公开/公告号CN102115728A
专利类型发明专利
公开/公告日2011-07-06
原文格式PDF
申请/专利权人 北京清大天一科技有限公司;
申请/专利号CN200910265976.0
申请日2009-12-31
分类号C12N5/07(20100101);
代理机构11243 北京银龙知识产权代理有限公司;
代理人钟晶
地址 102200 北京市昌平区科技园区白浮泉路11号
入库时间 2023-12-18 02:43:19
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-02-16
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N5/07 授权公告日:20120926 终止日期:20161231 申请日:20091231
专利权的终止
2012-09-26
授权
授权
2011-08-24
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N5/07 申请日:20091231
实质审查的生效
2011-07-06
公开
公开
技术领域
本发明涉及培养基干粉、液体培养基以及它们的制备方法,尤其涉及无血清动物细胞培养基干粉、液体无血清动物细胞培养基以及它们的制备方法。
背景技术
现有技术通过增加大豆水解产物作为无血清动物细胞培养基的组分,来提高被培养宿主细胞或重组细胞的培养稳定性和培养密度、增加被培养宿主细胞或重组细胞的产量,并且增加寄生在宿主细胞中的病毒等的产量或者利用重组细胞作为表达载体后所产生重组靶蛋白产物的产量。并且认为其它植物的水解产物,例如小麦水解产物不能得到与大豆水解产物相当的有益效果。
例如CN 1318577C(专利号00816020.1)中公开了一种用于培养哺乳动物细胞的无蛋白无血清培养基,所述培养基包含大豆水解产物,其中至少40%的所述大豆水解产物的分子量≤500道尔顿。该培养基能够起到提高被培养重组细胞培养稳定性、终细胞密度以及重组细胞靶蛋白产率的作用。WO02/29084也在说明书实施例中提及可以向培养动物细胞的培养基中添加大豆蛋白的水解产物。
但是大豆水解产物中除了含有大豆蛋白外还含有许多其他成分,比如,大豆油、大豆多糖、大豆皂甙等,因此在向无血清动物细胞培养基中添加大豆水解产物的同时,极有可能加入上述其他成分即加入杂质成分,从而不利于细胞的增殖和生长。此外,由于大豆蛋白在不同水解条件下被水解程度不同,因而得到的大豆蛋白水解产物成分很难统一,会造成培养基成分不确定,从而使被培养细胞的批次差异性大,且使被培养细胞的下游产品分离困难。
综上,虽然现有技术已经出现了添加大豆水解产物的无血清动物细胞培养基,但目前这类动物细胞培养基仍然存在细胞培养密度低、分离细胞下游产品成本高、被培养细胞的批次差异性大、安全性差的缺陷。
发明内容
本发明的目的是克服现有动物细胞培养无血清动物细胞培养基存在细胞培养密度低、分离细胞下游产品成本高、被培养细胞的批次差异性大、安全差的缺点,提供一种新的无血清动物细胞培养基干粉,由无血清动物细胞培养基干粉制成液体培养基所培养的细胞培养密度高、利于分离细胞下游产品、成本低、被培养细胞的批次差异性小、安全性好。
本发明的第二个目的是提供上述无血清动物细胞培养基干粉的制备方法。
本发明的第三个目的是提供包括上述无血清动物细胞培养基干粉的液体无血清动物细胞培养基。
本发明的第四个目的是提供包括上述无血清动物细胞培养基干粉的液体无血清动物细胞培养基的制备方法。
现有技术中认为向无血清动物细胞培养基中加入除大豆水解蛋白外的其他蛋白效果不好,例如,在CN 1318577C的说明书第3-4页明确记载,“与现有技术已知的其它水解产物(例如小麦水解产物、水稻水解产物或酵母水解产物)相反,已经发现仅大豆水解产物介导按照本发明的特性,并且导致例如显著提高重组靶蛋白的得率。”在该文件的实施例7中揭示出小麦水解产物不如大豆蛋白水解产物效果好。
然而本发明的发明人意外地发现,向无血清基本培养基干粉中以培养基溶剂的体积为基准,加入100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白得到的培养基干粉,制成液体无血清培养基培养动物细胞,特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)以及叙利亚地鼠肾细胞(BHK21细胞)时,能够达到的细胞培养密度远高于现有技术添加大豆水解产物或大豆蛋白水解产物的液体无血清培养基所能达到的细胞培养密度;由于添加的成分确定,一方面有利于分离细胞下游产品,使成本降低,另一方面使被培养细胞的批次差异性大大减小,安全性更好。
本发明提供了一种无血清动物细胞培养基干粉,所述培养基干粉分散在培养基溶剂中形成液体培养基,所述培养基干粉包括基本培养基干粉,其中,以所述培养基溶剂的体积为基准,所述培养基干粉还包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。
本发明还提供了上述无血清动物细胞培养基干粉的制备方法,该方法包括将本发明所述的无血清动物细胞培养基干粉的组分分散在分散剂中,移除所得混合物中的分散剂。
本发明还提供了一种液体无血清动物细胞培养基,所述液体无血清动物细胞培养基包括培养基溶剂和分散在该培养基溶剂中的无血清动物细胞培养基干粉,其中,所述无血清动物细胞培养基干粉为本发明所述的无血清动物细胞培养基干粉中的一种或几种。
本发明还提供了上述液体无血清动物细胞培养基的制备方法,该方法包括将无血清动物细胞培养基干粉分散在培养基溶剂中,过滤灭菌,其中,所述无血清动物细胞培养基干粉选自本发明所述的无血清动物细胞培养基干粉中的一种或几种。
