一种培育转基因耐寒植物的方法

摘要

本发明公开了一种培育转基因耐寒植物的方法，首先构建含有SEQ ID NO：2所示基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种培育转基因耐寒植物的方法。

背景技术

大豆是世界上重要的蛋白和油料作物。低温对大豆生长造成严重影响，特别是在生长后期，冷胁迫往往对大豆产量造成严重破坏，成为限制大豆产量提高的重要因素。长期以来，人们主要用传统遗传育种的方法对大豆的抗逆性进行改良，然而这种方法具有效率低、周期性长的缺点，并且随着长期的使用其效果越来越不明显。利用转基因技术将抗逆相关基因转化到大豆中是提高大豆抗逆性的一个更直接有效的途径和必然趋势。

目前，植物抗冷机制在拟南芥中研究较多，其中研究的最为清楚的是CBFs(CRT-binding factorl)转录因子，包括CBFs的上下游发挥功能的各个基因所介导的冷信号通路(Jaglo-Ottosen et al.，1998；Gilmour et al.，2000)。另外，除了CBFs转录因子介导的冷信号通路外，其他独立于CBFs转录因子之外的冷信号通路的研究也取了一些进展(Zhu et al.，2004；Xin et al.，2007；Zhu et al.，2008)。

大豆抗冷机理的研究相对较少，冷相关基因的克隆和功能研究相对滞后。目前，主要通过同源克隆的方法在大豆中克隆了一些冷相关的基因。这些基因主要包括一些Ap2、bZIP、MYB、WRKY等家族的转录因子。Chen等通过同源搜索大豆EST数据库得到一个含有Ap2结构域的基因GmDREB3，可以和干旱应答原件DRE结合，此基因受冷诱导上调，同时此基因转化拟南芥的过表达植株能增强对冷、干旱、盐等胁迫条件的抗性(Chen et al.，2008)。Liao等以拟南芥bZIP结构域为探针对大豆EST序列搜索、拼接，最终鉴定了4个bZIP家族的基因，其表达受到不同胁迫条件的调节，可以同ABRE元件结合并且其转化拟南芥的过表达植株增强了对冷冻和盐胁迫条件的抗性(Liao et al.，2008)。Zhou等通过同源比对的方法鉴定了数个含有WRKY结构域的基因，能同W-box作用元件结合，其表达受盐、干旱、冷等胁迫条件的调节，其转基因过表达拟南芥植株对盐、干旱、冷等胁迫的抗性增加(Zhou et al.，2008)。Cheng等利用cDNA-AFLP技术在大豆胚轴中得到一个受冷上调的基因，其过表达拟南芥植株增强了对冷、干旱和盐的抗性(Cheng et al.，2009)。Xie等利用RACE技术得到2个trihelix家族的转录因子，其蛋白被定为在细胞核中表达，其过表达拟南芥植株增强了对冷、干旱和盐的抗性(Xie et al.，2009)。RCC1(regulator of chromosome condensation 1)家族蛋白是一种启动染色体集缩的负调节物，RCC1首先从小仓鼠的肾细胞系BHK-21中分离出来(Kai et al.，1986；Ohtsubo et al.，1987)。RCC1是目前已知的Ran鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)，通过调节RanGDP到RanGTP的转换，在核内输、外运、有丝分裂期纺锤体的形成及核膜重组、防止S期DNA多重复制等过程中起作用(Yamaguchi and Newport，2003)。RCC1家族基因在生物中的保守性很高，在植物中，对RCC1家族基因的研究刚刚起步。Kliebenstein等在拟南芥中鉴定了一个RCC1家族基因UVR8，能增强拟南芥对紫外线的抗性，但UVR8不具有GEF活性(Kliebenstein et al.，2002)。Favory等研究表明在UV-B照射的条件下，UVR8与COP1(constitutively photomorphogenic 1)可以发生相互作用，调节UV-B引导的光形态建成，以减少UV-B对植物的损伤(Favory et al.，2009)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种培育转基因耐寒植物的方法，将目的基因导入到正常植物体内高表达，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种培育转基因耐寒植物的方法，使序列表中SEQ ID NO：1所示蛋白质的编码基因在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，使序列表中SEQ ID NO：2所示的基因在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有SEQ ID NO：2所示基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，以SUPER1300为载体构建重组表达载体。

