methoxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(acetone-d₆，400MHz)δ0.99(3H，s，CH₃-15)、1.02(3H， s，CH₃-14)、1.31(3H，s，CH₃-8)、1.57(1H，dd，J＝6.0、12.8Hz，H-12)、 1.71(1H，d，J＝8.8，10.8Hz，H-6)、2.05-2.11(2H，m，H-6及H-12)、 2.42(3H，s，CH₃-8’)、2.47(1H，dd，J＝3.2，10.0Hz，H-9)、3.20 (1H，m，H-13)、3.62(1H，d，J＝3.2Hz，H-10)、3.91(3H，s，OCH₃-5’)、 5.75(1H，t，J＝8.8Hz，H-5)、6.50(1H，s，H-4’)、7.03(1H，d， J＝2.8Hz，H-3)、9.48(1H，s，H-1)、11.16(1H，s，OH-3’)；

¹³C NMR(acetone-d₆，400MHz)δ19.7(CH₃-8’)、21.3(CH₃-8)、 24.0(CH₃-14)、28.4(CH₃-15)、33.4(C-6)、36.5(C-7)、36.7(C-13)、 43.3(C-11)、43.9(C-12)、47.7(C-9)、56.8(OCH₃-5’)、75.0(C-4)、 76.7(C-5)、81.4(C-10)、99.4(C-4’)、108.2(C-2’)、112.0(C-6’)、 136.3(C-2)、139.6(C-7’)、156.8(C-3)、160.3(C-5’)、163.2 (C-3’)、170.5(C-1’)、195.4(C-1)；以及

ESIMS m/z(％)：487[M+Na]⁺(100).

CH-205-Q(melledonal B)

((2R，2aS，4aR，7R，7bR)-3-醛基-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢 -2a，4a，7-tri羟基-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)3-氯-4，6-二 羟基-2-甲基苯甲酸

((2R，2aS，4aR，7R，7bR)-3-formyl-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahyd ro-2a，4a，7-trihydroxy-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden-2 -yl)3-chloro-4，6-dihydroxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(acetone-d₆，400MHz)δ0.98(3H，s，CH₃-15)、1.16(3H， s，CH₃-14)、1.40(3H，s，CH₃-8)、1.91-2.02(3H，m H-6及H₂-12)、 2.26(1H，dd，J＝8.8，10.4Hz，H-6)、2.42(3H，s，CH₃-8’)、2.54 (1H，d，J＝4.0Hz，H-9)、3.74(1H，br s，H-10)、5.70(1H，t，J＝8.8 Hz，H-5)、6.44(1H，s，H-4’)、6.95(1H，d，J＝0.8Hz，H-3)、9.59 (1H，s，H-1)、10.91(1H，br s，OH-3’)；

¹³C NMR(acetone-d₆，400MHz)δ19.7(CH₃-8’)、21.4(CH₃-8)、 24.0(CH₃-14)、28.4(CH₃-15)、32.8(C-6)、36.9(C-7)、41.8(C-11)、 55.1(C-12)、55.4(C-9)、75.0(C-5)、75.1(C-13)、76.8(C-4)、 82.1(C-10)、102.5(C-4’)、108.2(C-2’)、114.7(C-6’)、134.8 (C-2)、140.0(C-7’)、150.9(C-3)、158.5(C-5’)、162.3(C-3’)、 170.3(C-1’)、195.6(C-1)；以及

ESIMS m/z(％)：491(30)、489[M+Na]⁺(100).

