一种海洋有机物降解葡萄球菌菌株HGMC412及其应用

摘要

本发明公开了一种海洋有机物降解葡萄球菌菌株，该菌株属于葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)，保藏名称：葡萄球菌HGMC412，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2009年8月28日，保藏号：CCTCC NO：M209185。该菌株具有高效有机物降解能力，能快速有效的去除受有机物污染海水中的有机物，并且对海水养殖生物没有毒害致病作用。本发明对去除海水养殖环境中高浓度有机物污染具有安全、环保、高效的特点。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋有机物降解葡萄球菌菌株(Staphylococcus sp.)及其在处理有机物污染海水中的应用。

背景技术

近年来，在海水网箱养殖产业飞速发展的同时，养殖“自身污染”问题日益凸现出来，其中养殖过程产生的有机物污染物常常会引发海水网箱养殖的水体发臭、沉积环境恶化，导致水中溶解氧降低，养殖鱼类死亡，水体生态平衡破坏。

海水网箱养殖系统作为一种高密度、高投饵的人工养殖生态系统，影响养殖环境最根本的原因在于养殖过程中产生的大量残饵、粪便及死亡动植物残骸等有机物的沉积。目前的物理和化学去除有机污染物方法都存有一定的局限性。其中物理方法存在效率低下，成本高的缺点；化学方法虽然见效快，但常引起二次污染。为达到对有机污染物快速、高效去除，本发明从海水养殖环境沉积物中富集分离纯化获得一株微生物，并用于对有机物污染的有效治理。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种海洋有机物降解葡萄球菌属菌株，该菌株具有高效有机物降解能力，能快速有效地去除海水环境中的有机物。

本发明的第二个目的在于提供上述海洋有机物降解葡萄球菌菌株在处理海水环境中有机物污染的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种海洋有机物降解葡萄球菌菌株，该菌株属于葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)，保藏名称：葡萄球菌HGMC412，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏日期：2009年8月28日，保藏号：CCTCC NO：M209185。

所述海洋有机物降解葡萄球菌菌株的筛选分离鉴定过程为：取海水网箱养殖场区的沉积物，在实验室利用选择培养基培养后，分离纯化菌株，根据菌株对饵料有机物降解能力的强弱，最终筛选出一株对饵料有机物有较强降解能力的菌株，编号为HGMC412，然后根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征，及其16SrDNA基因序列经与Genbank中已登陆的基因序列进行对比分析发现，菌株HGMC412经鉴定为葡萄球菌属，命名为葡萄球菌(Staphylococcus sp.)HGMC412。

本发明的第二个目的在于提供上述海洋有机物降解葡萄球菌菌株在处理有机物污染海水中的应用。

在处理有机物污染海水中的具体过程为：取经上述分离纯化的葡萄球菌(Staphylococcus sp.)HGMC412单菌落，于活化扩大培养基中培养40-48h，按海水与菌液体积比为40-60∶1，将葡萄球菌(Staphylococcus sp.)HGMC412接种于含饵料有机物的海水中，25-28℃恒温振荡培养1-7d。

上述活化扩大培养基的组成优选为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸高铁0.1g，陈海水1000mL，pH 7.6-8.2，121℃灭菌20min。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明从海水网箱养殖区沉积物中筛选得到的新菌株，对饵料有机物有较强的降解能力，在1-5d内对饵料有机物的COD去除率达36.5～50.5％。

附图说明

图1是菌株HGMC412的菌株电镜图片；

图2是菌株HGMC412的PCR产物琼脂糖电泳图；

图3是投加菌株HGMC412的高浓度饵料有机物海水中的可生化降解性(BOD/COD₀)；

图4是投加菌株HGMC412的高浓度饵料有机物海水中的生化耗氧量(BOD)变化图；

图5是投加菌株HGMC412的高浓度饵料有机物海水中的化学耗氧量(COD)变化图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1海水有机物降解菌株的筛选方法：

一、材料准备

1、菌源和实验废水

(1)菌源有20多年养殖历史的深圳市大鹏澳海水鱼类网箱养殖场区的沉积物。

(2)实验废水(含高浓度饵料有机物海水)：杂鱼糜5g，陈海水1000mL，pH 7.6～8.2，121℃灭菌20min。

2、培养基

(1)选择培养基：杂鱼糜20g，陈海水1000mL，pH 7.6～8.2，121℃灭菌20min。

(2)分离及斜面培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.1g，琼脂粉20g，陈海水1000mL，pH 7.6～8.2。

(3)活化扩大培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.1g，陈海水1000mL，pH 7.6～8.2。

