牙根根尖充填材料及其制备方法

摘要

一种牙根根尖充填材料，包括：天然羟基磷灰石、粒径为0～50μm且平均粒径为2～8μm的磷酸四钙、平均分子量为3万～5万聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠，其质量百分比为35%～44%：35%～44%：7%～9%：1.5%～2.5%：1.5%～2.5%，天然羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠经混合、研磨并过200目筛后形成牙根根尖充填材料。制备方法，将天然羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠进行混合、研磨并过200目筛后得到牙根根尖充填粉体，隔湿保存，备用；以离子水、PEG400或甘油为液相，将制备的粉体与液相按照4～5：1的质量比调拌、充填模具，制备出牙根根尖充填材料。

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备硬组织修复材料及其方法，尤其涉及一种牙根根尖充填材料及其制备方法。

背景技术

牙髓病、根尖周病不仅是口腔内科临床常见的疾病，也是引起患者剧烈疼痛的口腔疾病。如果它们得不到及时的诊治或治疗不当，可造成患者的剧烈疼痛，导致患牙的拔除，影响患者的咀嚼及美观功能等；甚至还会成为口腔病灶，引起亚急性细菌性心内膜炎、风湿性或类风湿性关节炎、肾小球肾炎等，从而对患者的身心健康带来巨大痛苦。

根管治疗术(root canal therapy，RCT)是治疗牙髓病及根尖周病的一种方法，其成功有效率在85％以上，是目前国内外所公认保存患牙的最好治疗方法。但还有一部分病例仅采用根管治疗术难以治愈，必须辅以外科手术，这些由两种方法结合起来的保存患牙的治疗技术称根管外科手术(endodontic surgery)。据估计美国在1999年就约有530万患者要进行牙髓病的治疗，其中约有5.5％以上的患者要进行根管外科手术。在我国，由于人们对口腔保健意识及口腔内科诊疗水平的迅速提高，使得该项治疗技术日益受到学者们的广泛关注，因此根管外科手术具有十分重要的研究前景及临床应用价值。

根尖切除术及根尖倒充填术是最常用、最重要的根管外科手术。相对于单纯的根管治疗术而言，其临床操作复杂，且预后疗效不确定因素显著增加。它的成功率不仅与患牙状况、手术方式等因素密切相关，而且根尖充填材料的选择往往是上述手术成功的重要因素之一。因为根尖充填材料不仅要封闭根尖制备的洞形，起到物理性的封闭作用，而且理想的根尖充填材料还能促进牙骨质在其表面沉积，达到生理性及物理性双重封闭的效果。

理想的根尖充填材料应该具备：对牙体组织具有粘结性，并能三维封闭根尖断端；最好能抑制细菌生长；体积稳定，并且不受潮湿等因素的影响；根尖周组织耐受，不会引起炎症反应；对机体无害；刺激正常根尖周组织的再生；耐腐蚀；不使牙体或根尖周组织染色；X线阻射，便于鉴别；保存时间长，易于操作等。目前在临床上采用的根尖充填材料种类众多，其中较为常用的根尖充填材料有：银汞合金、氧化锌、玻璃离子水门汀、复合树脂及MTA等，但这些根尖充填材料均具存在一些显著的缺点。例如：银汞合金由于汞的毒性及较差的生物相容性，现已属将要淘汰的材料；氧化锌、玻璃离子水门汀、复合树脂等材料虽具有较好的生物相容性及理化性能，能形成较好的物理性的封闭根管外科制备的洞形，但他们的共同缺陷是不具备生物活性，不能促进牙骨质在其表面沉积，不能达到生理性的封闭根尖端的效果；MTA虽然是一种较为理想的生物活性材料，具有可湿固化性、良好的封闭性、生物相容性及生物活性等显著优点，但其也存在固化时间长(3h)、碱性大(pH值：10-12)、对牙体组织粘结性小、价格高(约800元/克)、全进口材料等缺陷。因此，到目前为止，还没有一种理想的根尖充填材料出现。