CH-205-S-1(Melleolide B)

((2R，2aS，7R，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-2a，7-二羟基 -3-(羟甲基)-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)2-羟基-4-甲氧基 -6-甲基苯甲酸

((2R，2aS，7R，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahydro-2a，7-dihyd roxy-3-(hydroxymethyl)-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden- 2-yl)2-hydroxy-4-methoxy-6-methylbenzoate

¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ0.97(3H，s，CH₃-15)、1.02(3H，s， CH₃-14)、1.35(3H，s，CH₃-8)、1.46(1H，dd，J＝5.5，13.0Hz，H-12)、 1.64(1H，t，J＝10.0Hz，H-6)、1.93-1.97(2H，m，H-6及H-12)、 2.25(1H，dd，J＝3.5，9.5Hz，，H-9)、2.34(3H，s，CH₃-8’)、2.81 (1H，br s，H-13)、3.58(1H，d，J＝3.5Hz，H-10)、3.77(3H，s， OCH₃-5’)、3.91(1H，d，J＝12.5Hz，H-1)、4.21(1H，d，J＝12.5Hz， H-1)、5.66(1H，t，J＝9.0Hz，H-5)、5.83(1H，br s，H-3)、6.22(1H， d，J＝1.5Hz，H-6’)、6.27(1H，d，J＝1.5Hz，H-4’)、11.60(1H， s，OH-3’)；

¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)δ21.2(CH₃-8)、23.8(CH₃-15)、24.1 (CH₃-8’)、29.1(CH₃-14)、32.7(C-6)、34.9(C-13)、36.3(C-7)、 42.5(C-11)、44.5(C-12)、46.9(C-9)、55.3(OCH₃-5’)、76.4(C-4)、 76.7(C-5)、82.4(C-10)、98.8(C-4’)、104.9(C-2’)、111.2(C-6’)、 132.7(C-2)、135.8(C-3)、142.9(C-7’)、164.1(C-5’)、165.7 (C-3’)、171.0(C-1’)；以及

ESIMS m/z(％)：455[M+Na]⁺(100).

CH-205-S-2(Melleolide I)

((2R，2aS，7R，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-八氢-2a，7-二羟基 -3-(羟甲基)-6，6，7b-三甲基-1H-环丁[e]茚-2-基)-3-氯-6-羟基-4-甲 氧基-2-甲基苯甲酸

((2R，2aS，7R，7bR)-2，2a，4a，5，6，7，7a，7b-octahydro-2a，7-dihyd roxy-3-(hydroxymethyl)-6，6，7b-trimethyl-1H-cyclobuta[e]inden- 2-yl)-3-chloro-6-hydroxy-4-methoxy-2-methylbenzoate

¹H NMR(acetone-d₆，400MHz)δ0.96(3H，s，CH₃-15)、1.01(3H， s，CH₃-14)、1.36(3H，s，CH₃-8)、1.46(1H，dd，J＝6.5，13.2Hz，H-12)、 1.71(1H，dd，J＝8.8，10.0Hz，H-6)、1.92(1H，dd，J＝10.0、12.8 Hz，H-6)、1.99(1H，d，J＝8.8Hz，H-6)、2.34(1H，dd，J＝4.0、9.6 Hz，，H-9)、2.49(3H，s，CH₃-8’)、2.86(1H，m，H-13)、3.57(1H， d，J＝4.0Hz，H-10)、3.91(3H，s，OCH₃-5’)、4.03(1H，d，J＝13.2 Hz，H-1)、4.27(1H，d，J＝13.2Hz，H-1)、5.61(1H，t，J＝8.8Hz， H-5)、5.86(1H，d，J＝0.8Hz，H-3)、6.51(1H，s，H-4’)；

¹³C NMR(acetone-d₆，100MHz)δ19.4(CH₃-8’)、21.8(CH₃-8)、 24.4(CH₃-15)、29.2(CH₃-14)、33.8(C-6)、35.7(C-13)、37.4(C-7)、 43.3(C-11)、45.7(C-12)、47.7(C-9)、56.8(OCH₃-5’)、64.3(C-1)、 76.5(C-4)、78.1(C-5)、82.2(C-10)、99.4(C-4’)、108.5(C-2’)、 115.6(C-6’)、133.0(C-3)、133.8(C-2)、139.6(C-7’)、160.1 (C-5’)、162.5(C-3’)、170.5(C-1’)；以及

ESIMS m/z(％)：489[M+Na]⁺(100)、491(40).