3、实验仪器和设备

美国HACH BOD Trak测定仪；

广东海利电磁式空气压缩机ACO-009E；

苏州安泰超净工作台SW-CJ-1BU；

上海精宏生化培养箱SHP-150；

苏州欧倍振荡培养箱OBS-2F；

德国HYDRO-BIOS-KIEL采泥器；

日本HIRAYAMA高压灭菌器HVN-85；

日立H-7650透射电子显微镜；

PC818型PCR仪；

电泳仪及电泳槽；

加热板及滴定仪；

凝胶紫外观测仪等。

二、菌株的分离与筛选

1、菌株的富集

取大鹏澳海水鱼类网箱养殖场沉积物表层以下5cm处的沉积物放入采样袋，再放入0℃冰盒中带回实验室。取250g沉积物加到2L的富集瓶中，加入750mL灭选择培养基，并加入适量的纤维棉，在室温条件下连续曝气富集培养2个月，中间据情况不定期添加灭菌海水和选择培养基。

2、有机物降解细菌的分离纯化

挑选并直接冲洗细菌附着量较大的纤维棉，得到富集菌液，适当稀释，均匀涂布于分离培养基平板上，28℃培养3d，待菌落长出后，挑取形态各异的单菌落，在分离培养基平板上进行划线分离，直至得到纯的单菌落。将分离纯化的细菌接种至斜面培养基中并于冰箱4℃保存。

3、有机物降解细菌的筛选

通过用BOD及COD_Mn值来衡量菌株对饵料有机物的利用能力，以有机物的可生化降解性(BOD₅/COD₀)来表示5d时间里细菌利用饵料有机物的降解能力。

取分离纯化得到的菌株于活化扩大培养基中25-28℃培养40-48h，按海水与菌液体积比40-60∶1，接种到含高浓度饵料有机物的海水中，取不接种菌液的饵料有机物海水作为空白对照，25-28℃温度振荡培养，反应时间1-5d。

经过筛选获得一株编号为HGMC412的菌株，即海洋有机物降解菌株HGMC412。

实施例2海洋有机物降解菌株HGMC412的鉴定

1、对海洋有机物降解菌株HGMC412的鉴定

对海洋有机物降解菌株HGMC412进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。

16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：

①细菌核DNA的提取：

1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜，取1.5mL菌液于Eppendorf管内，8000rpm室温离心5min，彻底除去上清。

2)加STE缓冲液1.5mL洗涤一次，离心弃上清，再加入0.6mLTE溶液，重悬细菌。

3)加30μL10mg/mL的溶菌酶，37℃水浴45min。

4)加65μL10％的SDS，20mg/mL的蛋白酶K3μL，50℃水浴2h，至溶液变清。

5)加入等体积酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白质为止。

6)在上清液中加入1/10体积的3M的NaAc(pH5.2)。

7)加入等体积的异丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒缠绕挑出DNA细丝，再用70％的乙醇洗涤一次，自然晾干，并将DNA溶于100μLTE溶液中。

8)加入终浓度为50μg/mL的Rnase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存备用。

②16S rDNA基因的PCR扩增

P1：27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)

P2：1492R(5′-AAG TCG TAACAAGGT AAC C-3′)

在50μL的反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1ug)，0.5μLP1和P2(终浓度为0.5μM)，1μL dNTP(每种NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。

③PCR产物的回收

将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10min后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。

①16S rDNA的部分序列测定和分析

P-f：CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；

P-r：GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。

加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR扩增30个循环(94℃1min，55℃30s，72℃2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在AppliedBiosystem373 A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。

2、16S rDNA序列测定

本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1512bp的扩增带用1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列。

AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GATGAACGCT GGCGGCGTGC CTAATACATG CAAGTCGAGC    60

GAACAGACGA GGAGCTTACT CCTCTGACGT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA ACACGTGGAT    120

AACCTACCTA TAAGACTGGG ATAACTTCGG GAAACCGGAG CTAATACCGG ATAACATGTT    180

GAACCGCATG GTTCAACAGT GAAAGACGGT CTTGCTGTCA CTTATAGATG GATCCGCGTC    240

GCATTAGCTA GTTGGTAAGG TAACGGCTTA CCAAGGCAAC GATGCGTAGC CGACCTGAGA    300

GGGTGATCGG CCACACTGGA ACTGAGACAC GGTCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG    360

GGAATCTTCC GCAATGGGCG AAAGCCTGAC GGAGCAACGC CGCGTGAGTG AAGAAGGTCT    420

TCGGATCGTA AAACTCTGTT ATTAGGGAAG AACAAATGTG TAAGTAACTA TGCACGTCTT    480

GACGGTACCT AATCAGAAAG CCACGGCTAA CTACGTGACA GCAGCCGCGG TAATACGTAG    540

GTGGCAAGCG TTATCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGCGCGC GTAGGCGGTT TTTTAAGTCT    600

GATGTGAAAG CCCACGGCTC AACCGTGGAG GGTCATTGGA AACTGGAAAA CTTGAGTGCA    660

GAAGAGGAAA GTGGAATTCC ATGTGTAGCG GTGAAATGCG CAGAGATATG GAGGAACACC    720

AGTGGCGAAG GCGACTTTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAT GTGCGAAAGC GTGGGGATCA    780

AACAGGATTA GATACCCTGG TAGCCCACGC CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGGGGG    840

TTTCCGCCCC TTAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGACCGC    900

AAGGTTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGA CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA    960

TTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAAAT CTTGACATCC TCTGACCCCT CTAGAGATAG    1020

AGTTTTCCCC TTCGGGGGAC AGAGTGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG    1080

TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTA AGCTTAGTTG CCATCATTAA    1140

GTTGGGCACT CTAAGTTGAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA    1200

TCATCATGCC CCTTATGATT TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGACAATA CAAAGGGTAG    1260

CGAAACCGCG AGGTCAAGCA AATCCCATAA AGTTGTTCTC AGTTCGGATT GTAGTCTGCA    1320

ACTCGACTAC ATGAAGCTGG AATCGCTAGT AATCGTAGAT CAGCATGCTA CGGTGAATAC    1380

GTTCCCGGGT CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCACGAGA GTTTGTAACA CCCGAAGCCG    1440

GTGGAGTAAC CTTTTGGAGC TAGCCGTCGA AGGTGGGACA AATGATTGGG GTGAAGTCGT    1500

AACAAGGTAACC                                                         1512

实施例3海洋有机物降解菌株HGMC412菌落形态、生理和生化特征

海洋有机物降解菌株HGMC412菌落形态、生理和生化特征见表1-1；细胞形态见图1。

表1-1海洋有机物降解菌株HGMC412的菌落形态特征以及主要的生理生化特征

备注：“+”：90％以上的菌株为阳性，“-”：90％以上的菌株为阴性。

实施例4海洋有机物降解菌株HGMC412的确定

将海洋有机物降解菌株HGMC412长度为1512bp的16S rDNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对分析，海洋有机物降解菌株HGMC412与葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)菌株的同源性高达97.5％以上。综合菌株的生理生化及分子鉴定结果，可确定海洋有机物降解菌株HGMC412为葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)，菌株HGMC412命名为葡萄球菌(Staphylococcus sp.)HGMC412(即海洋有机物降解菌株HGMC412)。葡萄球菌(Staphylococcus sp.)HGMC412已于2009年8月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：葡萄球菌(Staphylococcus sp.)HGMC412 CCTCC NO：M209185，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。

本发明分离、筛选的海洋有机物降解菌株HGMC412，具有较强的有机物降解能力。这就拓宽了人们对葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)在其功能方面的应用研究思路，并为去除受有机物污染海水中的有机物提供了有用的菌源和技术，并且对海水养殖生物没有毒害致病作用，具有安全、环保和高效的实际应用价值。

实施例5海洋有机物降解菌株HGMC412的应用

应用实例一：

取经分离纯化的葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)HGMC412单菌落，于活化扩大培养基中培养40-48h，按海水与菌液体积比为40-60∶1，接种到含饵料有机物的海水中，设空白对照，搅拌子搅拌培养，培养温度25-28℃，连续监测饵料有机物海水的BOD(生化耗氧量)，反应2-7d。

从图4可以看出，接种葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)HGMC412菌株的饵料有机物海水中的BOD随时间逐渐增大，5d达最高值，6-7d维持稳定。葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)HGMC412菌株在5-7d对有机物有较强的降解能力。

应用实例二：

取经分离纯化的葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)HGMC412单菌落，于活化扩大培养基中培养40-48h，按海水与菌液体积比为40-60∶1，接种到含饵料有机物的海水中，设空白对照，搅拌子搅拌培养，培养温度25-28℃，连续监测饵料有机物海水中的COD(化学耗氧量)，反应1-5d。

从图5可以看出，接种葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)HGMC412菌株的饵料有机物海水中的COD随时间而减少，3d后降为最低，海水中的COD去除率为50.3％。

应用实例三：

取经分离纯化的葡萄球菌(Staphylococcus sp.)HGMC412单菌落，于活化扩大培养基中培养40-48h，按海水与菌液体积比为40-60∶1，接种到装有2L过滤海水的玻璃圆缸中，并以不加菌液的过滤海水为对照，分别放养有40尾体长约1cm的班节对虾(Penaeus monodon)虾苗和20尾体长约3cm的黑鲷(Sparusmacrocephalus)仔鱼，各分3个平行实验组，水温25-28℃，96h后，经统计分析虾苗存活率在75.5％～85％，仔鱼存活率在在75.5％～85％，存活率在实验组与对照组的之间无显著差异。可见，葡萄球菌(Staphylococcus sp.)HGMC412对海水养殖生物没有毒害致病作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。