发明内容

本发明目的是在于提供一种牙根根尖充填材料及其制备方法，本发明成型后的材料具有抗压强度高，抗稀散性好、亲水性及生物相容性能，X-射线显示性能好及不可吸收的优点。

本发明的技术方案是：

本发明所述的一种牙根根尖充填材料，包括：天然羟基磷灰石、粒径为0～50μm且平均粒径为2～8μm的磷酸四钙、平均分子量为3万～5万聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠，其质量百分比为35％～44％：35％～44％：7％～9％：1.5％～2.5％：1.5％～2.5％，所述天然羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠经混合、研磨并过200目筛后形成牙根根尖充填材料。

本发明牙根根尖充填材料的优化技术方案是：所述牙根根尖充填材料由天然羟基磷灰石、粒径为0～50μm且平均粒径为2～8μm的磷酸四钙、平均分子量为3万～5万聚丙烯酸、柠檬酸、柠檬酸钠及硫酸钡组成，硫酸钡的加入量为天然羟基磷灰石、粒径为0～50μm且平均粒径为2～8μm的磷酸四钙、平均分子量为3万～5万聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠总质量的0％～20％。

本发明所述的一种牙根根尖充填材料的制备方法，

步骤1将天然羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠进行混合、研磨并过200目筛后得到牙根根尖充填粉体，隔湿保存，备用；

步骤2以离子水、PEG400或甘油为液相，将步骤1)制备的粉体与液相按照4～5∶1的质量比进行调拌、充填模具，制备出牙根根尖充填材料。

本发明的进一步优化技术措施是：在天然羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠中加入硫酸钡后再进行混合、研磨并过200目筛。

本发明具有如下优点：

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是人体骨骼及牙齿等硬组织的主要无机成分，安全无毒，具有良好生物活性，被认为是最有前途的人工齿和人工骨置换材料。早在1976年，日本的青木与美国的Jarcho分别人工合成了羟基磷灰石，开创了羟基磷灰石生物医学材料研究和应用的新领域；1980年东京齿科医科大学开始将羟基磷灰石人工齿根应用于临床。目前，羟基磷灰石的陶瓷材料、金属涂层材料和与有机物的复合材料已成为临床上最重要的牙齿、骨骼等硬组织修复用材料。但羟基磷灰石也存在骨诱导作用弱、成型能力差、脆性大、加工困难、颗粒型羟基磷灰石易移位等缺陷。为了克服上述羟基磷灰石的缺点，本课题组将其与聚丙烯酸、磷酸四钙、柠檬酸等材料复合从而制备出具有良好的理化性能及生物相容性，可用作根尖充填材料、牙齿髓室底穿、根管侧穿修补材料及直接或间接的盖髓材料。

聚丙烯酸(Polyacrylic acid，PAA)呈弱酸性，是齿科水门汀(聚羧酸锌水门汀及玻璃离子水门汀，分子量一般为5万左右)固化液的主要成分之一。羟基磷灰石虽然不能与聚丙烯酸发生酸碱反应，但聚丙烯酸的羰基(-COOH)与羟基磷灰石中的Ga2+进行配位络合，从而增强其材料的机械强度。但聚丙烯酸酸性对细胞具有一定的毒性作用，例如Umemo Kozo等对聚丙烯酸的细胞毒性研究显示：浓度小于0.1％的聚丙烯酸溶液不影响人牙髓细胞的生长，但当其浓度达到0.2％时，其细胞毒性显著增加。

为了降低复合材料的酸性，本课题在复合材料中添加磷酸四钙(tetracalciumphosphate，TTCP)。磷酸四钙是磷酸钙骨水泥的重要成分之一，呈碱性，具有很强的生物活性，遇水后可生成羟基磷灰石及氢氧化钙，这两种产物及磷酸四钙均具有良好的生物相容性。将磷酸四钙引入到本材料中，一方面能中和聚丙烯酸的酸性，调节反应速度，确定材料的固化时间，另外，磷酸四钙遇水固化，可使我们研制的材料具有可湿固化性，利于该材料在临床上的应用。

磷酸四钙与聚丙烯酸发生酸碱反应生成的聚丙烯酸钙可溶于水，因此材料可在体内降解。为了克服这一缺陷，我们在材料配伍中添加适量的柠檬酸及其酸盐，调节反应速度，降低材料的溶解性。