实施例2化合物对癌细胞的细胞毒性试验

阿尔玛蓝(alamar blue；AB)分析(试剂来自于Biosource  International，Nivelles，Belgium)是用来测试细胞活力，且在 Fatokun et al(Bone(2006)39，542-551中也已叙述测验方法。基本 上，在温度37℃以不同浓度的化合物(如实施例1.1所得的化合物) 处理细胞48小时。在处理完毕后，分别地将每一个培养皿(well)中的 培养液吸取出。之后，再加入100μL新鲜的培养液(其含有10％v/v的 阿尔玛蓝)至每个实验组和控制组的培养皿(well)。接下来，在温度 37℃下培养上述的培养皿(well)6小时后，再使用分光光度计(DYNEX Technologies；USA)测量每一个培养皿的吸收值，其测量波长为570nm 和600nm。将实验数据正规化至控制组。结果列示于表一中。CH-205-A、 CH-205-K、CH-205-L、CH-205-O及CH-205-P对MCF-7细胞有效； CH-205-A、CH-205-H、CH-205-K、CH-205-L、CH-205-O及CH-205-P对 H460细胞有效；CH-205-A及-P对HT-29细胞有效，以及CH-205-A、 CH-205H、CH-205N及CH-205O对CEM细胞有效。

表一，实施例1.1的化合物细胞毒测试

实施例3化合物对抗血管生成的活性试验

3.1试管内(In vitro)血管新生试验

可藉由测定化合物CH-205对内皮细胞之抑制成长，得知化合物的 抗血管生成活性。此测试方法使用MTT (3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide， a tetrazole)分析化合物CH-205对内皮细胞的毒性测试。MTT分析系为 一种标准比色法(量测颜色改变的分析方法)。MTT分析是用来测量细胞 中的酶活性，该酶可还原黄色的MTT至紫色的Formazan。MTT分析也可 用来测定药用试剂和毒性物质的细胞毒性。若试剂中的化合物对细胞具 有细胞毒性，将导致细胞代谢将无法正常作用，而降低其分析的效能。 虽然，化合物CH-205的MTT试验的细胞毒性浓度皆高于20μM(表二)， 但其对抑制血管新生的效用为nM范围，其表示化合物为安全的(表三)。

表二，化合物CH-205对血管内皮细胞的细胞活力测试(控制组％)

表三，试管内化合物CH-205对血管内皮细胞的抗血管新生试验

  化合物   IC₅₀(nM)   化合物   IC₅₀(nM)   CH-205-A   40.3   CH-205-N   3.5   CH-205-E   23.0   CH-205-O   2.1   CH-205-H   1.3   CH-205-P   1.8   CH-205-K   3.2   CH-205-Q   1.0   CH-205-L   1.1

3.2细胞迁移试验以及试管内(In vitro)血管新生试验

细胞迁移是与血管新生相关。因此，可藉由细胞伤口愈合试验 (wound healing assay)得知化合物CH-205对内皮细胞迁移的抑制能力。

藉由伤口愈合试验，可得知血管内皮细胞迁移。使用商品 (Culture-Insert，iBidi GmbG，Germany)进行伤口愈合试验。根据商 品的操作手册，在盖玻片间的血管内皮细胞制造宽度约0.5mm的机械 性刮痕，且在细胞上留下约500μm面积的空隙。将血管内皮细胞与一 系列的已稀释的CH-205化合物(其包含CH-205-A、CH-205-E、 CH-205-H、CH-205-K、CH-205-K、CH-205-L、CH-205-N、CH-205-O、 CH-205-P和CH-205-Q)进行前处理。接下来，清洗血管内皮细胞后，并 再将上述的前处理后的细胞与血管内皮生长因子(vascular  endothelial growth factor；VEGF)进行培养4小时。且另外培养一 组不加入VEGF的血管内皮细胞，以当作控制组。观察内皮细胞的迁移 在10倍数的反式显微镜(Nikon/TMS microscope)下，并记录在伤口的 边缘的迁移的细胞。结果显示于图1中。血管内皮细胞与VEGF培养4 小时后，因血管内皮细胞迁移，可观察到其伤口宽度缩小。而使用化合 物CH-205前处理过的血管内皮细胞，其依据施予化合物的剂量而具有 抑制VEGF诱导对内皮细胞迁移的作用。

