砀山酥梨果实单果重主效QTL的分子标记及其应用

摘要

本发明属于遗传育种领域，涉及‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记及其应用。利用SRAP、SSR、AFLP构建‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱，结合对果实单果重的表型鉴定，采用区间作图法对此群体进行分析，在‘砀山酥梨’的第13连锁群上检测到主效QTL的存在，可解释48.8％的单果重特征。距离主效QTL位点Pfw-1距离最近的标记为fe3em4-242p*，其距离为0cM。所获得的单果重主效QTL分子标记对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，提供了‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记及其应用，可用于梨果实单果重性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。

背景技术

梨(Pyrus L.)原产我国，是我国第三大果树树种。梨因其果实营养价值高，香甜多汁，而深受消费者喜爱。梨果个大小即通常所说的单果重，是梨果实外观品质和商品性状的重要指标之一，也是构成梨品种产量和经济效益的重要因素，因此，梨果实单果重的大小对梨品种至关重要。培育具有理想单果重的品种已经成为梨育种的重要目标之一。

由于梨为多年生木本果树作物，与果实品质相关的性状大都是由多基因控制、易受环境影响的数量性状，在分离后代表现为广泛的表型变异，其基因型与表现型间的对应关系难以确定。而以往的传统育种是基于经典数量遗传学理论，把控制某一性状的多个基因作为整体进行研究和选择，在现有基础上改良目标性状难度越来较大。近年来，随着分子标记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善，使得数量性状基因座(Quantitative trait loci，QTL)定位变成了现实，也为提高目标数量性状优良基因型选择的可能性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已知座位的分子标记来定位未知座位的QTL，通过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分离与数量性状的量之间的关系，可直接把握数量性状基因，并开发可应用于分子标记辅助选择(Molecular-assisted selection，MAS)育种的技术，这已在许多重要农作物上取得了成功应用。

目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是针对一些病害或生长性状，对重要性状梨单果重的QTL定位及分子标记的研究尚没有开展。因此，开展梨果实单果重主效基因的QTL定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立杂交后代早期辅助选择技术体系，对于提高梨果单果重品质改良效率，缩短育种进程，节约生产成本显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记。

本发明的另一目的在于提供一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记引物。

本发明的另一目的在于提供一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记方法。

本发明的又一目的在于提供一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记在梨分子育种中的应用。本发明定位梨果实单果重主效QTL，并提供与QTL位点紧密连锁的分子标记，通过检测这些分子标记可以预测梨果实单果重，为实现对该性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记，是通过下列步骤获得：

a)利用梨品种‘八月红’梨和‘砀山酥梨’杂交获得F₁后代单株；

b)用SSR、SRAP和AFLP三种分子标记方法分析两个亲本及其F₁群体，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。获得多态性标记位点，然后对其进行连锁分析，构建‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱。可采用Joinmap3.0作图软件对所获得的多态性标记位点进行连锁分析。

c)对‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交后代的F₁群体单株的果实单果重进行测定，利用区间作图法(可利用MapQTL5.0作图软件)，将F₁群体每个单株的果实单果重与‘砀山酥梨’遗传连锁图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值≥2.5为标准，大于2.5说明存在一个QTL位点，在母本‘砀山酥梨’的第7连锁群上检测到单果重的QTL位点Pfw-1，其LOD值为4.24，是主效QTL，距离最近的一个SRAP分子标记为fe3em4-242p*，大小为242bp，距Pfw-1的距离为0cM，该标记可以作为梨果实单果重的标记，所筛选的分子标记fe3em4-242p*的SRAP引物为fe3：5′-GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3′和em4：5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′。

上述的‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记，其所述QTL位点Pfw-1位于‘砀山酥梨’第13连锁群上，其解释48.8％的单果重特征。

一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的SRAP分子标记引物，其特征在于该引物序列为：fe3：5′-GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3′和em4：5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′。