1)羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料固化反应后的主要成分是羟基磷灰石及羧酸钙钙盐组成，并随着固化时间的延长，未反应完全的磷酸四钙逐渐转化为羟基磷灰石。

2)良好的抗稀散性能：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料在PBS液中固化，材料周围无碎屑出现，未见崩解现象。

3)较为理想的固化时间：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸的固化时间为11.03±0.78min，适合于口腔临床操作要求。

4)抗压强度较高，达到根尖充填材料的要求：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸固化1d后，其抗压强度即达到30.96±6.57MPa；固化7d后，其抗压强度分别达到57.46±12.77MPa，基本达到根尖充填材料的抗压强度要求；

5)pH值呈弱碱性，适合于体内植入：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸的pH值在6.13～8.37之间，呈弱碱性，与人体牙齿及骨骼组织的pH值相近。

6)较小的接触角：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸的接触角约为21.55±2.65°，提示该材料具有较好的亲水性，利于细胞在材料表面的粘附。

7)良好的生物相容性：我们按照GB/T 16886-ISO 10993中推荐的细胞生长抑制法，采用MTT及结晶紫等两种比色法检测羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的细胞毒性，这两种比色法结果均显示羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的细胞毒性评级为0级，细胞生长状况良好，与阴性对照组无明显差别；细胞形态学观察结果显示L-929细胞能在羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸样品材料表面生长良好。上述实验结果均提示该材料具有良好的生物相容性。

8)羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料固化后的主要成分是羟基磷灰石，其X线阻射性能与牙本质层相近，在材料固相粉体组分中添加0～20％硫酸钡，可显著提高该材料的X-线阻射性能，易与牙体组织相鉴别。

9)该材料固相粉体与PEG400或甘油按固液相质量之比为4～5∶1进行混合、调拌，即可制备出两种预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料，其具有混合均匀、随意塑形、抗稀散性、节约手术时间、遇水固化等较好临床可操作性能。

10)多种用途：除主要用于根尖充填材料外，羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料还可用于牙齿髓室底穿、根管侧穿修补材料、直接或间接的盖髓材料等。

11)生产成本低：本发明提出的原材料制备简单、来源丰富，价格低廉；羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料生产具有工艺简单，不需特殊的设备，成本低廉等显著优势。

附图说明

图1是羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料粉体的SEM表征(×5000)。

图2是羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料固化后表面的SEM表征(×5000)。

图3是羟基磷灰石、聚丙烯酸、磷酸四钙及羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料等材料的FTIR表征。

图4是羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料固化前后的XRD表征(H：羟基磷灰石，T：磷酸四钙)。

图5是羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸等根尖充填材料抗稀散性研究结果，其中(a)为羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料，(b)为玻璃离子水门汀，(c)为Portland Cement。

图6是羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸等根尖充填材料接触角，其中(a)为羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料，(b)为玻璃离子水门汀，(c)为Portland Cement。

图7是不同浓度的羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料浸提液与L-929培养72h组细胞照片。(a)阴性对照组(10％FBS的DMEM培养液)；(b)12.5％羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸组；(c)25％羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸组；(d)50％羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸组；(e)100％羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸组；(f)阳性对照组(0.7％聚丙烯酰胺单体)。

图8是不同浓度的羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料浸提液与L-929培养72h组结晶紫染色细胞照片。(a)阴性对照组(10％FBS的DMEM培养液)；(b)12.5％羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸组；(c)25％羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸组；(d)50％羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸组；(e)100％羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸组；(f)阳性对照组(0.7％聚丙烯酰胺单体)。

图9是细胞在羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料样品表面生长3d情况(a：空白对照组，b：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸，100×)。

图10是细胞在羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料样品表面生长5d情况(a：空白对照组，b：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸，100×)。

图11是甘油预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的FTIR表征。

图12是PEG预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的FTIR表征。

图13是甘油预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗稀散性研究结果。

图14是PEG预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗稀散性研究结果。

具体实施方式

本发明结合实施例和附图作进一步的说明。

实施例1羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的制备方法

1)固相部分的制备：准确称取0.435克天然羟基磷灰石粉体，0.435克磷酸四钙(粒径为0～50μm，平均粒径为2～8μm)、0.87克聚丙烯酸(平均分子量为5万)、0.215克柠檬酸、0.215克柠檬酸钠置于研钵内充分研磨，过200目筛，隔湿保存，备用

