肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明提供了一种肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒，包括DNA裂解液，PCR反应液，阳性对照，阴性对照，并通过样本的预处理，样本DNA的提取，PCR扩增及PCR产物观察步骤提供了肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒的检测方法，本发明的PCR检测试剂盒设计严谨，同时，此检测方法操作简单快速，灵敏性高，特异性强，结果判定准确客观。

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种适用于检测人体内的肺孢子菌的PCR快速检测试剂盒及其检测方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

由耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci，PJ)引起的人肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)多见于免疫功能低下或缺陷人群，死亡率极高。随着肿瘤化疗患者、接受免疫抑制剂治疗的器官移植者、自身免疫性疾病患者等高危人群的扩大，特别是1984年发现首例艾滋病以来，其发病率呈急剧增加的趋势。PCP是艾滋病患者最主要的并发症和致死原因，被视为艾滋病的“标志病”。

PCP的早期诊断比较困难，其原因在于：患者的临床症状、体征、X线胸片及常规实验室检查均无特异性；患者少痰，即使采用诱痰法，病原体检出率亦较低；血清抗体检测因健康人群抗肺孢子菌抗体阳性率较高而无临床意义；肺组织活检因创伤较大而难以实行等。

目前现有诊断技术主要有：

1、病原学诊断查获包囊为确诊依据。收集痰液或支气管分泌物涂片染色后镜检，虽取材方便但检出率很低。皮穿刺肺活检、支气管镜肺活检开胸肺活检，虽检出率高，但损伤大，因而不常用。此外，该方法对检验人员的业务能力要求较高，人为因素影响大。常用染色方法有姬姆萨、甲苯胺蓝和四胺银染色法等。

2、免疫学诊断。由于大多数正常人都曾有过肺孢子虫隐性感染，血清中都有特异性抗体存在，故检测血清抗体的方法一般不用于肺孢子虫病的诊断。

3、X线检查。卡氏肺孢子虫肺炎典型病例的X线表现为两肺先出现混合性肺泡及间质性改变，以网状结节状浸润为主，从肺门向外周扩展，当病情进展时，可见肺野斑片状实变影，其间常伴有广泛性或局灶性肺气肿和小段肺不张，以肺的外围最为明显。有的斑片状实变影很快融合成大片状均匀致密的浸润影响，病变广泛而呈向心性分布，与肺水肿相似，这一X线表现具有诊断特异性。但该方法不适于疾病的早期诊断，在临床诊疗中意义不大。

发明内容

本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒及其检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒，包括，DNA裂解液，PCR反应液，阳性对照，阴性对照；其中，

所述DNA裂解液含有

Nacl，浓度为120～200mM；

Tris-HCl(pH 8.0)，浓度为10～30mM；

EDTA，浓度为1～20mM；

SDS，体积浓度为2％；

蛋白酶K，浓度50～150μg/μl；

所述PCR反应液成分为：

10×反应缓冲液：包含浓度为300～600mM的KCl，浓度为50～150mM的Tris-HCl(pH 9.025℃)，体积浓度为0.5～1.5％的TritonX-100；