与现有的添加大豆水解产物或大豆蛋白水解产物的无血清动物细胞培养基干粉或液体无血清培养基相比,本发明的无血清动物细胞培养基干粉或液体无血清培养基中还包括以培养基溶剂的体积为基准,100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。当本发明的无血清动物细胞培养基干粉或液体无血清培养基用于培养动物细胞时,能够达到的细胞培养密度大大提高;由于添加的成分确定,一方面有利于分离细胞下游产品,使成本降低,另一方面使被培养细胞的批次差异性大大减小,安全性更好。
附图说明
图1A为使用本发明实施例1的无血清动物细胞培养基干粉培养72小时的CHO细胞的照片(放大420倍);
图1B为使用本发明实施例5的无血清动物细胞培养基干粉培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍);
图2A为使用对比例1(CN 1318577C)的无血清动物细胞培养基(包括大豆水解产物)培养72小时的CHO细胞的照片(放大300倍);
图2B为使用对比例1(CN 1318577C)的无血清动物细胞培养基(包括大豆水解产物)培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍);
图3A为使用对比例2(WO 02/29084)的无血清动物细胞培养基(包括大豆水解产物)培养72小时的CHO细胞的照片(放大300倍);
图3B为使用对比例2(WO 02/29084)的无血清动物细胞培养基(包括大豆水解产物)培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍);
图4A为使用本发明实施例2的液体无血清动物细胞培养基培养72小时的CHO细胞的照片(放大420倍);
图4B为使用本发明实施例6的液体无血清动物细胞培养基培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍);
图5A为使用实施例3的培养液体无血清动物细胞培养基培养48小时的CHO细胞的照片(放大420倍);
图5B为使用实施例7的培养液体无血清动物细胞培养基培养48小时的BHK21细胞的照片(放大300倍);
图6A为使用实施例4的培养液体无血清动物细胞培养基培养48小时的CHO细胞的照片(放大420倍);
图6B为使用实施例8的培养液体无血清动物细胞培养基培养48小时的BHK21细胞的照片(放大200倍);
图7A为对比例1-2和实施例1-4随培养时间变化的CHO细胞密度对比图;
图7B为对比例1-2和实施例5-8随培养时间变化的BHK21细胞密度对比图。
具体实施方式
本发明提供的无血清动物细胞培养基干粉,所述培养基干粉分散在培养基溶剂中形成液体培养基,所述培养基干粉包括基本培养基干粉,其中,以所述培养基溶剂的体积为基准,所述培养基干粉还包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。
本发明的无血清动物细胞培养基干粉优选其中以所述培养基溶剂的体积为基准,所述培养基干粉还包括150-180g/100L的大豆蛋白、150-180g/100L的豌豆蛋白、150-180g/100L的蚕豆蛋白、50-80g/100L的马铃薯蛋白、150-180g/100L的小麦麸蛋白和50-80g/100L的水稻蛋白。本发明的无血清动物细胞培养基干粉更优选其中以所述培养基溶剂的体积为基准,所述培养基干粉还包括170-180g/100L的大豆蛋白、170-180g/100L的豌豆蛋白、170-180g/100L的蚕豆蛋白、50-60g/100L的马铃薯蛋白、150-160g/100L的小麦麸蛋白、50-60g/100L的水稻蛋白。
本发明的无血清动物细胞培养基干粉中,所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白可以是商业上可供的商品,也可以是按照常规实验手段从相应植物种子或果实中分离出来的蛋白。蛋白质的分离提纯方法以及定性定量的检测方法为本领域技术人员公知,比如TCA-丙酮法(Mechin V,Damerval C,Zivy M.Total protein extraction with TCA-acetone.Methods MolBiol 2007;355:1-8)、酸水解以及酶水解法,优选酶水解法。
优选本发明所述的大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白通过以下方法制备:
a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至直径为0.1-3mm3的颗粒;
b)在酶解时间为0.5-10h、酶解PH值为5-9、酶解温度为45℃-60℃、酶量为2-5重量%的条件下酶解步骤a)所得的颗粒;其中,所述酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或几种,所述酶的酶活≥1×105单位/克;
c)在80-100℃保持5-20min以终止步骤b)所述的酶解;
d)将步骤c)所得的酶解产物在3000-8000rpm下离心5-20min,收集上清液;
e)将步骤d)所得上清液用中空纤维过滤器超滤,所述过滤器所用膜的透过分子量为10000-20000道尔顿;
f)收集步骤e)所得超滤液,真空冷冻干燥,获得相应植物蛋白。
更优选所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白通过以下方法制备:
