肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒，其包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、CoxA16型/EV71型/通用型三重反应液和去RNA酶水。本发明肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒能够在同一反应管中同时检测出肠道病毒CoxA16型、EV71型或者其它肠道病毒，解决了现有体外检测试剂盒无法在同一反应管中同时检测与手足口病相关的肠道病毒的问题。本发明检测试剂盒特异性强、灵敏度高，还具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种手足口病的体外诊断试剂盒，尤其涉及肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒，属于手足口病的体外诊断领域。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouth disease，HFMD)又名发疹性水疱口腔炎，是由一组肠道病毒引起的常见传染病，临床表现以发热和手、足、口腔等部位的皮疹为主要临床特征的一种急性传染病。绝大多数HFMD患者预后良好，一般可在5～7天痊愈，属于自限性疾病。病毒还可以侵犯呼吸系统、中枢神经系统等引起脑炎、肺水肿、弛缓性麻痹、心肌炎等症状，个别危重患儿可因多种原因导致死亡。该病全年均可发病，好发于夏秋季，常见于5岁以下的儿童。HFMD的主要传播途径是粪-口途径，亦可通过呼吸道传播。HFMD传染性强，易导致流行或暴发。HFMD分布极广泛，无严格地区性。HFMD全年均可发病，有明显的季节特点，以夏秋季多见。

引起HFMD的主要为小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsacki evirus)A组的4型、5型、7型、9型、10型、16型；柯萨奇病毒B组的2型、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)及肠道病毒71型(EV71)。人对引起HFMD的肠道病毒普遍易感，各年龄组均可感染发病，但以隐性感染为主，隐性感染与显性感染之比约为100∶1。由于机体受病毒感染后，产生的中和抗体可在体内存留较长时间，对同型病毒感染产生牢固的免疫力，因此，HFMD的患者主要为学龄前儿童，尤其是5岁以下儿童，占发病数90％以上。而大多数成人可携带病毒但不发病。1岁以内的儿童发生心肌炎、脑炎等重症的比例较1岁以上儿童高。

中国手足口病流行，1981年上海首次报道手足口病；1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发；1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71；1998年中国台湾地区129106例HFMD，其中405例为严重的中枢神经系统感染，78例死亡；1999年以来，中国广东、福建、上海、重庆等地区报告局部流行EV71感染；2007年山东临沂流行以EV71为主的手足口病；2008～2009年安徽阜阳、河南、山东等地大规模流行。主要为CoxA16和EV71共循环引起手足口病发，EV71在大部分省市为优势病毒。

以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术，在目前中国国内的临床诊断中应用最为广泛。在探针法的实时荧光PCR反应体系中，根据所检测病原体的多少，还可以分为单重或多重实时荧光PCR技术，反应体系中往往包括一对或多对特异性PCR引物及探针，通过研发过程中的条件摸索，探针及引物只与相对应的模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、ROX等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号(图1)。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。

现有的手足口病的体外诊断试剂盒大多存在特异性和灵敏性较低、检测步骤繁琐等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明的主要目的提供是一种能够同时在同一反应管中分别检测出肠道病毒EV71型、CoxA16或其它致手足口病的肠道病毒的三重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点。

为了达到上述目的，本发明采用了这样的技术方案：

一种肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒，包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、CoxA16型/EV71型/通用型三重反应液、去RNA酶水。

其中，所述的肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型反应液包括以下3组组分：

(1)一对检测肠道病毒CoxA16型的引物，其碱基序列分别为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示；一对检测肠道病毒CoxA16型探针，其碱基序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，其中，SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4的′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；

(2)一对检测肠道病毒EV71型的引物，其碱基序列分别为SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示；一条检测肠道病毒EV71型的探针，其碱基序列为SEQ ID No.7所示；其中，该探针的′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；

(3)一对检测肠道病毒通用型的引物，其碱基序列分别为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；一条检测肠道病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQID No.10所示；其中上述探针的′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；

本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：

肠道病毒肠道病毒CoxA16型的引物及探针的配比分别为：SEQ IDNo.1∶SEQ ID No.2∶SEQ ID No.3∶SEQ ID No.4＝400nM∶400nM∶100nM∶100nM；

检测肠道病毒CoxA16型的引物及探针的配比分别为：SEQ ID No.5∶SEQID No.6∶SEQ ID No.7＝600nM∶600nM∶200nM；

肠道病毒通用型引物的引物和探针的配比分别为：SEQ ID No.8∶SEQ IDNo.9∶SEQ ID No.10＝500nM∶500nM∶400nM。

表1肠道病毒CoxA16型、EV71型、通用型引物探针

表2 CoxA16型/EV71型/通用型反应液组分

  试剂名称  加入体积(μl)/50反应  肠道病毒CoxA16型FP  5  肠道病毒CoxA16型RP  5  肠道病毒CoxA16型P  1.25  肠道病毒CoxA16型P  1.25  肠道病毒EV71型FP  7.5  肠道病毒EV71型RP  7.5  肠道病毒EV71型P  2.5  肠道病毒通用型FP  6.25  肠道病毒通用型RP  5  肠道病毒通用型P  5