一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记方法，用梨基因组DNA，采用SRAP引物fe3：5′-GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3′和em4：5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，如果获得一个分子标记大小为242bp，则表明与梨果实单果重的主效QTL位点相连锁的分子标记存在，该QTL位点Pfw-1位于‘砀山酥梨’第13连锁群上，其解释48.8％的单果重特征。其PCR扩增体系为总体积20ul：其中包含0.2mmol·L^-1dNTP，0.3μmol·L^-1上下游引物，2.0mmol·L^-1MgCl₂，1个单位的rTaq酶，DNA模板50ng，1×Buffer；PCR反应程序为：94℃3min；35个循环：94℃40s，55℃50s，72℃1min；72℃10min，10℃10min。

上述‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记在梨分子育种中的应用。

上述应用，其应用方法为：用梨基因组DNA，采用SRAP引物fe3：5′-GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3′和em4：5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如果获得一个分子标记大小为242bp，则表明与梨果实单果重的主效QTL位点相连锁的分子标记存在，可预测该梨品种果实具有较低的单果重。PCR扩增体系为总体积20ul：其中包含0.2mmol·L^-1dNTP，0.3μmol·L^-1上下游引物，2.0mmol·L^-1MgCl₂，1个单位的rTaq酶，DNA模板50ng，1×Buffer；PCR反应程序为：94℃3min；35个循环：94℃40s，55℃50s，72℃1min；72℃10min，10℃10min。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次对决定‘砀山酥梨’果实单果重的数量性状位点进行了QTL定位，这为实现基于分子育种的多基因控制性状改良奠定了重要的基础和必要的前提。

(2)本发明中确定了‘砀山酥梨’果实单果重的主效QTL位点，对该数量性状决定的贡献率较高，位点的贡献率为48.8％。因此，基于此位点筛选连锁分子标记对目标性状判断的准确性大大提高。

(3)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需≤5cM，本发明中与QTL位点连锁的标记距离为0cM，与目标位点表现为紧密连锁，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。因此，以上标记具有良好的应用价值，可加快对梨果实单果重性状改良的进度。

附图说明

图1为‘砀山酥梨’单果重QTL位点Pfw-1在BYH13上的位置。

BYH代表的是‘砀山酥梨’连锁群，BYH后的数字代表连锁群数。

连锁群上左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为cM，右侧则表示的是分子标记的名称。共有4种分子标记，“E-M-”为AFLP标记，E和M分别指限制性内切酶Eco I和Mse I酶切，其后的数字是该标记多态性条带的编号；其它为SRAP、SSR标记和一个自交不亲和S位点。

连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间Pfw-1。

图2为SRAP引物组合fe3em4对‘八月红’梨和‘砀山酥梨’F1后代PCR扩增结果在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。

箭头所指的条带即fe3em4-242p*，M为pBR322DNA/Msp I ladder。

具体实施方式

实施例1：

a)利用我国的两个梨品种‘八月红’梨和‘砀山酥梨’杂交组合，获得其97株F₁群体。

b)用SSR(Simple sequence repeat)、SRAP(Sequence related amplified polymorphism)和AFLP(Amplified fragment length polymorphism)三种分子标记方法分析两个亲本及其F₁群体，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。最终获得了23个SSRs、S基因位点、226个SRAPs和482个AFLPs等共732个多态性标记位点，然后利用Jionmap3.0作图软件对其进行连锁分析，构建了一张共包含240个多态性标记的‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱。

利用SSR、SRAP、AFLP分子标记方法，对‘八月红’梨和‘砀山酥梨’及后代进行分析，并统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。

SSR标记的实验操作程序参考Yomamoto T.等(Euphytica，2002，124：129-137)的方法；SRAP标记的实验操作程序参考Li等(Theor Appl Genet，2001，103：455-461)的方法；AFLP标记分别使用Eco I和Mes I两种内切酶，具体实验操作程序参考Vos等(Nucleic Acids Res，1995，23：4407-4414)的方法。所用引物由上海英骏生物技术有限公司合成。S SR和SRAP标记用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶强碱银染法检测，AFLP标记用6％变性聚丙烯酰胺凝胶银染检测。