a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至直径为0.1-1mm3的颗粒;
b)在酶解时间为2-10h、酶解PH值为5-8、酶解温度为45℃-60℃、酶量为2-5重量%的条件下酶解步骤a)所得的颗粒;其中,所述酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或几种,所述酶的酶活≥1×105单位/克;
c)在80-90℃保持5-10min以终止步骤b)所述的酶解;
d)将步骤c)所得的酶解产物在3000-5000rpm下离心15-20min,收集上清液;
e)将步骤d)所得上清液用中空纤维过滤器超滤,所述过滤器所用膜的透过分子量为10000-20000道尔顿;
f)收集步骤e)所得超滤液,真空冷冻干燥,获得相应植物蛋白。
更优选地,根据不同的植物原料进行不同的前处理,例如,对于豆类原料(大豆、豌豆和蚕豆)可以先脱脂前处理。不同的植物原料也可以采用不同的酶解条件,例如,在温度为52.9℃、碱性蛋白酶(105单位/克)加酶量为5.2%、pH为8.7、底物浓度为8.06重量%以及提取时间为2小时的条件下制备小麦麸蛋白;或者在温度为50℃、中性蛋白酶(105单位/克)加酶量为4%、pH为6.8、底物浓度为6.5重量%以及提取时间为2.5小时的条件下制备小麦麸蛋白。马铃薯蛋白可以通过以下方法制得:清洗去皮马铃薯原料与等体积1%亚硫酸钠溶液匀浆,固液分离(离心、静置或榨汁),收集所得马铃薯汁在pH为3.0下静置5h,离心收集沉淀,喷雾干燥得粉末。收集所述粉末加缓冲液,在温度为50℃、胰蛋白酶加酶量(105单位/克)为4%、pH为8.0、底物浓度为20重量%(105单位/克)以及提取时间为1.5小时的条件下制备马铃薯蛋白。
本发明的无血清动物细胞培养基干粉可以包括本领域常用的各种基本培养基,例如,选自BME细胞培养基、DMEM细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、Fischer′s细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、F10细胞培养基、F12细胞培养基和1640细胞培养基中的一种或几种。优选包括的所述基本培养基为重量比1∶1的F12细胞培养基和DMEM细胞培养基。所述基本培养基的成分为本领域公知,上述列举的基本培养基名称为它们的商品名,商业上可供。
更优选本发明的无血清动物细胞培养基干粉,其中,以所述培养基溶剂的体积为基准,所述无血清动物细胞培养基干粉包括下表1所示的组分:
表1
更优选所述的无血清动物细胞培养基干粉以所述培养基溶剂的体积为基准,所述无血清动物细胞培养基干粉还可以包括0.1-1g/100L的次黄嘌呤和/或0.1-2g/100L的酚红。其中,次黄嘌呤可以作为嘌呤的来源;酚红作为pH值指示剂加入,可以通过目测随时掌握细胞的生长情况。
进一步优选所述的无血清动物细胞培养基干粉,其中,以所述培养基溶剂的体积为基准,所述无血清动物细胞培养基干粉包括下表2所示的组分:
表2
当所述无血清动物细胞培养基干粉为培养中华仓鼠卵巢细胞的培养基干粉时,即本发明的无血清动物细胞培养基干粉用于培养CHO细胞时,优选所述的无血清动物细胞培养基干粉中,以所述培养基溶剂的体积为基准,包括下表3所示的组分:
表3
当所述无血清动物细胞培养基干粉为培养BHK21细胞的培养基干粉时,即本发明的无血清动物细胞培养基干粉用于培养BHK21细胞时,优选所述的无血清动物细胞培养基干粉中,以所述培养基溶剂的体积为基准,包括下表4所示的组分:
表4
本发明还提供了上述无血清动物细胞培养基干粉的制备方法,该方法包括将本发明所述的无血清动物细胞培养基干粉的组分分散在分散剂中,移除所得混合物中的分散剂。所述无血清动物细胞培养基干粉的组分在分散剂中的分散可以通过本领域常用的各种分散方法实现,比如搅拌、超声振荡等。
制备本发明无血清动物细胞培养基干粉可以使用干法和湿法两类方法。所谓干法指在干燥的条件下混合固体组分的粉末(比如利用球磨机球磨混合)。使用干法时,优选首先按照构成培养基于粉的各个组分的性质对它们分别干燥。比如将无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾可以在100-120℃,优选100-105℃下干燥1-5小时;将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐在30-80℃优选35-50℃下干燥1-3小时;将七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠放入真空干燥箱内抽真空干燥10小时以上。所谓湿法指将可以形成本发明无血清动物细胞培养基干粉的固体组分与分散剂混合,然后移除所得混合物的分散剂。还可以将干法与湿法结合,即将一部分固体组分用湿法混合,移除分散剂后,用干法与其余部分的固体组分混合。