作为本发明的一种优选技术方案，将目的基因插入到SUPER1300的限制性内切酶Xba I和Kpn I酶切识别位点之间，得到重组表达载体，命名为SUPER1300-35S-GmICO。

作为本发明的一种优选技术方案，以pEZR(K)LC为载体构建重组表达载体。

作为本发明的一种优选技术方案，将目的基因插入到pEZR(K)LC的限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切识别位点之间，得到重组表达载体，命名为pEZR(K)LC-35S-GFP-GmICO。

作为本发明的一种优选技术方案，利用重组表达载体转化农杆菌GV3101获得转化体，然后再利用农杆菌介导的蘸花法转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明的基因在冷诱导的条件下高表达，通过基因工程技术将此基因转移到拟南芥中可以显著提高拟南芥对低温的抗性；低温胁迫环境下培育，野生型植株的成活率为42％，两个导入本发明基因的转基因株系的成活率分别为69％和74％；转基因技术已经成为提高作物抗逆性的主要途径，本发明为提高大豆等作物的耐冷性提供了重要的基因资源。

附图说明

图1为大豆GmICO蛋白与人类RCC1蛋白功能结构域分析结果，图中着色圆球所示为RCC1重复结构域。

图2为利用RT-PCR技术对GmICO表达模式分析的结果，图A-D为大豆中GmICO基因在受低温、ABA、NaCl、PEG胁迫下的RT-PCR电泳图谱；图E为不同组织——叶(L)、茎(S)、根(R)、根瘤(N)、——中GmICO表达模式结果。

图3为pCAMBIA1391-P_GmICO-GUS的GUS染色对GmICO表达模式的分析结果。

图4为转基因拟南芥抗冷性表型鉴定结果，图A为PCR对转基因植株的鉴定结果，图B为野生型拟南芥和转基因拟南芥抗冷性表型比较。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明的基因及其编码的蛋白质，来源于大豆属大豆(Glycine max L.)，其名称为GmICO。

序列表中SEQ ID NO：1所示为GmICO蛋白的氨基酸序列，参看图1，GmICO蛋白为一种人类RCC1(Regulator of chromosome condensation 1)蛋白的同源蛋白，由477个氨基酸残基组成，含有5个RCC1重复结构域，人类的RCC1(NP_001260)蛋白含有7个RCC1重复结构域，GmICO蛋白与RCC1蛋白具有类似的功能结构域分布。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因和启动子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物基因枪转化法所用的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如烟草花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

GmICO基因的逆境及组织表达模式验证(一)：利用RT-PCR技术对GmICO基因的逆境及组织表达模式进行分析验证

(1)、胁迫处理：Hoagland营养液生长20天左右的大豆Williams82幼苗用15％ PEG6000，200mM NaCl，4℃，100μM ABA分别处理Oh、1h、3h、6h、12h、24h，取叶片用液氮速冻，-80℃保存备用；同时，另一组大豆种子用70％的洒精灭菌30 S，dH20冲洗6遍后播种于无菌培养皿中，皿底置2张无菌滤纸，dH20浸湿，28℃暗萌发3天。芽长至2cm时，移至放有湿润滤纸的试管中，芽长至4～5cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接种30min，低N水培，温度为26℃，相对湿度为70％，培养28天，4℃处理5小时，对照为正常环境，取叶、茎、根、根瘤，液氮冷冻，-80℃储藏；

(2)、mRNA的分离：采用Trizol法提取大豆总RNA，①先将组织剪切成小块，放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织50-100mg加入1.5mL离心管中然后加入1ml RNAVzol，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体．室温放置5分钟；②加200μl氯仿，振荡混匀，室温静置5min，12,000r/min，4℃离心10min；③取500μl上清于另一离心管，加等体积异丙醇，室温放置10min，12,000r／min，4℃离心10min；④加入1ml 75％乙醇洗沉淀，8,000r/min，4℃离心5min，重复两次；室温风干10min左右，加20μl左右DEPC处理过的RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀；

