一种快速检测啤酒中有害菌的方法

摘要

本发明公开了一种应用荧光原位杂交和荧光微菌落结合的技术为啤酒厂快速定性及定量检测有害菌的方法。包括样液及培养基的制备、荧光微菌落及荧光原位杂交试验操作。而后用荧光显微镜观察并计数，根据荧光探针与CFDA染料所被激发的不同颜色的荧光来定性及定量分析啤酒厂生产过程中所带来的有害菌。本发明还公布了两个特异探针，分别是用于短乳杆菌检测的探针：5’-TAGCCGGTGTAACCCTGACTCTG-3’，一端用Cy3标记；四联球菌检测探针：5’-GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAA-3’，其一端用Cy3标记。本发明通过把两种方法相结合，避免了荧光原位杂交不容易定量，实验结果易出现假阳性及假阴性的现象；同时也很好的解决了荧光微菌落技术不能定性的问题。达到了啤酒厂生产所需要的快速检测，并且定性及定量的要求。

说明书

技术领域

本发明属于啤酒技术领域。特别涉及一种应用荧光原位杂交技术及荧光微菌落技术相结合，专门用于啤酒中有害微生物快速检测的方法。

背景技术

啤酒有害菌是指能厌氧存活于包装啤酒中，引起啤酒变酸浑浊的一类细菌，这种细菌主85％以上是由乳酸菌类，如短乳杆菌，四联球菌等组成。对啤酒生产中有害菌的检测是各啤酒厂为避免生产损失所必须面对的任务，也是全世界饮料行业所重点关注的问题。在传统的啤酒微生物检测中，第一步往往是在选择性培养基上筛选微生物，这是一个定量的过程。在第一步的基础之上再进行进一步的分析，比如显微镜观察、过氧化氢酶实验和PCR鉴定实验等，来进一步鉴定啤酒腐败菌，这是一个定性的过程。这些传统的啤酒有害军定量定性过程往往需要足够长的时间，定量过程就需要一周或者更长时间，定性做生理鉴定要5-7天时间，分子鉴定也要3-5天时间，总计要半个月左右的时间，这样就不能及时的反映生产过程污染状况，使微生物检测滞后于啤酒生产，往往都是在啤酒质量出现问题才能去发现和补救，造成很多食品质量问题，如浑浊，发酸等。因此如何提高啤酒有害菌检测速度就是啤酒生产过程中微生物检测的两个决定性因素，就是如何快速实现定性定量。

荧光原位杂交技术(FISH)可以快速检测微生物，并根据探针不同来定性微生物，能够同时提供关于微生物形态、数量、空间分布与细胞环境方面的信息，使人们可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体。目前，FISH技术在国外已有广泛的应用，K.Thelen已经将标记有荧光的基因探针用于啤酒腐败菌中的快速检测；Sergi Ferrer等人也已经应用FISH技术检测白酒中的乳酸菌，都在有害菌的快速检测中取得了很好的效果。但是，FISH技术在上述应用方面也存在缺陷。例如，在营养饥饿状态下，细菌的染色体含量降低，因而细胞中的16S rRNA减少，会导致荧光杂交信号减弱形成假阴性结果，导致检测结果偏低。这是十分致命的，因为检测结果现实无菌，但实际上酒里面有很多菌。另外，细菌普遍存在的自发荧光现象及探针的特异性不足还可能导致假阳性结果。因此，虽然荧光原位杂交技术已经有了很广泛的应用，但是，在定量问题上仍没有很好的解决办法。

微菌落技术同样是一种快速检测细菌的方法，在检测细菌方面同样有很广泛的的应用。裴晓芳等用醋酸纤维素薄膜作载体，建立了一种新颖的、快速的、简单实用的微菌落技术，Nobuyasu等采用荧光微菌落对透析液中的细菌进行检测，采用微菌落法可以将检测时间缩短到48h内，而常规的检测需要7天。微菌落技术大大提高了检测的时间和准确度。但是，该技术存在不能定性的缺点，因此不能为啤酒厂提供精确的污染菌方面的信息，不知道是何种菌污染了啤酒，不能区别是否是啤酒有害菌。