实施例4体内(In vivo)化合物对反肿瘤的效用

4.1试管内(In vitro)之肿瘤细胞异种移植异种移植

制备一RPMI培养液，具有可移植的肿瘤细胞H460，浓度为 5×10⁶/200μL。取200μL的细胞悬浮液注射至每支老鼠的右侧腹皮下。 当老鼠的异种移植肿瘤大小约40mm³时，可随机地各选取4-6支老鼠为 对照组以及为实验组(药物测试组)。在第15天，当老鼠的平均肿瘤大 小约75-80mm³时，可开始施予主导化合物或空白物(对照组)至老鼠。 在施予药物之前，将随机地将5个有肿瘤的老鼠分组(5个1组)。施予 测试用药至老鼠之腹腔(intraperitoneal)，其每隔一天(每隔48小时) 施予7次或10次的最佳的剂量的化合物。施予10次的CH-205-O(4、 40、80mg/kg)，以及7次的CH-205-K(4、20、40、80mg/kg)。此外， 分别地施予老鼠空白溶剂以及顺铂(cisplatin)(5mg/kg)，以作为负 和正控制组。施予试验化合物之后2天后，将老鼠牺牲。每隔2天使用 直尺量测并计算其肿瘤的面积以及体积。计算公式为V(mm³)＝a×b²/2， 其中a为最大直径，b为最小直径。也分别地记录每一周老鼠的体重。 计算肿瘤成长抑制比例(growth inhibition ratio；TGI)，使用公式 TGI＝(1-(平均实验组肿瘤重量/平均控制组肿瘤重量))×100％。

4.2 CH-250-O的抗异种移植肿瘤H460的效用

图2A、图2B及图3显示了CH-205-O对H460肺癌异种移植肿瘤的 影响。在此试验中，皮下注射5×10⁶ H460细胞至老鼠(第0天)，且在 第16天后开始进行试验，数据是以平均±标准误差(n＝4-6/组)表示。 结果表示，每隔1天接受4、40及80mg/kg CH-205-O的老鼠，经过10 次的CH-205-O注射后，肿瘤有明显的退化。在牺牲老鼠之后，施予4、 40及80mg/kg CH-205-O以及溶剂控制组的老鼠，其肿瘤体积分别为 1.475±0.155、1.470±0.177、1.645±0.206及3.984±0.484 cm³(图2A)。施予CH-205-O与溶剂控制组的老鼠的体重并没有明显的 差别。注射顺铂(cisplatin)的老鼠有较低的体重成长(图2B)。施予4、 40及80mg/kg之CH-205-O以及顺铂(cisplatin)的TGI分别为60.87％、 70.7％、62.9％以及82％(图3)。

4.3CH-205-K对H460异种移植的抗肿瘤效用

图4A、图4B及图5显示了CH-205-K对H460肺癌异种移植肿瘤的 影响。注射5×10⁶ H460细胞的老鼠方法如上所述。结果表示，肿瘤退 化与CH-205-K的剂量相关。在老鼠牺牲后，施予4、20、40、80mg/kg CH-205-K及控制组的老鼠，其肿瘤体积分别为1.364±0.14、1.283± 0.077、1.109±0.119、0.867±0.086及1.743±0.129cm³(图 4A)。施予CH-205-K与控制组的老鼠体重并没有明显的差别。注射顺铂 (cisplatin)的老鼠有较低的体重成长(第4B图)。施予4、40及80mg/kg CH-205-K以及顺铂(cisplatin)的老鼠TGI分别为60.87％、70.7％、 62.9％以及82％(图5)。

虽然本发明已以实施方式揭示如上，并用以限定本发明，任何本领 域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润 饰，因此本发明的保护范围当视所附的权利要求书所界定者为准。鉴于 依附项所定义，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限 定本发明，各种的改变、取代或交替方式，皆不偏离本实施方式的精神 与范围。