一种李斯特菌噬菌体溶壁酶及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及属于生物工程领域，特别涉及一种李斯特菌噬菌体溶壁酶(Endolysin或称裂解酶)及其作为食品添加成分在食品中的应用；一种李斯特菌噬菌体溶壁酶，其特征在于其氨基酸序列为Seq ID NO.2。利用生物工程技术开发能够高效杀灭李斯特菌的酶制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种食源性李斯特菌，为目前防控食品中李斯特菌污染提供一种安全、无毒副作用的酶制剂来源。

说明书

技术领域

本发明涉及属于生物工程领域，特别涉及一种李斯特菌噬菌体溶壁酶(Endolysin或称裂解酶)及其作为食品添加成分在食品中的应用，尤其是能够特异性裂解食品中污染的多种李斯特菌溶壁酶的应用。

背景技术

李斯特菌(Listeria)是一种能够引起动物和人李斯特菌病的革兰氏阳性细菌，目前国际公认的李斯特菌共有六个种，其中单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是最重要的食源性人兽共患病原菌。调查研究表明，96％的李斯特菌病例都是由Lm中1/2a，1/2b和4b血清型引发的，主要表现为胃肠炎、败血症、脑膜脑炎和流产等，死亡率高达25-30％。在自然界中，Lm通常存在于土壤、河水、植物、屠宰场废弃物及动物源食品中(肉、奶及其制品、海产品等)，且与大多数人源病原菌不同的是Lm在低温环境中仍可生长繁殖(如2～8℃)，是冷藏食品以及即食(Ready-To-Eat，RTE)食品中威胁人类健康的重要病原菌之一。

噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称毒性噬菌体。溶壁酶(Endolysin)是双链DNA噬菌体所特有的，是在感染宿主晚期由噬菌体表达的一类肽糖水解酶，该酶通过水解细菌细胞壁肽糖上糖与肽间的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连键最终使宿主细胞裂解。溶壁酶不仅特异性作用于宿主，且作用时间短，作用谱较噬菌体广。溶壁酶具有高效、特异且不产生抗性等特点，目前在食品及医药行业已有成功应用的报道。李斯特菌噬菌体endolysin能够特异性裂解李斯特菌，因而具有杀菌作用。在食品中，李斯特菌溶壁酶能够作为抗菌剂来控制细菌污染，具有潜在的开发和应用价值。

发明内容

发明目的

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码李斯特菌噬菌体溶壁酶。

技术方案

一种李斯特菌噬菌体溶壁酶，其特征在于其氨基酸序列为Seq ID NO.2。

一种李斯特菌噬菌体溶壁酶的编码基因，其特征在于其核苷酸序列为Seq ID NO.1。

一种表达李斯特菌噬菌体溶壁酶的制备方法，其特征在于步骤1)中采用引物5’-A TATGGA TCC ATG GTA AAA TAT ACC-3’见Seq ID NO.3和引物5’-A AGT AAG CTT TTA TTTCTT GAT AAC TGC TCC-3’见Seq ID NO.4从李斯特菌噬菌体基因组中扩增李斯特菌噬菌体溶壁酶基因；

具体步骤如下

1)从李斯特菌噬菌体基因组中扩增李斯特菌噬菌体溶壁酶基因；

2)构建表达李斯特菌噬菌体溶壁酶的重组表达载体；

3)将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到表达李斯特菌噬菌体溶壁酶的工程菌；

4)异丙基1-1硫代-β呋哺半乳糖苷诱导表达，获得重组基因表达产物；

5)将重组基因表达产物，经镍柱亲和层析纯化分离，得到重组的李斯特菌噬菌体溶壁酶lysZ5；

6)将纯化的溶壁酶lysZ5产物经去毒素试剂盒进行去毒处理(≤0.01EU/μg内毒素)。

所述的一种李斯特菌噬菌体溶壁酶的应用，其特征在于用于抑制李斯特菌污染和过度生长的量。

所述的一种李斯特菌噬菌体溶壁酶的应用，其特征在于将纯化的溶壁酶产物制成稀释液，用于对食品、生产环境或生产器具，防止食品加工过程中造成的李斯特菌污染。

所述的一种李斯特菌噬菌体溶壁酶的应用，其特征在于所述的食品为由肉类，或蛋类，或奶制品，或粮食，或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