所述分散剂可以选自本领域用于制备无血清动物细胞培养基干粉的各种分散剂。所述分散剂的作用是使无血清动物细胞培养基干粉的各种组分均匀地混合,一般对分散剂没有特别的要求,只要不引入新的影响细胞生长的离子、污染杂质(如内毒素、微生物等),不改变该动物细胞培养基干粉分散于培养基溶剂后的适宜细胞生长的pH值范围、在不破坏培养基组分(比如使蛋白质变性)的前提下容易去除即可。因此所述分散剂优选选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水、超纯水、能与水以任意比互溶的醇、碱性水溶液和酸性水溶液中的一种或几种,其中所述碱性水溶液为氨水或者本发明无血清动物细胞培养基干粉中出现的阳离子的碱的水溶液,所述酸性水溶液为本发明中无血清动物细胞培养基干粉出现的酸根离子的酸的水溶液。所述能与水以任意比互溶的醇可以为乙醇、甲醇、丙醇中的一种或几种。所述碱性水溶液优选氢氧化钠的水溶液、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钙的水溶液、氨水、碱性氨基酸的水溶液中的一种或几种,最优选氢氧化钠的水溶液。所述酸性水溶液优选盐酸溶液、硫酸的水溶液、硝酸的水溶液、有机酸(碳酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、磷酸、酸性氨基酸)的水溶液中的一种或几种,最优选盐酸的水溶液。
本发明对所述无血清动物细胞培养基干粉中各个组分加入到分散剂中的顺序没有特别的要求。此外,可以将各种组分分散在同一种分散剂中,也可以将不同组分分散在不同的分散剂中,然后混合得到的分散体。优选后者,例如优选将维生素H、胸苷、次黄嘌呤分散于1-10重量%的氢氧化钠的水溶液(氢氧化钠的水溶液优选用重蒸水配制)中,可以适当加热至60℃;将酪氨酸分散于pH值为1的酸性水溶液(如用重蒸水配制的盐酸水溶液)中;将亲脂性物质(如亚油酸)先分散于低沸点亲水小分子有机溶剂(如乙醇)中。对于在培养基中含量很少的组分(比如含量不超过0.01g/100L的组分),在制备时,可以先用分散剂配制该组分的高浓度液体分散体,然后按照最终培养基干粉中该组分所需的定量以该高浓度液体分散体的形式使该组分与其他组分混合。所用分散剂的温度不应高于被分散组分的最低分解温度。
所述分散剂的用量没有特别的限制,只要能使培养基干粉的组分与分散剂形成均一稳定的分散体即可;另外,在满足前述条件的前提下,出于能耗的考虑,分散剂的用量越少越好。
可以采用本领域常用的方法除去分散剂,比如干燥。所述干燥可以为加热、真空干燥、真空冷冻干燥、干燥剂(如硅胶、氧化铝凝胶、分子筛、活性炭、骨炭、木炭、活性白土、五氧化磷、生石灰、氯化钙等)吸湿等。
本发明还提供了一种液体无血清动物细胞培养基,所述液体无血清动物细胞培养基包括培养基溶剂和分散在该培养基溶剂中的无血清动物细胞培养基干粉,其中,所述无血清动物细胞培养基干粉为本发明所述的无血清动物细胞培养基干粉中的一种或几种。
本发明液体无血清动物细胞培养基中所述培养基溶剂可以选自本领域用作培养细胞的各种培养基溶剂,优选选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水和超纯水中的一种或几种,更优选所述培养基溶剂为注射用水和/或超纯水。
本发明还提供了上述液体无血清动物细胞培养基的制备方法,该方法包括将无血清动物细胞培养基干粉分散在培养基溶剂中,过滤灭菌,其中,所述无血清动物细胞培养基干粉选自本发明所述的无血清动物细胞培养基干粉中的一种或几种。上述液体无血清动物细胞培养基的制备方法还可为将本发明所述的液体无血清动物细胞培养基的组分直接以固体形式一一分散在培养基溶剂中。对于所述液体无血清动物细胞培养基中含量很少的组分(比如含量不超过0.01g/100L的组分),在制备时,可以先用培养基溶剂配制该组分的高浓度液体分散体,然后按照最终液体培养基中组分所需的定量以该高浓度液体分散体的形式添加该组分。所用培养基溶剂的温度不应高于被分散组分的最低分解温度。
所述过滤灭菌的方法为本领域公知,可以采用孔径不大于0.22μm的滤菌膜,进行一次或几次过滤。所述无血清动物细胞培养基干粉在培养基溶剂中的分散可以通过本领域常用的各种分散方法实现,比如搅拌、超声振荡等。
本发明的无血清动物细胞培养基干粉、液体无血清动物细胞培养基对能够培养的细胞没有特别的限制,可以培养体细胞(如Vero细胞)或生殖细胞(CHO细胞),原代细胞(如地鼠肾细胞)或传代细胞(恒河猴肾细胞MA-104),癌细胞如hela细胞、正常细胞以及经过基因工程修饰的细胞(杂交瘤细胞)或经过人工选育的细胞(如BHK21细胞,即叙利亚地鼠肾细胞,又称金黄色仓鼠肾细胞)。本发明的无血清动物细胞培养基干粉、液体无血清动物细胞培养基对培养方式也没有特别的限制,可以用于贴壁培养、悬浮培养和固定化培养。更适于用在CHO细胞的悬浮培养过程中;还更适于用在BHK21细胞的悬浮培养过程中。CHO细胞可以作为多种抗体的表达载体。BHK21细胞可以作为多种病毒的宿主细胞。可以采用本领域常规的条件进行动物细胞培养,例如,悬浮培养过程中细胞的接种量可以为103-108个/毫升培养基,优选为细胞的接种量为105-106个/毫升培养基;培养的温度可以为30-38℃,湿度可以为90-98%和二氧化碳的浓度可以为3-8体积%,优选包括温度为35-37℃,湿度为92-96%以及二氧化碳的浓度为4-6体积%。其中,在悬浮培养中华仓鼠卵巢细胞时,细胞的接种量可以为103-108个/毫升培养基;培养的温度可以为30-38℃,湿度可以为90-98%和二氧化碳的浓度可以为3-8体积%。其中,在悬浮培养BHK21细胞时,细胞的接种量可以为103-108个/毫升培养基;培养的温度可以为30-38℃,湿度可以为90-98%和二氧化碳的浓度可以为3-8体积%。
除非特别说明,本发明使用的各种试剂均可以商购,也可以采用本领域常用的方法制备。用于细胞培养的试剂,不仅纯度要求高,优选分析纯,而且不能存在任何影响细胞正常生理活动的物质,因此还需要符合医药制品的要求,优选注射级原料药。
以下结合实施例,进一步说明本发明。
实施例1