MgCl₂，浓度为15～30mM；

dNTP，浓度为2～3mM；

特异性引物1，浓度为1～20μM；

特异性引物2，浓度为1～20μM；

Taq酶，活性为1～100U/μl；

其中特异性引物1为PCPF，特异性引物2为PCPR，碱基序列分别为：

5′-GATGGCTGTTTCCAGTACTC-3′、

5′-GTGTACGTTGCAAAAGCCCA-3′；

所述阳性对照为肺孢子菌线粒体大亚基rRNA的一段特异性片段克隆得到的质粒；

所述阴性对照为空白去离子水。

进一步地，以上所述的肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒，其中所述DNA裂解液含有：

Nacl，浓度为150mM；

Tris-HCl(pH 8.0)，浓度为20mM；

EDTA，浓度为10mM；

SDS，体积浓度为2％；

蛋白酶K，浓度100μg/μl；

所述PCR反应液成分为：

10×反应缓冲液：包含浓度为500mM的KCl，浓度为100mM的Tris-HCl(pH 9.025℃)，体积浓度为1％的TritonX-100；

MgCl₂，浓度为25mM；

dNTP，浓度为2.5mM；

特异性引物1，浓度为10μM；

特异性引物2，浓度为10μM；

Taq酶，活性为5U/μl。

以上肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、样本的预处理：

取痰或肺盥洗液标本，加等量1mol/L的NaOH，37℃水浴下10～40min，采用转速为6000r/min离心10～20min，弃上清液，沉淀中加生理盐水1～5ml，震荡洗涤沉淀后，以转速6000r/min离心10～20min，如此重复2～10次，最后得到沉淀物备用；

步骤二、样本DNA的提取：

在步骤一中得到的沉淀物中加入DNA裂解液100μl，置40～60℃水浴30～70min，升温至100℃煮沸保持10～20min，6000r/min离心1～5min后备用，取1～10μl裂解后的上清液用于DNA扩增。

步骤三、PCR扩增：

按待检样品数的PCR反应管取PCR反应液与定容的ddH2O，混于一管中组成25μl反应体系，盖紧盖子，在涡旋器上混匀形成反应混合液备用。

把配置好的反应混合液分装到PCR反应管中，取阴性和阳性对照各5μl分别加入标记好的管中，然后取样品各5μl依次加入并标记好，置于PCR仪中进行扩增。

PCR扩增条件为先94℃预变性1～10min，之后94℃变性1～10min、55℃退火1～10min、72℃延伸1～10min、如此进行20～60次循环；再72℃延伸1～10min；

步骤四、PCR产物观察：

称取琼脂糖，配制1.5％的琼脂糖凝胶，用电泳液混匀后在微波炉中加热1～10分钟，待琼脂糖完全融化并冷却到40～80℃左右，按终浓度0.5μg/ml加入溴化乙锭，混匀导入制胶模中，在室温下胶凝固。待胶凝固后拔出梳子，在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10～60分钟，之后在紫外灯下观察结果。若仅有一条300bp的明亮条带，则样品中含有肺孢子菌，反之则无。

本发明的有益效果主要体现在：本发明的PCR检测试剂盒设计严谨，操作简单快速，灵敏性高，特异性强，结果判定准确客观。

附图说明

下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明：

图1：PCR检测肺孢子菌DNA的特异性结果示意图，其中M为标记物，N为阴性对照，P为阳性对照，1～8号分别为烟曲霉菌、隐孢子虫、白色念球菌、巨细胞病毒、弓形虫、大肠杆菌、肺炎支原体及健康大白鼠的肺组织DNA。

图2：PCR检测肺孢子菌DNA的敏感性电泳结果示意图，其中N为阴性对照，P为阳性对照，1～7为1∶10¹～1∶10⁷稀释的肺孢子菌DNA标本。

具体实施方式

本发明揭示了一种肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒及其检测方法。

下面结合实施例详细的进一步说明：

(一)、肺孢子菌特异诊断序列：

肺孢子菌线粒体大亚基rRNA基因，此基因为肺孢子菌的各个种所共有且种间变异最小的一段基因，序列中保守的部分，在NCBI中比对为多个肺孢子菌种所共有，且同源性大于70％，符合属特异检测标准。其序列为：

GTGTACGTTGCAAAGTACTCAGAAGAATTGTGGTAAGTAGTGAAATACAAATCGGGCTAGGATATAGCTGGTTTTCTGCGAAAATTGTTTTGGCAAATTGTTTATTCCTCTAAAAAATAGTAGGTATAGCACTGAATATCTCGAGGGAGTATGAAAATATTTATCTCAGATATTTAATCTCAAAATAACTATTTCTTAA A ATAAATAATCAGACTATGTGCGATAAGGTAGATAGTCGAAAGGGAAACAGCCCAGAACAGTAATTAAAGCTCCCCAATTAATATTAAGTGAAATAAAA