所述的一种李斯特菌噬菌体溶壁酶的应用，其特征在于以重组表达的李斯特菌噬菌体溶壁酶产物制成杀菌剂。

所述的一种李斯特菌噬菌体溶壁酶的应用，其特征在于：将纯化的溶壁酶产物与赋形剂复配后，用来抑制食品中李斯特菌的污染。

所述原核细胞表达载体为pET-28a(+)。

所述溶壁酶基因被插入pET-28a(+)的EcoRI和Hind III酶切位点。

所述的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，培养温度为37℃。

所述诱导表达所用的诱导剂为IPTG，诱导浓度为0.1～1.0μmol/L，诱导表达的温度为28～30℃。

所述的分离纯化步骤包括镍亲和层析。

有益效果

利用生物工程技术开发能够高效杀灭李斯特菌的酶制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种食源性李斯特菌，为目前防控食品中李斯特菌污染提供一种安全、无毒副作用的酶制剂来源。

附图说明

图1溶壁酶LysZ5基因的构建和鉴定

泳道1：pET28a(+)载体EcoRI酶切鉴定

泳道2：重组质粒pET-lysZ5 EcoR I/HindIII双酶切鉴定

M：1Kb DNA ladder

图2重组溶壁酶LysZ5表达产物的鉴定分析

泳道1：诱导表达DE3(pET-IysZ5)0.5mM IPTG

泳道2：诱导表达DE3(pET-lysZ5)1.0mM IPTG

M：蛋白分子质量Maker

图3重组溶壁酶LysZ5对李斯特菌的杀菌能力分析

图4重组溶壁酶LysZ5在食品的中杀菌效果分析

具体实施方式

本发明试验用噬菌体宿主菌单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，保藏号：GIM1.228)、威尔氏李斯特菌(Listeria welshimeri，保藏号：GIM 1.231)及英诺克李斯特菌(Listeria innocua，保藏号：GIM 1.230)购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。副伤寒沙门菌(ATCC 50073)、肠炎沙门菌(ATCC 13073)以及大肠杆菌(ATCC 25922)均购自美国标准菌种收藏中心(ATCC)。绵羊李斯特菌Lv-31(Listeria ivanovii)本室分离鉴定并保存。

实施例1：溶壁酶LysZ5基因(lysZ5)的克隆、表达载体的构建

a、首先通过PGE/NaCl方法沉淀并获得高纯度的李斯特菌噬菌体(保藏号：CCTCC M2010003)，再用λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒(BIOMED)提取其基因组DNA(具体按试剂盒说明进行)；

设计一对特异性引物：

Z5-1：5’-A TAT GGA TCC ATG GTA AAA TAT ACC-3’

Z5-2：5’-A AGT AAG CTT TTA TTT CTT GAT AAC TGC TCC-3’；

用上述特异性引物扩增全长序列，1％琼脂糖电泳，鉴定扩增片段的大小；

b、切胶回收(1kb片段)扩增正确的目的片段，胶回收试剂盒将片段纯化回收，并将该片段与pUM-T载体于16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的平板，并将转化的阳性克隆进行测序鉴定，将其命名为溶壁酶LysZ5基因，其核苷酸序列为Seq ID NO.1；

c、将测序列正确的片段用限制性内切酶EcoR I和HindIII进行双酶切，37℃，水浴孵育2h，1％琼脂糖电泳，胶回收试剂盒将片段纯化回收，并将该片段与pET28a(+)载体于16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将转化的菌液涂布于含有卡纳青霉素(100μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜；

d、阳性克隆的鉴定挑取阳性克隆接种于含卡纳青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养过夜后，碱裂法提取质粒，用EcoR I和HindIII进行双酶切鉴定，同时用EcoR I单酶切的pET-28a(+)空质粒作为对照。将鉴定正确的质粒命名为pET-lysZ5，重组菌命名为DE3(pET-lysZ5)。