本实施例用于说明本发明的无血清动物细胞培养基干粉及其制备方法,以及本发明液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
表5
表5及以下各表中固体组分的单位g/100L是指,以制备最终液体培养基所需使用的培养基溶剂的体积为基准,相对于每100升培养基溶剂,在制备最终液体培养基时需要加入的固体物质的克数。将表5所示的固体组分按照100升最终液体培养基的用量,用万分之一天平一一精确称量混合后,再加入50升蒸馏水,用上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司85-2型搅拌器搅拌2小时后,得到均匀分散体,使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司),按照该仪器说明书,在预冷温度-45℃,缓慢升温保持仪器内真空度9Pa下冷冻干燥50小时,得到本发明的无血清动物细胞培养基干粉。无血清动物细胞培养基干粉在常温下密封避光保存备用。
将上述制得的本发明的无血清动物细胞培养基干粉2565.756克,溶于30℃100L超纯水中,所得溶液使用0.20μm的滤菌膜过滤灭菌,即得液体无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
实施例2
本实施例用于说明本发明的无血清动物细胞培养基干粉及其制备方法,以及本发明液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
表6
表6所示的固体组分按照100升最终液体培养基的用量,用万分之一分析天平称取。其中,将维生素H、次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中,得到A溶液;将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、盐酸吡哆醛、重组人胰岛素、亚硒酸溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液;将亚油酸溶于10ml 99%的乙醇得到C溶液;将L-酪氨酸分散于pH值为1的盐酸蒸馏水溶液中得到D溶液,合并A溶液、B溶液、C溶液和D溶液,然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、五水硫酸铜、九水硝酸铁、HEPES、1,4-丁二胺二盐酸盐、i-肌醇、乙醇胺、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白、水稻蛋白,用蒸馏水定容至10000ml摇匀,收集所得混合液,使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司),按照该仪器说明书,在预冷温度-50℃,缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥40小时,即得到无血清动物细胞培养基干粉。无血清动物细胞培养基干粉在常温下密封避光保存备用。
将上述制得的动物细胞培养基干粉2757.757克,溶于80L超纯水中,然后用超纯水定容至100L。使用0.10μm的滤菌膜过滤灭菌,即得液体无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
实施例3
本实施例用于说明本发明的无血清动物细胞培养基干粉及其制备方法,以及本发明液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
表7
表7所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量,用万分之一分析天平称取。其中,将维生素H、次黄嘌呤、胸苷,溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中,得到A溶液;将亚油酸溶于10ml 99%乙醇溶液,得到B溶液;将氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、盐酸吡哆醛、重组人胰岛素、亚硒酸溶于1000ml蒸馏水中得到C溶液,合并A溶液、B溶液和C溶液,然后向所得混合溶液中加入葡萄糖,用蒸馏水定容至10000ml摇匀,收集所得混合液,使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司),按照该仪器说明书,在预冷温度-40℃,缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥30小时,得到冻干粉。将无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、无水氯化钙于105℃干燥2小时,将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、酚红于40℃下干燥1小时。将六水合氯化镁、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、五水硫酸铜、九水硝酸铁、HEPES、1,4-丁二胺二盐酸盐、i-肌醇、乙醇胺、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白、水稻蛋白、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺放入真空干燥箱内干燥20小时。将上述所有干燥后的组分以及冻干粉装入球磨罐内,球磨10小时,即得本发明无血清动物细胞培养基干粉。无血清动物细胞培养基干粉在常温下密封避光保存备用。