目前，如何快速定性并且准确定量的检测啤酒生产过程中有害菌成了困扰啤酒行业的一大难题。

发明内容

本发明的目的是利用荧光原位杂交与荧光微菌落结合的技术快速检测啤酒厂中的有害菌。当把微菌落技术和荧光原位杂交技术结合后，可以使荧光原位杂交检测的不再是单个菌，而是菌落，这样可以很好的避免假阳性及假阴性的现象发生。同时，微菌落技术作为一种可以在短时间培养后定量的技术，和FISH结合以后，可以完善FISH技术不容易定量的特点。另一方面，FISH技术根据其探针的特异性同样弥补了微菌落技术不能够定性检测的缺憾。从而，达到啤酒厂生产所需要的实现短时间内对所检测微生物既定性又定量的要求。

本发明由以下步骤组成：

(1)快速增菌培养基的制备

培养基：取快速增菌培养基粉末(蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，吐温80，磷酸氢二钾，醋酸钠，叶酸，放线菌酮，琼脂，葡萄糖，麦芽根浸粉，泛酸钙组成)溶于蒸馏水中，121℃灭菌15分钟，倒平板。该培养基能让有害菌快速增长，加快检测时间。

(2)微菌落试验

取含菌的样液300-500mL，将经过高温灭菌的聚碳酸酯膜放至抽滤系统进行抽滤，而后取出滤膜光面向上贴于快速增菌培养基平板上，于28℃放入厌氧罐中厌氧培养16h后，(兼性四联球菌仅需5小时)，进行荧光染色，将聚碳酸酯膜放于浸湿CFDA染色液的无菌滤纸上，避光染色5-15分钟，然后取出放至浸湿无菌水的无菌滤纸上洗去膜片下面的染色液。

(3)荧光原位杂交试验

将进行过CFDA染色的膜片直接进行荧光原位杂交实验。先用乙醇固定然后用蛋白酶溶菌酶处理的方式效果很差，荧光信号微弱不利于检测。为了可以使探针更好的与菌的RNA结合，采用了首先将膜片进行蛋白酶K 58℃处理10min，接着取出膜片，浸入含有溶菌酶的磷酸缓冲液中处理10min。取出后，放入有乙醇的染色缸中，最后再在质量分数为50％，80％，100％乙醇中脱水，每一醇度浸泡3min。室温下直立干燥，这样效果取得了显著提高。添加10μL体积预先设计好的探针溶液(50ng/μL)，该探针根据不同的有害菌设计不同的探针序列，可以定性有害菌。和90μL杂交缓冲液到微量离心管中，冰浴中避光保存。杂交箱里放吸水纸，用杂交液湿润。添加20μL的杂交混合液、10μL的blocking regent到膜片上与样品混合，将膜片放入杂交箱里，恒温箱中进行杂交反应。杂交缓冲液、杂交洗脱液、杂交温度与时间经由探针优化条件确定。

在从杂交箱里取出膜片前，将盛有清洗液的一个染色缸在48℃震荡水浴锅中预热。把膜片放入预热后的清洗液中，震荡洗涤膜片20-25min，清洗后取出膜片放至浸湿无菌水的无菌滤纸上洗去膜片下面的洗脱液。

待洗脱液洗脱后，将膜片放到整片大玻璃载玻上在荧光显微镜4×或10×下观察计数，采用蓝光激发。随机观察30-40个视野的微菌落，按下式计算样本中的菌落数：

$X=\frac{A}{40}\times {\left(\frac{{\Phi }_1}{{\Phi }_2}\right)}^2÷V$

X为样本菌落总数(cfu/ml)；A为30-40个视野微菌落总数(cfu)；Φ₁为滤膜有效过滤直径(mm)；Φ2为油镜视野直径(mm)，V为滤过的样液量(ml)。计数后采用红光激发，观察荧光原位杂交实验结果。并对菌进行定性分析。

本发明主要有以下优点和显著进步：

其一，本发明不但比传统的检测方法缩短了大量的时间，由传统培养的15天，缩短到了10-20小时便可以定性定量检测厌氧菌，方法同时可以检测好氧菌，由于好养菌生长比厌氧菌快，所以该方法10多个小时就可以定性定量检测好氧菌。同时避免了检测中出现的假阳性及假阴性的现象，并且可以达到啤酒厂检测的定性及定量的要求。