(3)、反转录为cDNA：将提取的mRNA用Promega公司的反转录酶AMV反转录为cDNA；

cDNA第一链的合成：

配置第一种混合液：total RNA，7μl(2μg)；oligo dT(10μM)，3μl；总体积10μl，PCR仪上70℃放置8min，立即置于冰上；

配置第二种混合液：5×Buffer，4μl；dNTPs(dATP，dGTP，dTTP，dCTP 2.5mmol/L each)，4μl；RNase inhibitot(40U/μl)，0.5μl；RNase-free水，0.5μl；M-MLV(200U/μl)反转录酶，1μl；混匀，将第二种混合液加入到第一种混合液中，每管10μl，PCR仪上42℃孵育90min，然后70℃，10min终止反应；

(4)、利用RT-PCR技术对GmICO基因的逆境及组织表达模式进行分析验证：以上述cDNA作为的模板，设计引物，以18srRNA为内参，进行PCR；其中，引物序列分别为：GmICORTF：5’-ATAATGGCGATGGAACCGAC-3’(SEQ ID NO：4)：GmICORTR：5’-AACGAGGGCTCACTTGCTC T-3’(SEQ ID NO：5)：18srRNAF：5’-CCTTGCTTGTTGCTTTACTAAAT-3’(SEQ ID N0：6)：18srRNAR：5’-ATGCACCTTTTCGTTTGTTTCGGAG-3’(SEQ ID N0：7)：

RT-PCR反应体系：cDNA模板，1μl；10×Buffer，2μl；DNTP，1.6μl；Taq，0.2μl；Primers，1μl；ddH₂O，14.2μl；Total，20μl；RT-PCR反应程序：94℃，3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，30循环；72℃ 8min；PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；

(5)结果：

参看附图2，结果显示，GmICO基因在冷处理下表达明显上调，冷处理12小时时，表达最高；ABA，NaCl，PEG处理GmICO变化不明显(图2A-D)；另外，冷处理条件下，GmICO基因在叶中表达最高，根瘤中几乎没有表达(图2E)。

GmICO基因的逆境及组织表达模式验证(二)：利用P_GmICO-GUS染色技术对GmICO基因的逆境表达模式进行分析验证

(1)、GmTC F1启动子的克隆：根据GmICO基因的启动子序列(TAG上游取1990bp，参看SEQ ID NO：3)设计引物对，根据载体pCAMBIA1391多克隆位点，引物末端分别引入Pst I和BamH I酶切识别位点，以CTAB法提取的大豆测序品种Williams82的DNA为模板，PCR扩增GmICO基因的启动子；其中，引物序列为：GmICOProF：5’-AACTGCAGCTGTCTCTGCTGTAAATCGC-3’(SEQ ID NO：8)；GmICOProR：5’-CGGGATCCTCCCACATTCAATTCCAAA GG-3’(SEQ ID NO：9)；PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化2Kb左右的条带；连T载体(pMD19-T，Takara)，挑阳性克隆，摇菌(37℃，200转/分)，上海生工测序；

(2)、重组表达载体的构建：①用上海生工质粒提取试剂盒提取含有GmICO基因Promoter序列的T载体质粒，用限制性内切酶Pst I和BamH I(Takara)酶切，回收酶切产物；②用限制性内切酶Pst I和BamH I酶切空载体pCAMBIA1391，回收载体骨架；③、用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；④、将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA1391-P_GmICO-GUS；

(3)、转基因植物的获得：

(一)、用重组质粒pCAMBIA1391-P_GmICO-GUS转化农杆菌GV3101

①取出冻存的200μl感受态细胞的Eppendorf管，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；