所述的RT-PCR反应液包括去RNA酶水、10×PCR缓冲液、25mM Mg²⁺、10mM dNTPs。(表2)

表2 RT-PCR反应液的组成

  试剂名称  加入体积(μl)/50反应  去RNA酶水  290  10×PCR缓冲液  50  25mM Mg²⁺  25  10mM dNTPs  10  总计  375

所述的酶混合液包括RNA酶抑制剂、Taq酶、逆转录酶、10×缓冲液、去RNA酶水。逆转录酶和DNA聚合酶在PCR扩增中起着非常重要的作用，包括逆转录、扩增的效率和特异性，为了达到更好的效果，本发明优选采用M-MLV逆转录酶和热启动酶(表3)。

表3酶混合液的组成

为了达到更好的检测效果，本发明试剂盒中还可含有肠道病毒CoxA16/EV71型/通用型阳性参考品(通过购自江苏省疾病预防控制中心的病毒培养液制备得到)。

本发明的另一个目的是提供本发明试剂盒在检测肠道病毒CoxA16型、EV71型或其它肠道病毒的使用方法，包括：

(1)提取样本的RNA；

(2)准备以下组分：RT-PCR反应液12.5ul，酶混合液1ul，CoxA16型/EV71型/通用型反应液4ul，去RNA酶水2.5ul，RNA样本5ul；

(3)RT-PCR扩增：按照以下程序进行RT-PCR扩增

50℃    30min

95℃    5min

(4)结果判定：在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤36.0，判断为肠道病毒CoxA16型为阳性；无典型“S”型扩增或CT≥36.0，判断为肠道病毒CoxA16型为阴性。在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤36.0，判断为肠道病毒EV71型为阳性；无典型“S”型扩增或CT≥36.0，判断为肠道病毒EV7型为阴性。在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.5，判断为肠道病毒通用型为阳性；无典型“S”型扩增或CT≥35.5，判断为肠道病毒通用型为阴性。

检测前，先按照常规的RNA提取方法对样本提取RNA，样本包括：粪便、肛拭子、咽拭子及疱疹吸取物混悬液。将待测标本加入准备好的肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型试剂的PCR反应管中，在荧光定量PCR扩增仪中扩增检测。扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染肠道病毒，以及是那一种肠道病毒(图2)。

本发明肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒能够同时检测出肠道病毒CoxA16型、EV71型或者其它肠道病毒，解决了现有产品无法在一轮反应中同时检测肠道病毒的问题。本发明还具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在肠道病毒体外诊断领域具有极大的应用前景。

附图说明

图1TaqMan探针的荧光信号产生机制。

图2本发明试剂盒检测两组样本的曲线图。

图3本发明试剂盒检测肠道病毒CoxA16型的敏感性试验结果。

图4本发明试剂盒检测肠道病毒EV71型的敏感性试验结果。

图5本发明试剂盒检测肠道病毒CoxA16型的特异性试验结果。

图6本发明试剂盒检测肠道病毒EV71型的特异性试验结果。

图7本发明试剂盒检测脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、新肠道病毒的扩增结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1本发明试剂盒临床样本的检测试验

1样本处理(RNA提取)

1.1取200ul手足口临床样品，加入400ul Binding Buffer supplemented with Poly(A)，充分混匀后转入高纯化过滤管，8000rmp离心15s，弃去收集管中的废液。

1.2加入500ul Inhibitor Removal Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。

1.3加入450ul Washing Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。

1.4重复步骤3，然后高速离心10s，此步骤务必将废液去除干净.

1.5加入50ul Elution Buffer至过滤管中，室温静置2min，8000rmp离心1min，离心所得溶液即为纯化的RNA。

2试剂准备

3PCR扩增程序

50℃    30min

95℃    5min

4结果分析：5个临床样本具体结果如下：

试验例2本发明试剂盒敏感性试验结果

对肠道病毒CoxA16型标准参考毒株和肠道病毒EV71型标准参考毒株(通过购自江苏省疾病预防控制中心的病毒培养液制备得到)的提取核酸，将抽提所得的CoxA16和EV71总RNA进行10倍倍比稀释。实验结果表明本试剂盒可检测至0.001PFU，并且CT值随浓度减少呈梯度改变(图3、图4)。试验结果表明，本发明试剂盒对于肠道病毒CoxA16型/EV71型的诊断具有高度的敏感型。

试验例3本发明试剂盒特异性试验结果

为了检测本发明肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒的特异性，用肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒检测肠道病毒毒株、腺病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、流感病毒等，结果表明FAM通道仅对肠道病毒CoxA16型进行扩增(图5)；

VIC通道仅对肠道病毒EV71型进行扩增(图6)；ROX通道对脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、新肠道病毒进行扩增。表明本发明检测试剂盒能特异性扩增肠道病毒病毒，而不与其它病毒核酸发生交叉反应(图7)。