一种萝卜与大头菜属间远缘杂交获得离体胚的方法

摘要

一种萝卜与大头菜属间远缘杂交获得离体胚的方法，其特征在于按以下步骤依次组成：(1)材料准备、(2)播种、(3)套袋、挂牌、(4)授粉、(5)胚胎抢救，采用本发明的方法成功获得萝卜与大头菜属间远缘杂交离体胚，并培养出杂种胚幼苗，以利于得到育种新资源。

说明书

技术领域

本发明为植物组织培养快速繁殖领域，具体涉及一种萝卜与大头菜属间远缘杂交获得离体胚的方法。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)是我国栽培的主要蔬菜作物之一，十字花科、萝卜属，一、二年生草本植物。原产我国，各地均有栽培，品种极多，常见有白皮萝卜、红皮萝卜、青皮萝卜等。根供食用，鲜食生食均可，种子含油42％，可用于制肥皂或作润滑油。种子、鲜根、叶均可入药，功能下气消积，生萝卜含淀粉酶，能助消化。大头菜(Brassica juncea Coss.var.napiformmis Palet.Bols)是芥菜的一个变种，为根用芥菜，是十字花科、芸薹属的二年生草本植物。其产品器官为肉质根，质地紧密，水份少，纤维多，形状为锥型，肉白色，肉质坚实，有强烈的芥辣味，具有宜肺豁痰、开胃理气的作用。芥菜含有丰富的维生素和大量的微量元素、糖类、蛋白质等，供食部分为肥大的肉质根。萝卜和大头菜均为根用蔬菜，但两者的风味不同。

由于十字花科植物之间进行属间、种间的杂交，往往表现为胚珠的不育。在荚果长到一定程度以后就会黄化，也就是杂种胚胎已经开始败育。造成胚胎败育的原因可能有多种，但从目前有关的研究成果看，这些原因大致可归纳为七类：胚囊发育异常、胚乳发育异常、幼胚起源、营养供应失调、内源激素、酚类物质、某些酶活及基因调控等方面，归纳起来它们大多有一个共同的特征，这些胚较之亲本产生了幅度过大的变异，这些变异导致变异胚要么自身生长不谐调而死亡、要么自身和亲本不谐调而死亡。至于萝卜和大头菜杂种胚败育的原因还有待进一步研究。关于芸薹属植物与萝卜之间远缘杂交不亲和性的障碍的研究报道很少原因尚不清楚，需要进一步的研究。到目前为止，还没有见两者远缘杂交研究方面的报道。为此，本发明对两者进行属间杂交，初步研究杂交亲和性的表现，以及对杂种胚抢救培养方法进行探讨。

发明内容

本发明提供一种萝卜与大头菜属间远缘杂交获得离体胚的方法，获得萝卜与大头菜属间远缘杂交离体胚，获得杂种胚幼苗，以利于得到育种新资源。

本发明采用的技术方案是：

一种萝卜与大头菜属间远缘杂交获得离体胚的方法，其特征在于按以下步骤依次组成：

(1)材料准备：以萝卜雄性不育为母本，以大头菜作为父本；

(2)播种：大头菜和萝卜种子播种在试验大棚里，对其进行常规田间管理；

(3)套袋、挂牌：萝卜和大头菜抽薹后套袋，如果套袋之前已有开放的花，要将花摘掉。萝卜雄性不育系每个单株单独套袋，挂牌编号标记，共10个单株，所有的数据取10个单株的平均值，大头菜不分单株，混合给萝卜授粉；

(4)授粉：套袋以后，萝卜与大头菜开花时，进行人工授粉。授粉一般在早上十点和下午三点进行，效果最佳；授粉的方法：1)在授粉之前首先用水将手洗干净，然后再用酒精消毒；2)打开纱网袋，摘下已经盛开的大头菜的花朵，摘完以后立即将纱袋封好；3)再打开萝卜植株的纱网袋，将大头菜的花粉授到萝卜的柱头上；

(5)胚胎抢救：1)在试验田取授粉以后的荚果，取授粉后第3～9天的荚果，用小刀把果柄去掉；2)将荚果先用无菌水冲洗一遍，然后用70％的酒精消毒30秒，再用0.1％升汞消毒8-10分钟，最后用无菌水清洗3遍，每遍清洗3分钟；3)将消毒好的荚果放到已经灭菌的带有滤纸的培养皿中，把荚果上的水分吸干，然后小心的用小刀把胚珠从荚果里剥出来，接种到装有生芽培养基的培养皿上，操作时要注意无菌、以免污染，一个培养皿上接种4-5个胚珠；4)接种完以后用封口膜把培养皿封好，放到培养箱中培养，培养条件是25℃，光照16h.d-1，光照强度2000lx，培养30-60天；观察胚珠在培养基上的生长情况，做好记载；5)胚胎抢救期间，观察统计如下数据：测量荚长、荚的横径、统计结荚率和观察并统计杂种胚珠培养的出苗率，通过胚珠培养的结果确定萝卜与大头菜远缘杂交胚抢救的最佳时期。

步骤(4)中为了增加花粉与柱头的亲和性，采用的是重复授粉法：连续授粉7天，并注意观察花粉与柱头的亲和性。

步骤(5)中杂交后的初期结荚率在64％-88％之间，横径第7天停止生长，荚长第8天停止增加，授粉以后第7天开始败育，在杂种胚发育后5至8天期间进行胚抢救为最佳时期。