2)液相部分的制备：为0.2mL去离子水；

3)羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的制备方法：环境温度为23±1℃，按固液相质量之比为5∶1，将上述固相及液相部分的材料分别置于清洁干燥的玻璃板上，采用塑料调拌刀充分调拌均匀，调和时间为60～90秒，将面团状的羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料填充于一定形状的模具内，齿科充填器加压充填成形。

4)SEM表征：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的粉体及固化样品喷金后在扫描电镜下观察形貌。图1显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料粉体主要有不同粒径的材料组成，大的粒径可达2-8μm，小的粒径仅达0.5μm左右；图2显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料固化样品的表面呈蜂窝、珊瑚状，有大小不一的空隙，在聚丙烯酸形成较为均一的基质内可见不同粒径的材料颗粒分布于其中。

5)FTIR表征：取适量新型根尖充填材料，按1∶150与溴化钾混合，充分研磨后压片，测试红外光谱。图3显示：在波数为3568.7cm^-1、1088.5cm^-1、1052.1cm^-1、628.1cm^-1、571.1cm^-1处呈现了羟基磷灰石所具有的羟基和磷酸根的特征峰；在1458.4cm^-1、1415.5m^-1处为CO₃^2-的特征吸收峰，在1567.3cm^-1出现聚丙烯酸中羧酸根的反对称伸缩特征峰。该结果提示羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料主要有羟基磷灰石及羧酸钙盐组成。

6)XRD表征：将羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的粉体及不同固化时间的样品(材料浸入无水乙醇终止其固化反应)，用玛瑙研钵磨成细粉，再将样品压入样品台，然后在X-衍射仪上进行羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的粉体(0min)，固化30min、2h、10h、1d、7d等样品材料的XRD表征，检测样品的成分的变化过程。图4显示该材料的粉体主要有羟基磷灰石及磷酸四钙组成(主要出现羟基磷灰石及磷酸四钙的特征峰)，但随着固化时间的延长，磷酸四钙的特征峰逐渐降低，而羟基磷灰石特征峰逐渐增强，该结果提示羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料随着固化时间的延长，磷酸四钙逐渐转化为羟基磷灰石。

实施例2羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗稀散性检测

按实施例1方法，将羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料按适当粉液比(5∶1)充分混合，调拌1分钟后，立即置于含有10mL的PBS液容器内，静置10分钟后，观察样品抗稀散性情况。图5显示，羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料在PBS液中固化，材料周围无碎屑出现，未见崩解现象，提示该材料具有良好的抗稀散性。

实施例3羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的固化时间的检测：

按实施例1方法，将羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料按适当粉液比(质量比5∶1)充分混合，调拌1分钟后，置入一直径为10mm，高为2mm的硅橡胶模具内，采用维卡氏针(Vicat)针法测定材料的固化时间，即以一支质量为300g，横截面积(d＝1mm)的针，让针头自由滑落，直到针头无明显压痕为止，从固相与液相混合时开始计时，每15秒测量一次，固化时间为自调和开始至固化时所需的时间。实验结果显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的固化时间为11.03±0.78min，适合于口腔临床操作要求(见表1)。

表1羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料固化时间检测结果

实施例4羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗压强度的检测：

按实施例1方法，将羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料按适当粉液比(5∶1)充分混合，调拌后置入抗压强度的模具内，采用齿科粘固粉充填器分层充填，使其稍高出模具后，置于金属底板上并加压，去除多余的材料。盖上金属板并压紧，然后将抗压强度将整个组件移入37℃士1℃，相对湿度不低于30％的恒温恒湿箱中，将在恒温恒湿箱中养护了1d及7d的样品取出，研磨两端制成长度为6mm、直径为4mm的圆柱形样品，用万能材料试验机(深圳新三思)测定样品的抗压强度，即在干燥状态下，将标准试样置于力学实验机上，轴向加压测量抗压强度，加载速度是1mm/min，记录压力-形变的曲线变化，计算样品的抗压强度值。实验结果显示：