②将Eppendorf管放入液氮中5min；

③取出，将管转入37℃热击5min后，加入1ml YEP液体培养基，28℃低速振荡(150r/min)4h；

④10,000r/min，30sec，去上清，加100μl YEP液体培养基，悬浮菌体后涂YEP固体平板(含50mg/ml卡那霉素，50mg/ml利福平)；

⑤倒置培养皿，28℃培养至转化子长出，菌落PCR鉴定出的阳性克隆用于拟南芥植物的转化；

(二)、利用农杆菌介导的蘸花法转化拟南芥

①挑取阳性克隆于含抗生素的YEP培养基中，28℃活化1-2天；

②按1∶100比例接入100ml YEP培养基中，加入乙酰丁香酮(终浓度100μg/ml)，振荡培养至OD600为1.5-2.0；

③离心5,000r/min，6min(室温)收集菌体，弃上清；

④将菌体悬浮于转化介质(2.2g/L Ms salt，50g/L蔗糖，MES 0.5g/L，6-BA 10μg/L，pH 5.7)中，使OD600为0.8，倒在平皿里，加入14％ Silwet L-77，准备植物转化；

⑤培养室里生长3到4周的拟南芥，剪去植株上已经盛开的花，将培养钵小心地倒扣于盛有转化介质的平皿里；

⑥使转化介质浸没植株花苞，并保持摇动30sec；

⑦将蘸花完毕的培养钵取出保湿侧放，暗培养24h后，按正常条件培养至种子成熟，收集种子进行纯合系的筛选；

⑧卡那抗性筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的拟南芥转化植株；

(4)、GUS染色：将转基因拟南芥4℃处理处理12小时，然后进行GUS染色，同时将没有冷处理的转基因拟南芥和野生拟南芥染色，作为对照；参看图3，结果显示在冷处理条件下GmICO基因的启动子能更多的启动GUS基因的表达。

实施例1：利用GmICO基因培育转基因耐寒植物

(1)、GmICO基因的克隆

根据GmICO基因的序列设计引物对，根据载体Super1300的多克隆位点，引物末端分别引入Xba I和Kpn I酶切识别位点，以大豆测序品种Williams82的cDNA为模板进行PCR，扩增GmICO基因；其中引物序列为：GmICOF：5’-GCTCTAGAATGGCCATGAATAATGGCG-3’(SEQ ID NO：10)；GmICOR：5’-GGGGTACCTCAAGTGTGGGACTCGGC-3’(SEQ ID NO：11)；PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1.4Kb左右的条带；连T载体(pMD19-T，Takara)，挑阳性克隆，摇菌(37℃，200转/分)，上海生工测序；

(2)、重组表达载体的构建

①、用上海生工质粒提取试剂盒提取含有GmICO基因序列的T载体质粒，用限制性内切酶Xba I和Kpn I(Takara)酶切，回收酶切产物；

②、用限制性内切酶Xba I和Kpn I酶切空载体SUPER1300，回收载体骨架；

③、用T4连接酶(Taraka)将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④、将步骤③的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒SUPER1300-35S-GmICO；

(3)、转基因植物的获得

用重组质粒SUPER1300-35S-GmICO转化农杆菌GV3101，利用农杆菌介导的蘸花法转化拟南芥，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的拟南芥转化植株；

(4)、转基因植物的PCR鉴定

提取转基因株系RNA，同时提取野生型植株的RNA为对照，反转录成cDNA，PCR检测转化结果，参看附图4A；

(5)、转基因植物的耐寒性鉴定

种植T3代转基因株系，同时种植野生型为对照，生长3周后4℃冷驯化一周，然后-8℃处理2.5小时，统计，比较成活率；参看附图4B，结果显示，野生型成活率为42％，转基因株系T₃-14-4成活率为69％，T₃-17-3成活率为74％；说明利用本发明的基因能够培育出具有高抗寒性的转基因作物。

实施例2：利用GmICO基因培育转基因耐寒植物，其方法与实施例1的不同之处在于：以pEZR(K)LC为空载体构建重组表达载体，将目的基因插入到pEZR(K)LC的限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切识别位点之间，得到重组表达载体；其中，pEZR(K)LC与实施例1的SUPER1300一样，都是含有增强型启动子(35S)的空载体。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。