将实施例3制得的无血清动物细胞培养基干粉296.3368克,溶于8L超纯水中,然后用超纯水定容至10L。使用0.15μm的滤菌膜过滤灭菌,即得液体无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
实施例4
本实施例用于说明本发明的无血清动物细胞培养基干粉及其制备方法,以及本发明液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
表8
表8所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量,用万分之一分析天平称取。其中,将维生素H、次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中,得到A溶液;将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、盐酸吡哆醛、重组人胰岛素、亚硒酸溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液;将亚油酸溶于10ml99%的乙醇得到C溶液;将L-酪氨酸分散于pH值为1的盐酸蒸馏水溶液中得到D溶液,合并A溶液、B溶液、C溶液和D溶液,然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、五水硫酸铜、九水硝酸铁、HEPES、1,4-丁二胺二盐酸盐、i-肌醇、乙醇胺、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白、水稻蛋白,用蒸馏水定容至10L摇匀。即得液体无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
实施例5
本实施例用于说明本发明的无血清动物细胞培养基干粉及其制备方法,以及本发明液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
表9
将表9所示的固体组分按照100升最终液体培养基的用量,用万分之一天平一一精确称量混合后,再加入50升蒸馏水,用上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司85-2型搅拌器搅拌2小时后,得到均匀分散体,使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司),按照该仪器说明书,在预冷温度-45℃,缓慢升温保持仪器内真空度9Pa下冷冻干燥50小时,得到本发明的无血清动物细胞培养基干粉。无血清动物细胞培养基干粉在常温下密封避光保存备用。
将上述制得的本发明的无血清动物细胞培养基干粉2524.862克,溶于30℃100L超纯水中,所得溶液使用0.20μm的滤菌膜过滤灭菌,即得液体无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
实施例6
本实施例用于说明本发明的无血清动物细胞培养基干粉及其制备方法,以及本发明液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
表10
表10所示的固体组分按照100升最终液体培养基的用量,用万分之一分析天平称取。其中,将维生素H、次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中,得到A溶液;将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、盐酸吡哆醛、重组人胰岛素、亚硒酸溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液;将亚油酸溶于10ml 99%的乙醇得到C溶液;将L-酪氨酸分散于pH值为1的盐酸蒸馏水溶液中得到D溶液,合并A溶液、B溶液、C溶液和D溶液,然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、五水硫酸铜、九水硝酸铁、HEPES、1,4-丁二胺二盐酸盐、i-肌醇、乙醇胺、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白、水稻蛋白,用蒸馏水定容至10000ml摇匀,收集所得混合液,使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司),按照该仪器说明书,在预冷温度-50℃,缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥40小时,即得到无血清动物细胞培养基干粉。无血清动物细胞培养基干粉在常温下密封避光保存备用。
将上述制得的动物细胞培养基干粉2681.806克,溶于80L超纯水中,然后用超纯水定容至100L。使用0.10μm的滤菌膜过滤灭菌,即得液体无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
实施例7
本实施例用于说明本发明的无血清动物细胞培养基干粉及其制备方法,以及本发明液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
表11