1)羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料固化1d后，其抗压强度即达到30.96±6.57MPa；固化7d后，其抗压强度分别达到57.46±12.77MPa，达到根尖充填材料的抗压强度要求；

2)羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗压强度随着固化时间的延长，抗压强度逐渐增强，固化7d的样品材料抗压强度显著高于材料固化1d的抗压强度，差别具有显著性意义(p＜0.05)(见表2)。

表2羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗压强度检测结果

实施例5羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的pH值检测：

按实施例1方法，将羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料按适当粉液比(5∶1)充分混合，置于模具内制备成直径为6mm的柱状样品(1g/样品，n＝5)37℃，100％湿度下固化10min后，置于5mL去离子水浸泡，并分别于10min、30min、2h、1d、3d、7d、28d测量样品的浸提液pH值。实验结果显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的pH值在6.13～8.37之间，呈弱碱性，与人体牙齿及骨骼组织的pH值相近(见表3)。

表3羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料pH值检测结果

实施例6羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的接触角检测：

按实施例1方法，将羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料按适当粉液比(5∶1)充分混合，置于模具内制备成10×10×1mm的块状样品(n＝5)37℃，100％湿度下固化24h后，将用无水乙醇清洗过的样品放置在样品台上，并用微量注射器缓慢地将5μL去离子水滴在样品上，采用接触角测定仪检测上述各材料组的接触角。实验结果显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的接触角约为21.55±2.65°，提示该材料具有较好的亲水性，利于细胞在材料表面的粘附(见图6及表4)。

表4羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料接触角检测结果

实施例7羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的生物相容性检测：

1)MTT比色法检测羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的细胞毒性(ISO 10993-12：2002标准)

按实施例1方法，将羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料按适当粉液比(5∶1)充分混合，置于模具内制备成直径为5mm，高2mm片状样品(37℃，100％湿度下固化24h)，经紫外线照射12h处理后放入无菌试管，根据ISO10993-12：2002标准，根据实验材料的表面积确定所需的浸提液体积，按照1.25cm²/mL比例加入含10％的小牛血清高糖DMEM培养液，静置于培养箱，在37℃、5％CO₂湿度95％下保存，72h后收集实验材料的浸提液。我们采用GB/T16886-ISO 10993中推荐的细胞生长抑制法(MTT比色法)，对羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料样品的细胞毒性进行了评价，并用倒置相差显微镜对材料浸提液对细胞(L-929)形态的影响进行了观察。结果显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料样品不同浓度的浸提液在24h，48h，72h时的细胞相对增殖率在83.19％～110.74％之间，细胞毒性评级为0级(见表5)；图7显示不同浓度的浸提液组细胞呈梭形或多角形，细胞生长状况良好，与阴性对照组无明显差别。MTT比色法细胞毒性实验初步证明，该材料具有良好的生物相容性。

表5 MTT比色法检测羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的细胞相对增殖率及毒性分级结果

2)结晶紫比色法检测羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的细胞毒性(ISO 10993-12：2002标准)

我们按照上述MTT比色法实验方案，采用结晶紫比色法对羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料样品的细胞毒性进行了评价，并用倒置相差显微镜对材料浸提液对细胞(L-929)形态的影响进行了观察。结果显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料样品的不同浓度浸提液在24h，48h，72h时的细胞相对增殖率均在92.22％～104.90％之间，其细胞毒性评级为0级(见表6)；图8显示不同浓度的浸提液组细胞经结晶紫染色，细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色，不同浓度浸提液实验组细胞与阴性对照组无明显差别。结晶紫比色法细胞毒性实验初步证明，该材料具有良好的生物相容性。

表6结晶紫比色法检测羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的细胞相对增殖率及毒性分级结果

3)细胞形态学观察：

将L-929细胞悬液接种于含有羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料表面，常规条件下培养3d及5d，吖啶橙染色，荧光显微镜下观察材料表面的细胞形态。图9-10显示：荧光显微镜下可见细胞在羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料样品表面生长良好，与对照组无明显差别。