将SSR、SRAP、AFLP电泳图谱上清晰出现的多态性条带记为“1”，无带记为“0”，不清楚的带或缺失记为“-”，根据已知分子量的Marker(100bp DNA Ladder)计算各多态性条带的分子量。将分离条带按亲本来源归类，确定其来源及遗传类型。利用χ²测验分析各标记分离是否符合3∶1或1∶1的孟德尔分离比例，偏分离的在标记末尾用“*”标注。

c)用Joinmap3.0分析软件构建‘砀山酥梨’的分子遗传连锁图谱。

将第b)步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap3.0分析软件中适于cp群体构图的格式导入Joinmap3.0，排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点，以LOD＝4.0～7.0，重组率＝0.4，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图(Van Ooijen，2001)。

d)对该F₁群体单株的果实单果重进行了测定。将单果重的表型值和‘砀山酥梨’连锁图谱的相关文件导入MapQTL5.0作图软件，选择区间作图法，以LOD值≥2.5为标准，对梨的单果重在‘砀山酥梨’的连锁图谱上进行QTL分析和定位。

结果表明，在‘砀山酥梨’的第7连锁群上检测到单果重的QTL位点Pfw-1(图1)，LOD值为4.24，为主效QTL位点，与最近的SRAP分子标记fe3em4-242p*的连锁距离为1cM，对该性状的贡献率为48.8％。该QTL位点与其最近标记的距离远小于可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的所要求的最大距离。

其中SRAP分子标记方法为，以梨DNA为模板，采用SRAP引物：

fe3：5′-GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3′

em4：5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′

扩增条件：SRAP分析的PCR扩增体系为总体积20ul：其中包含0.2mmol·L^-1dNTP，0.3μmol·L^-1上下游引物，2.0mmol·L^-1MgCl₂，1个单位的rTaq酶，DNA模板50ng，1×Buffer。PCR反应程序为：94℃3min；35个循环：94℃40s，55℃50s，72℃1min；72℃10min，10℃10min；

扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，能扩增出14条多态性条带，其中242bp大小的一条就是目标条带fe3em4-242p*，则表明与QTL位点Pfw-1(图1)相连锁的分子标记存在，该QTL位点与SRAP分子标记fe3em4-242p*的连锁距离为0cM，对该性状的贡献率为48.8％。

实施例2

利用筛选到的与‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL相连锁的分子标记对‘八月红’梨与‘砀山酥梨’的97株F₁杂交后代进行初步检测，以检测该方法在梨果实单果重分子标记辅助选择中的实用价值。用该97株后代的基因组DNA及SRAP引物fe3和em4进行PCR反应，SRAP分析的PCR扩增体系为总体积20ul：其中包含0.2mmol·L^-1dNTP，0.3μmol·L^-1上下游引物，2.0mmol·L^-1MgCl₂，1个单位的rTaq酶，DNA模板50ng，1×Buffer。PCR反应程序为：94℃3min；35个循环：94℃40s，55℃50s，72℃1min；72℃10min，10℃10min。PCR扩增结果在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(结果如图2)，电泳后根据fe3em4-242p*条带的有无来确定是否存在相应的标记，如果存在标记，说明该植株的果实单果重低，不存在则说明高，同时用实际测得的果实单果重结果与分子标记检测结果进行验证。

结果显示，在‘八月红’梨与‘砀山酥梨’的97株F₁杂交后代中，共有80株的DNA扩增结果出现fe3em4-242p*条带，这80株当中有35株的果实单果重小于160g，所有这80株的果实单果重平均值为176.46g；共有12株后代的DNA扩增结果不出现fe3em4-242p*条带，其中10株的单果重大于160g，所有这12株的果实单果重的平均值为184.06g；5个单株条带缺失。用fe3em4-242p*预测单果重有较好的预测效果。