(二)、PCR检测试剂盒的组成：

(1)DNA裂解液：

含不同浓度的Nacl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；各浓度配比为：Nacl 120mM、Tris-HCl(pH8.0)15mM、EDTA 5mM、SDS 1％(w/v)和蛋白酶K 200μg/μl；

(2)PCR反应液：

10×反应缓冲液(不含MgCl₂)；浓度为25mM的MgCl₂；浓度为2.5mM的dNTP；浓度为10μM的特异性引物1；PCPF；浓度为10μM的特异性引物2；PCPR；活性为5U/μl的Taq酶。采用各组分单独包装，使用时进行配置。

其中，反应缓冲液包含浓度400mM的KCl，浓度150mM的Tris-HCl(pH9.025℃)，体积浓度为1％的TritonX-100；

特异性引物1为碱基序列5′-GATGGCTGTTTCCAGTACTC-3′的PCPF，

特异性引物2为碱基序列5′-GTGTACGTTGCAAAAGCCCA-3′的PCPR；

(3)阳性对照：

1支肺孢子菌线粒体大亚基rRNA的一段特异性片段克隆得到的质粒。

(4)阴性对照：

空白去离子水。

(三、)PCR扩增：

取10个样本，1标号为N，为阴性标准品，2标号为P，为阳性标准品，待测样本编号1～8，分别为烟曲霉菌、隐孢子虫、白色念球菌、巨细胞病毒、弓形虫、大肠杆菌、肺炎支原体及健康大白鼠的肺组织DNA。用建立的扩增体系分别对其进行PCR扩增。其中扩增体系为25μl反应体系，包括以下溶液，

在此体系配置过程中，所需的dNTP的4种物质的浓度为各200μM；PCPF和PCPR的浓度各40pM；Mg2+浓度为1.5mM；Taq酶浓度活性为0.04U/μl。

扩增条件为先94℃预变性5min，之后94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，如此循环40次，之后再经过72℃延伸7min。

扩增产物用1.5％的琼脂糖进行点用分析，结果如图1所示，在凝胶成像系统上观察结果。

(四)、试剂盒敏感性实验：

将含2.1×10⁵个肺孢子菌包囊的大鼠肺匀浆液制备成的肺孢子菌DNA模板，依次按10倍梯度稀释后，分成1～7份，作为七个待测样本，取各稀释度的DNA模板进行PCR扩增，反应条件同特异性检测PCR扩增(三)中的条件，同时设阴性对照。产物用1.5％的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像系统上观察结果。结果表明随着稀释度的增加，目的DNA片段亮度逐渐减弱。PCR在稀释度为105时仍出现目的条带(相当于所加模板中含5.3×10-2个包囊或每毫克肺组织含1.3×10-1个包囊)。结果如图2所示，在凝胶成像系统上观察结果。

(五)、试剂盒的稳定性和重复性试验：

阳性模板，PCR反应液，Taq酶在-20℃条件下贮存，裂解液、溴酚蓝等其它物品4℃保存即可。当贮存条件为30天、60天、100天、150天、200天时取出各组分，用已知PCR阳性的样品检测试剂盒稳定性。另外，取15份PCR阳性样本，用此试剂盒重复试验3次，取15份PCR阴性样本同样重复3次，扩增条件如前所述。结果表明，在以上各时段取出的组分在已知PCR阳性样品和15份PCR阳性样本均得到了一条明亮特异的目的带，而空白对照和15份阴性样品均无任何扩增带，故此试剂盒稳定性和重复性良好。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1)、利用PCR的特异性检测方法，根据分析诊断序列设计特异引物，通过优化扩增条件来提高其敏感性，电泳分析直接观察扩增结果。

2)、本发明试剂盒设计严谨，简单易操作，灵敏性高，特异性强，结果判定准确客观。

本发明尚有多种具体的实施方式，凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。