一种呼吸道合胞病毒体疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种呼吸道合胞病毒体疫苗，主要包括RS Virosom。该Virosome包含有RSV完整的病毒表面，可以激发良好双重的细胞及体液免疫应答。经此形成的Virosome蛋白抗原加入或不加入佐剂，制备的注射剂型、喷鼻剂型、舌下含片剂型、透皮剂型免疫接种不同动物或人群后，可安全、有效预防RSV感染，为不同年龄人群安全、有效免疫防控RSV感染提供了理想疫苗。研究表明本发明呼吸道合胞病毒体疫苗对不同年龄人群具有好的免疫保护效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种呼吸道合胞病毒体疫苗及其制备方法，特别涉及一种具有呼吸道合胞病毒完整表面抗原的病毒体(Virosome)疫苗及其制备方法。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)，是在世界范围存在并引起婴幼儿下呼吸道感染的主要原因之一，RSV感染可以引起一系列的呼吸道疾病，从简单的感冒症状到严重的下呼吸道感染及并发症。RSV的首次感染多发生于2月龄婴儿，感染率高达83％，且感染后不会产生持久的免疫力，有50％的婴幼儿会在首次感染后的1～2年再次感染。同时，RSV在青少年、老年人以及免疫缺陷人群中也是一种常见而重要的病原体。RSV属于副粘病毒科、肺炎病毒属的单股负链非节段性RNA病毒，其核心是由核衣壳包裹的RNA、外层包被有出芽时来自宿主的脂质双分子层、以及穿越其中的跨膜蛋白组成。RSV的RNA共编码10种蛋白质：三个跨膜蛋白(G、F、SH)、两个基质蛋白(M、M2)、三个核衣壳蛋白(N、P、L)和两个非结构蛋白(NS1、NS2)。其中三种跨膜糖蛋白与免疫保护及致病毒力密切相关，分别是融合蛋白(F)、黏附蛋白(G)、以及小疏水蛋白(SH)。研究显示，抗F抗体可以阻止RSV与宿主细胞融合，而抗G抗体可以阻止RSV向宿主细胞的贴附，这使得F蛋白和G蛋白被认为是RSV的主要保护性抗原。F蛋白是RSV的一个重要保护性抗原，它是保护性中和性抗体的一个重要靶位点。同时有证据表明，F蛋白还是CD8+T细胞的一个重要靶位点。G蛋白有一个疏水的N末端，通过该N末端把G蛋白锚定在病毒脂质包膜上，根据所暴露的胞外区蛋白序列的差异，可将RSV分为A和B两个亚型。同时G蛋白还存在另外一种分泌型G蛋白，分泌型G蛋白缺少了N末端的65个氨基酸残基，只留高度糖基化的胞外区，有研究表明，该分泌型片断有可能导致免疫应答向Th2方向发展。由此，RSV感染宿主诱发异常天然免疫与获得免疫应答是导致Th1/Th2平衡失调并造成免疫损伤的危险信号。

众所周知，疫苗是防控传染病最有效的手段，至今还没有被批准的疫苗用于RSV免疫预防。近年研究显示，RSV感染对固有免疫应答能力弱，使得Th2免疫应答强，造成Th1/Th2平衡失调，产生大量炎性分子与趣化因子，且产生中和性抗体不成熟，引起免疫损伤是RSV疫苗研究的科学问题。在上世纪70年代，美国首次推出的福尔马林灭活RSV疫苗(FI-RSV疫苗)，接种2～7个月的婴幼儿，有80％的婴幼儿出现了病情加重，且有两例死亡，由此发现死者肺部出现了大量的嗜酸性细胞浸润和炎性分子与趣化因子，使得Th1/Th2平衡紊乱。因为FI-RSV引起了过高的Th2免疫应答反应，造成CD4+T细胞激活和增殖后分泌一些炎性与趣化因子，且加速了肺部的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的产生和浸润、产生低亲和力保护性抗体，另外损伤了CD8+T细胞活性和功能，最终导致了RSV清除过程缓慢、肺部损伤及病毒开始大量传播，由此F1-RSV疫苗以失败而告终。由此克服这几个难点，是开发RSV疫苗的基本原则。近些年国外学者开展一种温度敏感型RSV弱毒苗和一种携带RSV的F蛋白的重组人/牛副流感病毒活疫苗、RSV重组亚单位疫苗类型及佐剂与免疫途径等研究，其目的是改变免疫应答类型，使得Th1/Th2免疫应答趋于平衡，有了实质性进展。因此，寻找新的技术策略、研发免疫应答平衡的RSV疫苗，是安全、有效免疫防控RSV的重大科学前提。