实施例8含硫酸钡的羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料制备方法

1)按实施例1方案进行固相部分的制备，并在固相粉体材料分别添加5％、10％、15、20％质量比硫酸钡，置于研钵内充分研磨，过200目筛，隔湿保存，备用。

2)液相部分的制备：去离子水；

3)含硫酸钡的羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的制备方法：按实施例1进行材料的调拌、成形。

4)按实施例7的MTT比色法检测不同硫酸钡含量羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的细胞毒性，结果显示：不同含量硫酸钡羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料样品的浸提液在24h，48h，72h时的细胞相对增殖率均在82.85％～100.33％之间，其细胞毒性评级为0级(见表7)；提示上述材料具有良好的生物相容性。

表7MTT比色法检测不同含量硫酸钡羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的细胞相对增殖率及毒性分级结果

实施例9预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料制备方法

1)按实施例1方案进行固相部分的制备。

2)液相部分的制备：PEG400或甘油。

3)预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料制备方法：按实施例1进行材料的调拌、成形，按固液相质量之比为4～5∶1。

4)按实施例1方案进行羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸固化样品的FTIR表征，图11显示PEG400或甘油预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料主要由羟基磷灰石及羧酸钙盐组成。

5)按实施例2进行PEG400或甘油预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗稀散性检测，图12显示，羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料在PBS液中固化，材料周围无碎屑出现，未见崩解现象，提示该材料具有良好的抗稀散性。

6)按实施例4进行PEG400或甘油预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗压强度的检测，结果显示甘油预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗压强度达到14.24MPA，高于文献中预混合的磷酸钙骨水泥(10MPa左右)文献的抗压强度，PEG400预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗压强度也达到5.85MPA(见表8)。

表8 PEG400或甘油预混合羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗压强度

本发明以玻璃离子水门汀(其液剂的主要成分是聚丙烯酸)及Portland Cement(是MTA的主要成分，但价格低廉，有望成为MTA的替代材料)等材料作为羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料对比材料，对其理化性能及生物学性能进行研究。

实施例10

一种牙根根尖充填材料，包括：天然羟基磷灰石、粒径为0～50μm且平均粒径为2～8μm的磷酸四钙、平均分子量为3万～5万聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠，其质量百分比为35％～44％∶35％～44％∶7％～9％∶1.5％～2.5％∶1.5％～2.5％，所述天然羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠经混合、研磨并过200目筛后形成牙根根尖充填材料，本实施例可以选择：粒径为0.1μm且平均粒径为2μm的磷酸四钙、平均分子量为3万聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠，其质量百分比为35％∶35％∶7％∶1.5％∶1.5％；也可以选择：粒径为50μm且平均粒径为8μm的磷酸四钙、平均分子量为5万聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠，其质量百分比为44％∶44％∶9％∶2.5％∶2.5％；或者选择：粒径为30μm且平均粒径为5μm的磷酸四钙、平均分子量为4万聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠，其质量百分比为40％∶4244％∶8％∶2％∶2.1％。

实施例11

一种牙根根尖充填材料，由天然羟基磷灰石、粒径为0～50μm且平均粒径为2～8μm的磷酸四钙、平均分子量为3万～5万聚丙烯酸、柠檬酸、柠檬酸钠及硫酸钡组成，硫酸钡的加入量为天然羟基磷灰石、粒径为0～50μm且平均粒径为2～8μm的磷酸四钙、平均分子量为3万～5万聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠总质量的0％～20％。

实施例12

一种牙根根尖充填材料的制备方法，

步骤1将天然羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠进行混合、研磨并过200目筛后得到牙根根尖充填粉体，隔湿保存，备用；

步骤2以离子水、PEG400或甘油为液相，将步骤1)制备的粉体与液相按照4～5∶1的质量比进行调拌、充填模具，制备出牙根根尖充填材料，

在本实施例中，在天然羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸、柠檬酸及柠檬酸钠中加入硫酸钡后再进行混合、研磨并过200目筛。对比例1玻璃离子水门汀及Portland Cement的抗稀散性检测