结果如图1所示，重组质粒pET-lysZ5用EcoR I和HindIII进行双酶切后，分别在5.4kb和1kb处出现pET28a(+)载体带和lysZ5基因带，大小与预期相符，表明构建正确。

实施例2：溶壁酶LysZ5蛋白的诱导表达及纯化

将重组菌DE3(pET-lysZ5)接种到含卡纳青霉素(100μg/mL)的LB培养液中，37℃振荡过夜培养；次日，按1∶100比例转接至100mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值约为0.5时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，28℃诱导5h。收集菌体，超声波破碎细胞，4℃，10,000rpm/min离心10min，收集上清，并将上清经0.22μm滤膜过滤，SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表达情况。将过滤的裂解上清用His亲和层析镍柱(GE Healthcare，Sweden)纯化，具体按试剂盒说明步聚进行。获得蛋白命名为溶壁酶lysZ5，将纯化的溶壁酶lysZ5产物经去毒素试剂盒(Novagen公司)进行去毒处理(≤0.01EU/μg内毒素)。

SDS-PAGE分析结果如图2所示，重组菌DE3(pET-lysZ5)经IPTG诱导后，其上清中在约42kD的位置有较粗的诱导蛋白条带，与预期大小相符，从而表明，重组菌DE3(pET-lysZ5)构建正确，且表达的溶壁酶蛋白产物LysZ5为可溶性蛋白。

实施例3：重组溶壁酶LysZ5特异性裂解李斯特菌

将单核细胞增生性李斯特菌ATCC 19114培养至OD₆₀₀＝0.8，用PBS洗涤后重悬，取900μl，加入100μl(50μg)纯化的溶壁酶产物，混匀，室温下作用1h，用分光光度计动态测定菌液的OD₆₀₀值，OD₆₀₀的下降表明细菌被裂解。

结果如图3所示，纯化的溶壁酶LysZ5产物对单核细胞增生性李斯特菌具有良好的裂解活性。

实施例4：溶壁酶LysZ5的酶谱分析

将TSA-YE(含0.6％酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂)平板分为若干个区域，吸取不同宿主菌过夜培养物：单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，ATCC 19114)、威尔氏李斯特菌(Listeria welshimeri，GIM 1.231)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua，GIM 1.230)、绵羊李斯特菌Lv-31(Listeria ivanovii，本室分离鉴定并保存)0.1mL滴于TSA-YE平板正中央，将菌液均匀地涂开，30℃培养1h；同时将副伤寒沙门菌(ATCC 50073)、肠炎沙门菌(ATCC13073)以及大肠杆菌(ATCC 25922)0.1mL滴于TSA-YE平板并涂布均匀；取溶壁酶产物10μL，分别滴加于涂有不同宿主菌的平板中，正放待自然晾干后，分别置于30℃和37℃温箱培养10h后，观察溶壁酶产物对不同宿主菌的裂解作用。

结果表明，溶壁酶产物仅对单核细胞增生性李斯特菌、威尔氏李斯特菌、英诺克李斯特菌和绵羊李斯特菌有特异性裂解活性，而对其他种属菌株无反应。

实施例5：溶壁酶LysZ5在食品中的灭菌作用

将巴氏杀菌牛奶分装为两组，A组接种宿主菌10⁴cfu/mL，加入100μg的溶壁酶LysZ5蛋白；B组中仅加入10⁴cfu/mL宿主菌作为对照，将制备好的样品分别置于25℃，分别于30min和60min检测宿主菌数量。

结果如图4所示，25℃作用30min后，宿主菌数量有所下降；至60min后，宿主菌数量下降约3log₁₀，与对照组呈显著性差异，从而表明溶壁酶LysZ5在食品中有良好的杀菌作用。