表11所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量,用万分之一分析天平称取。其中,将维生素H、次黄嘌呤、胸苷,溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中,得到A溶液;将亚油酸溶于10ml 99%乙醇溶液,得到B溶液;将氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、盐酸吡哆醛、重组人胰岛素、亚硒酸溶于1000ml蒸馏水中得到C溶液,合并A溶液、B溶液和C溶液,然后向所得混合溶液中加入葡萄糖,用蒸馏水定容至10000ml摇匀,收集所得混合液,使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司),按照该仪器说明书,在预冷温度-40℃,缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥30小时,得到冻干粉。将无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、无水氯化钙于105℃干燥2小时,将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、酚红于40℃下干燥1小时。将六水合氯化镁、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、五水硫酸铜、九水硝酸铁、HEPES、1,4-丁二胺二盐酸盐、i-肌醇、乙醇胺、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白、水稻蛋白、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺放入真空干燥箱内干燥20小时。将上述所有干燥后的组分以及冻干粉装入球磨罐内,球磨10小时,即得本发明无血清动物细胞培养基干粉。无血清动物细胞培养基干粉在常温下密封避光保存备用。
将实施例7制得的无血清动物细胞培养基干粉257.3942克,溶于8L超纯水中,然后用超纯水定容至10L。使用0.15μm的滤菌膜过滤灭菌,即得液体无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
实施例8
本实施例用于说明本发明的无血清动物细胞培养基干粉及其制备方法,以及本发明液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
表12
表12所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量,用万分之一分析天平称取。其中,将维生素H、次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中,得到A溶液;将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、盐酸吡哆醛、重组人胰岛素、亚硒酸溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液;将亚油酸溶于10ml99%的乙醇得到C溶液;将L-酪氨酸分散于pH值为1的盐酸蒸馏水溶液中得到D溶液,合并A溶液、B溶液、C溶液和D溶液,然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、五水硫酸铜、九水硝酸铁、HEPES、1,4-丁二胺二盐酸盐、i-肌醇、乙醇胺、大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白、水稻蛋白,用蒸馏水定容至10L摇匀。即得液体无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
以上实施例1-8中所述植物蛋白按照如下方法制得,具体制备的条件参数见表13。所述方法包括以下步骤:
a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至0.1-3mm3颗粒;
b)在酶解时间为0.5-10h、酶解PH值为5-9、酶解温度为45℃-60℃、酶量为2-5重量%的条件下酶解步骤a)所得的颗粒;其中,所述酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或几种,所述酶的酶活≥1×105单位/克;
c)在80-100℃保持5-20min以终止步骤b)所述的酶解;
d)将步骤c)所得的酶解产物在3000-8000rpm下离心5-20min,收集上清液;
e)将步骤d)所得上清液用中空纤维过滤器超滤,所述过滤器所用膜的透过分子量为10000-20000道尔顿;
f)收集步骤e)所得超滤液,真空冷冻干燥,获得相应植物蛋白。
表13
对比例1
本对比例用于说明现有的液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
表14是CN 1318577C的实施例4记载表2的配方,按照该配方制备液体现有技术的无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
表14
对比例2
本对比例用于说明现有的液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。
按照WO 02/29084的表13(本申请排序为表15)记载的配方,制备液体现有技术的无血清动物细胞培养基,在2℃下冷藏备用。
表15
实验实施例1