其二，本发明采用的探针是针对啤酒厂所污染的菌种分离后进行PCR测序、比对后设计的，对检测啤酒中的最常见的有害菌具有很好的特异性。本发明主要针对最常见的短乳杆菌，和四联球菌为例设计，其探针序列分别为短乳杆菌：5’-TAGCCGGTGTAACCCTGACTCTG-3’，一端用Cy3标记；四联球菌：5’-GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAA-3’，其一端用Cy3标记。

其三，本发明所使用的激发光为蓝色激发光及绿色激发光两种。可以对不同荧光染料的颜色进行很好的区分，便于实验观察及计数。并且通过两张不同颜色图片的结合，可以清晰的看出特异性菌所占的比例，观察更加直观。

其四，本发明所使用的杂交载体是聚丙烯碳酸酯膜，抽滤后的菌直接在膜片上进行培养，而后进行荧光微菌落及荧光原位杂交实验，与传统荧光原位杂交在玻片上进行杂交的方法减少了在操作过程菌的损失，传统的玻片上杂交根本不适合工业生产检测应用目的，因为在将菌体转移到玻片上的过程中，由于细胞太小，会大量损失，不能反映真实情况。本方法菌在膜片上固定较好，省去了荧光原位杂交固定的步骤，减少了实验操作也就减少了实验误差。

因此，该方法在啤酒厂检测有害菌的方面具有广阔的推广和应用前景。

具体实施方式

实施例1

取某啤酒厂生产车间压盖清酒1瓶(600mL)，对100mL酒样进行抽滤后，取出滤膜光面向上贴于快速增菌培养基(蛋白胨8g，酵母膏6g，牛肉膏6g，吐温800.8g，磷酸氢二钾2g，醋酸钠6g，叶酸0.2g，放线菌酮6mg，琼脂15g，葡萄糖15g，麦芽根浸粉0.5g，泛酸钙0.4g)平板上，于28℃放入厌氧罐中厌氧培养16h后，进行荧光染色，将聚碳酸酯膜放于浸湿CFDA染色液的无菌滤纸上，避光染色12分钟，然后取出放至浸湿无菌水的无菌滤纸上洗去膜片下面的染色液，接着将该膜片按照实验步骤进行荧光原位杂交操作，添加10μL体积预先设计好的Cy3标记的短乳杆菌探针溶液(50ng/μL)，和90μL杂交缓冲液到微量离心管中，冰浴中避光保存。杂交箱里放吸水纸，用杂交液湿润。添加20μL的杂交混合液、10μL的blocking regent到膜片上与样品混合，将膜片放入杂交箱里，恒温箱中进行杂交反应。杂交缓冲液、杂交洗脱液、杂交温度49℃反应90分钟经由探针优化条件确定。

在从杂交箱里取出膜片前，将盛有清洗液的一个染色缸在48℃震荡水浴锅中预热。把膜片放入预热后的清洗液中，震荡洗涤膜片20-25min，清洗后取出膜片放至浸湿无菌水的无菌滤纸上洗去膜片下面的洗脱液。待洗脱液洗脱后，将膜片放到载玻片上在荧光显微镜4×或10×下观察计数，采用蓝光激发。随机观察30-40个视野的微菌落，并代入公式记录菌落数。

上述实例是通过对压盖清酒进行检测得到的结果，其结果表明，该方法可以快速检测啤酒中所污染的微生物数量及最常见的短乳杆菌的污染数量。

实施例2

取某啤酒厂生产车间用水100mL，对水样进行抽滤后，取出滤膜光面向上贴于营养琼脂平板上，于36℃好氧培养5h后，进行荧光染色，将聚碳酸酯膜放于浸湿CFDA染色液的无菌滤纸上，避光染色12分钟，然后取出放至浸湿无菌水的无菌滤纸上洗去膜片下面的染色液，接着将该膜片按照实验步骤进行荧光原位杂交操作，其中荧光探针为Cy3标记的四联球菌探针。待处理完成后，置于奥林巴斯BX41显微镜下进行观察，并记录实验结果。

该方法可以快速检测啤酒中所污染的微生物数量及最常见的四联球菌的污染数量。