按实施例2方法，将玻璃离子水门汀(粉液比为2.6∶1)及Portland Cement(粉液比为3.3∶1)按适当粉液比充分混合，调拌1分钟后，立即置于含有10mL的PBS液容器内，静置10分钟后，观察样品抗稀散性情况。图5(b)显示：玻璃离子水门汀样品材料周围可见部分溶解，周围有大量碎屑出现，呈晕状，该研究结果提示玻璃离子水门汀对潮湿敏感，并不适合作为根尖充填材料；图5(c)显示：Portland Cement尽管需要在潮湿的环境下固化，但其在PBS液中，可崩解成数个小的碎块提示该材料抗稀散性较差，与MTA的抗稀散性研究结果相一致对比例2玻璃离子水门汀及Portland Cement的固化时间的检测：

按对比例1方法进行玻璃离子水门汀及Portland Cement等材料的制备，按实施例3进行材料固化时间检测。实验结果显示：玻璃离子水门汀的固化时间为4.49±0.39min；Portland Cement的固化时间长达171.93±6.72min，与MTA固化时间相似，并不符合理想根尖充填材料的要求，是其作为根尖充填材料的主要缺点之一(见表9)。

表9 玻璃离子水门汀及Portland Cement的固化时间检测结果

对比例3 玻璃离子水门汀及Portland Cement的抗压强度的检测

按对比例1方法进行玻璃离子水门汀及Portland Cement等材料的制备，按实施例4进行材料的抗压强度的检测。实验结果显示：玻璃离子水门汀固化1d后，其抗压强度即达到63.86±11.44MPa；固化7d后，其抗压强度达到107.24±22.62MPa，达到根尖充填材料的抗压强度要求；Portland Cement固化1d后，其抗压强度即达到28.11±8.15MPa；固化7d后，其抗压强度达到61.48±16.23MPa，与MTA抗压强度相似，达到根尖充填材料的抗压强度要求(见表10)。

表10 玻璃离子水门汀及Portland Cement的抗压强度检测结果

对比例4 玻璃离子水门汀及Portland Cement的pH值检测

按对比例1方法进行玻璃离子水门汀及Portland Cement等材料的制备，按实施例5进行材料的pH值检测。实验结果显示：玻璃离子水门汀的pH值在3.96～5.25之间，呈弱酸性；而Portland Cement的pH值在12.04～12.61之间，与MTA的pH值相似，呈强碱性(见表11)。

表11羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸等根尖充填材料pH值检测结果

对比例5 玻璃离子水门汀及Portland Cement的接触角检测

按对比例1方法进行玻璃离子水门汀及Portland Cement等材料的制备，按实施例6进行材料的接触角检测。实验结果显示：玻璃离子水门汀的接触角约为78.17±1.91°，Portland Cement接触角约为10.25±0.95°。该结果提示PortlandCement相似，具有较强的亲水性，而玻璃离子水门汀的亲水性较弱(见表12及图6)。

表12羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸等根尖充填材料接触角检测结果

实施例与对比例的研究结果对比

1)实施例2与对比例1实验结果显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗稀散性要优于玻璃离子水门汀及Portland Cement；

2)实施例3与对比例2实验结果显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的固化时间为11.03±0.78min，较玻璃离子水门汀的固化时间(4.49±0.39min)长，较Portland Cement的固化时间(171.93±6.72min)短，更加适合于临床要求；

3)实施例4与对比例3实验结果显示，羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料固化1d后，其抗压强度即达到30.96±6.57MPa；固化7d后，其抗压强度分别达到57.46±12.77MPa，基本达到根尖充填材料的抗压强度要求；羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的抗压强度与PortlandCement相近，与Portland Cement的抗压强度差别无显著性意义(p＞0.05)，但两者的抗压强度均小于玻璃离子水门汀的抗压强度，差别具有显著性(p＜0.05)；

4)实施例5与对比例4实验结果显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的pH值在6.13～8.33之间，呈弱碱性；玻璃离子水门汀的pH值在3.96～5.25之间，呈弱酸性；而Portland Cement的pH值在12.04～12.61之间；因此羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的pH值更加适合临床应用。

实施例6与对比例5实验结果显示：羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料的接触角约为21.55±2.65°，玻璃离子水门汀的接触角约为78.17±1.91°，PortlandCement接触角约为10.25±0.95°。该结果提示羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸根尖充填材料与Portland Cement相似，具有较强的亲水性，而玻璃离子水门汀的亲水性较弱。