在无菌条件下,用灭菌移液器分别将50ml上述液体无血清动物细胞培养基转移到250ml细胞培养摇瓶中,接种CHO细胞悬液,接种密度为5×105细胞/ml,每种培养基接种20瓶。然后在37℃温度条件、95%湿度条件及5%二氧化碳条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。用血球计数法记录单位天数的细胞密度,用MTT法测定活细胞密度。培养结果见表16及图7A。实施例1培养基培养72小时的细胞照片见图1A;对比例1培养基培养72小时的细胞照片见图2A;对比例2培养基培养72小时的细胞照片见图3A;实施例2细培养基培养72小时的细胞照片见图4A;实施例3培养基培养48小时的细胞照片见图5A;实施例4培养基培养48小时的细胞照片见图6A。
表16
从表16的结果可以看出,当本发明的无血清动物细胞培养基干粉或液体无血清培养基用于培养CHO细胞时,能够达到的细胞培养密度大大提高。
实验实施例2
在无菌条件下,用灭菌移液器分别将50ml上述液体无血清动物细胞培养基转移到250ml细胞培养摇瓶中,接种表达IgG抗体的CHO细胞悬液,接种密度为5×105细胞/ml,每种培养基接种20瓶。然后在37℃温度条件、95%湿度条件及5体积%二氧化碳条件下以90转/分钟的转速进行悬浮培养3-4天。重复上述过程进行五个批次的培养。培养结束后,取细胞培养物在2000g下离心,分离培养物上清液。用Protein A层析法分离目标抗体,用SDS-PAGE蛋白电泳方法测定纯度。
用ELISA法分别测定培养6天后细胞上清液中抗体的浓度,结果如表17所示。
表17
从表17可以看出,由于本发明培养基添加的成分确定,使被培养细胞的批次差异性大大减小,安全性更好。此外本发明培养基有利于分离细胞下游产品,使成本降低。
实验实施例3
在无菌条件下,用灭菌移液器分别将50ml上述液体无血清动物细胞培养基转移到250ml细胞培养摇瓶中,接种BHK21细胞悬液,接种密度为8×105细胞/ml,每种培养基接种20瓶。然后在37℃温度条件、95%湿度条件及5体积%二氧化碳条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。用血球计数法记录单位天数的细胞密度,用MTT法测定细胞活力(即活细胞占细胞总数的百分比)。。培养结果见表18及图7B。实施例5培养基培养72小时的细胞照片见图1B;对比例1培养基培养72小时的细胞照片见图2B;对比例2培养基培养72小时的细胞照片见图3B;实施例6细培养基培养72小时的细胞照片见图4B;实施例7培养基培养48小时的细胞照片见图5B;实施例8培养基培养48小时的细胞照片见图6B。
表18
从表18的结果可以看出,当本发明的无血清动物细胞培养基干粉或液体无血清培养基用于培养BHK21细胞时,能够达到的细胞培养密度大大提高。
实验实施例4
细胞培养基:按实施例5-8以及对比例1-2中配方配制BHK21无血清细胞培养基。
生物反应器:650L搅拌式生物反应器(北京清大天一生物技术有限公司)
培养体积:200L
接种密度:6×105
细胞培养条件:温度为37℃、pH值为7.3、溶氧60%。
培养7天,细胞密度为5×106细胞/ml左右时,按病毒感染复数MOI为0.1的量接种狂犬病病毒。
病毒维持液:除不包含蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白外,其他与细胞培养基相同。
病毒培养条件:温度为34℃、pH值为7.6、溶氧55%。
培养48小时后,以100-200升/天的速度从生物培养器下部灌注灭菌的新鲜病毒维持液,并从生物培养器上部接近培养基液面收集病毒。连续灌注培养10天,共收获1400升病毒溶液。用中国药典(2005版)人用狂犬病疫苗规程中的小鼠脑内测定法方法,从第二天起,对每天所取的反应器样品的狂犬病病毒滴度(LD50)进行测定。结果如表19所示。
表19
其中“/”表示病毒滴度过低,不能测出有效滴度。
从表19的结果可以看出,当本发明的无血清动物细胞培养基干粉或液体无血清培养基用于培养BHK21细胞并用于生产狂犬病病毒疫苗过程中时,能够收获到的病毒滴度大大提高,而且能够生产有效病毒滴度的周期延长。
实验实施例5
细胞培养基:按实施例5-8以及对比例1-2中配方配制BHK21无血清细胞培养基。
生物反应器:100L搅拌式生物反应器。
培养体积:50L
接种密度:3×105
细胞培养条件:温度为36℃、pH值为7.2、溶氧50%。
培养5天,细胞密度为1×106细胞/ml左右时,按病毒感染复数MOI为0.05的量接种口蹄疫病毒。
病毒培养条件:温度为35℃、pH值为7.4、溶氧50%。
病毒维持液:除不包含蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白外,其他与细胞培养基相同。
培养48小时后,以40升/天的速度从生物培养器下部灌注灭菌的新鲜病毒维持液,并从生物培养器上部接近培养基液面收集病毒。连续灌注培养15天,共收获450升病毒溶液。用乳鼠半数致死量测定方法,从6h起,对每6h或3h所取的反应器样品的口蹄疫病毒滴度(LD50)进行测定。结果如表20所示。
表20
从表20的结果可以看出,当本发明的无血清动物细胞培养基干粉或液体无血清培养基用于培养BHK21细胞并用于生产口蹄疫病毒疫苗过程中时,能够收获到的病毒滴度大大提高。
机译: 贴壁动物细胞无血清培养的方法和贴壁动物细胞无血清培养的培养基
机译: 用于哺乳动物细胞的无蛋白质和无血清培养的培养基,其用途,哺乳动物细胞的培养方法,蛋白质的生产方法,细胞培养物以及用于细胞培养的培养基的生产方法
机译: 用于哺乳动物细胞的无蛋白质和无血清培养的培养基,其用途,哺乳动物细胞的培养方法,蛋白质的生产方法,细胞培养物以及用于细胞培养的培养基的生产方法