所述的生芽培养基配方为1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5％活性炭，所述的生根培养基配方为1/2MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/LNAA+0.5％活性炭进行离体培养。

本发明取得了以下有益效果：

(1)采用的是重复授粉法提高了花粉与柱头的亲和性；

(2)授粉以后荚果便开始生长，杂交后的初期结荚率在64％-88％之间，到第8天荚长停止增加，而横径第7天停止生长，授粉以后第7天开始败育，而且越往后败育得越快；

(3)确定萝卜与大头菜远缘杂交胚抢救的最佳时期：在杂交荚发育到5至8天；

(4)采用本试验所提到的生芽和生根培养基能培育出成功的试管苗有利于种资资源的创新。

具体实施方式

下面对本发明作一详细说明：

实施例：

1材料与方法

1.1供试材料

以萝卜雄性不育系DH303A为母本(2n＝18)，以大头菜作为父本(2n＝18)，试验材料为市售产品，购买于湖北省农业科学院蔬菜科技研究中心。

1.2试验方法

本试验在湖北省农科院蔬菜科技中心进行。

1.2.1播种

大头菜和萝卜种子播种在试验大棚里，对其进行常规田间管理。

1.2.2套袋、挂牌

萝卜和大头菜抽薹后套袋，如果套袋之前已有开放的花，要将花摘掉。萝卜雄性不育系每个单株单独套袋，挂牌编号标记，共10个单株，所有的数据取10个单株的平均值，大头菜不分单株，混合给萝卜授粉。

1.2.3授粉

套袋以后，萝卜与大头菜开花时，进行人工授粉。授粉一般在早上十点和下午三点进行，效果最佳。授粉的方法：1)在授粉之前首先用水将手洗干净，然后再用酒精消毒。2)打开纱网袋，摘下已经盛开的大头菜的花朵，摘完以后立即将纱袋封好。3)再打开萝卜植株的纱网袋，将大头菜的花粉授到萝卜的柱头上。为了增加花粉与柱头的亲和性，我们采用的是重复授粉法。这一方法与肖成汉[3]的方法相一致。肖成汉采用重复授粉(在第一次授粉后的第二天上午再授粉一次)，对克服属间杂交不亲和，提高结籽率效果较好。

按以上方法连续授粉7天，并注意观察花粉与柱头的亲和性。

1.2.4胚胎抢救

胚胎抢救的常规方法有三种：子房培养、胚珠培养、胚培养[4]。本试验采用的是第二种方法-胚珠培养。具体步骤如下：

在试验田取授粉以后的荚果，取授粉后第3～9天的荚果，用小刀把果柄去掉。将荚果先用无菌水冲洗一遍，然后用70％的酒精消毒30秒，再用0.1％升汞消毒8-10分钟，最后用无菌水清洗3遍，每遍清洗3分钟。将消毒好的荚果放到已经灭菌的带有滤纸的培养皿中，把荚果上的水分吸干，然后小心的用小刀把胚珠从荚果里剥出来，接种到装有生芽培养基(表1)的培养皿上，操作时要注意无菌、以免污染，一般一个培养皿上接种4-5个胚珠。接种完以后用封口膜把培养皿封好，放到培养箱中培养，培养条件是25℃，光照16h.d-1，光照强度2000lx，培养30-60天。观察胚珠在培养基上的生长情况，做好记载。将已经长出的子叶苗转接到生根培养基(表1)上，获得试管苗。

胚胎抢救期间，观察统计如下数据：

(1)测量荚长、荚的横径；

取荚果之前要对每天授粉以后荚果的发育情况有所记载，测量荚长、荚的横径。

(2)统计结荚率；

(3)观察并统计杂种胚珠培养的出苗率；

通过胚珠培养的结果确定萝卜与大头菜远缘杂交胚抢救的最佳时期。

表1  杂种胚珠培养的培养基配方

2.结果与分析

2.1萝卜与大头菜属间杂交的结荚率

经过连续7次授粉，统计授粉花朵数、初期结荚数，计算初期结荚率，结果列于表2。

初期结荚率(％)＝初期得到的荚果数×100/授粉花朵数

杂交后的初期结荚率在64％-88％之间，平均初期结荚率为74％。

表2  授粉花朵数和结荚数

2.2萝卜与大头菜远缘杂交形成荚果的生长

从表3可以看出授粉以后荚果便开始生长，到第8天荚长停止增加，而横径第7天停止生长。而且此时很多荚外观已变黄，胚已经开始败育。杂交胚的胚抢救最好是在荚停止生长、胚败育之前进行。

表3  不同时间测量荚果的长和横径

2.3萝卜与大头菜远缘杂交胚抢救的适宜时期

萝卜与大头菜杂交形成杂种胚以后，在一定时间以后就会出现败育现象，即胚黄化萎缩，停止生长，最后会脱落。表4是对萝卜与大头菜杂交的天数与胚败育之间的关系。由此表可以看出授粉以后第7天开始败育，而且越往后败育得越快。

表4  萝卜与大头菜杂交的天数与胚败育率之间的关系

由表5可以看出，授粉以后前4天和第8天以后的杂种胚珠培养都没有获得成功苗，授粉后第5天至第8天培养均获得成功苗。结果表明萝卜与大头菜属间杂交胚抢救抢救的最佳时期在授粉后第5天至第8天。

表5  不同时间取材胚珠培养结果比较