病毒体(Virosome)是一类病毒样颗粒(Virus-like practical，VLP)，是重新装配的病毒表层。包括跨膜蛋白及病毒包膜，但是缺乏病毒的基质蛋白及遗传物质。病毒体的形成是通过将病毒溶解在去污剂中，此时的病毒包膜及其上的跨膜蛋白会分散开并溶解在去污剂中，而使其中包裹的病毒核心暴露出来并悬浮在去污剂中，此时如果应用超离心的方法会轻而易举的将病毒核心去掉，而只留下溶解在去污剂中的含有跨膜蛋白的脂质包膜。由于脂质包膜是在病毒出芽时来自自宿主细胞的磷脂双分子层，所以如果将去污剂去掉，脂质包膜会复合成原样，形成一个缺乏遗传物质的病毒体。病毒体不只是一个缺乏遗传物质的病毒，更确切地说，它应该是一个技术平台。荷兰MEmytic BV公司已经开发出两种基于病毒体的产品，一种是名为Inflexal^的流感病毒体；另一种是名为Epaxal^的甲肝病毒体。R.Mischler等人(Vaccine，2002)对Inflexal^的应用作了跟踪调查，结果非常理想。依靠病毒体平台，首先可以开发针对该病毒的疫苗。其次，基于其良好的佐剂特性，我们可以将其他蛋白抗原、脂类、甚至是佐剂加到病毒体的包膜中，形成病毒体，从而达到预期的目的。目前还没有成功的RS Virosome疫苗，由此开发RS Virosome是一项极其有潜在意义的发展疫苗。另外，Virosome还表现出许多理想的特点：首先，Virosome可以激发理想的双重细胞和体液免疫应答；其次，产生的抗体主要是中和性抗体。同时由于其天然的佐剂特性，Virosome可以作为一个携带外源抗原的载体，从而用于多价疫苗、药物传递以及粘膜传递系统。

发明内容

本发明目的在于公开一种呼吸道合胞病毒体疫苗，本发明的目的还在于公开该疫苗的制备方法。

本发明目的是通过如下方案实现的：

本发明呼吸道合胞病毒体疫苗含有呼吸道合胞病毒的完整病毒表面所组成的病毒体(Virosome)，即呼吸道合胞病毒体(RS Virosome)，该Virosome具有和活病毒完全一致的表面结构和功能；本发明呼吸道合胞病毒体疫苗还携带有RSV天然病毒的表面G、F、SH糖蛋白及脂质双脂层有效抗原成分，其中，所述RSV Virosome包括RSV A亚型RS Virosome A和B亚型RS Virosome B。

本发明呼吸道合胞病毒体疫苗可不含有或含有佐剂；其中，所指佐剂为如下中的一种：①氢氧化铝或磷酸铝；②SP01佐剂：由角鲨烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚水包油组成水包油佐剂；③SP02佐剂：在SP01佐剂中加20μg重组细菌鞭毛蛋白或P3BSK4；④P3BSK4(N-palmitoyl-S-[2，3-bis(palmitoy-loxy)-(2RS)-propul]-[R]-propyl-[R]-cysteinyl-[S]-seryl-[S]-(lysyl)3-lysine)；⑤水凝胶佐剂：季胺化的壳聚糖、⑥rLT：重组不耐热性肠毒素。

本发明呼吸道合胞病毒体疫苗可制备成临床可接受的剂型：注射剂型、喷鼻剂型、舌下含片、透皮贴剂或微针剂型。

本发明呼吸道合胞病毒体疫苗包括：RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+RS Virosome B(RSV Virosome A+B)疫苗。

本发明呼吸道合胞病毒体(RS Virosome)的制备方法包括如下步骤：①在宿主细胞系中培养大量增殖病毒；②收集并纯化病毒；③用去污剂裂解病毒，使病毒表面包膜携带跨膜蛋白一起溶解于去污剂中；④通过超离心，去除病毒核心；⑤通过透析，去除去污剂，使破碎的病毒表面包膜重新组装成携带有跨膜蛋白的完整RS Virosome；⑥提供一种用于繁殖RSV的细胞系，经转染后可以高效率释放RSV；其中，所述RS Virosome包括RSV A亚型RS Virosome A及B亚型RS Virosome B。

本发明呼吸道合胞病毒体(RS Virosome)的制备方法中向呼吸道合胞病毒体引入脂类佐剂的方法包括如下步骤：①病毒收集并纯化；②加入去污剂，裂解病毒，并通过超离心去除病毒核心；③同时用所述去污剂溶解佐剂；④将按2∶1∶3.5∶3.5的比例配制的PC/PE/SM/Chol溶解在按2∶1配制的氯仿/甲醇溶剂中；将溶液布满在玻璃试管的管壁上，使其干燥为薄膜，并在真空环境中，使残留溶剂挥发完全；⑤将步骤②所述溶解有病毒包膜的去污剂、以及步骤③所述溶解有佐剂的去污剂加入步骤④中；⑥透析去除去污剂，重建病毒体；⑦提供一种用于繁殖RSV的细胞系，经转染后可以高效率释放RSV；其中，所述脂类佐剂为①P3BSK4(N-palmitoyl-S-[2，3-bis(pal-mitoyloxy)-(2RS)-propul]-[R]-propyl-[R]-cysteinyl-[S]-seryl-[S]-(lysyl)3-lysine)；②重组细菌鞭毛蛋白。

本发明呼吸道合胞病毒体(RS Virosome)的制备方法中RSV细胞的培养方法为：在细胞培养基中加入2-100μg/mL的糖胺聚糖，优选10μg/mL；其中，所指糖胺聚糖为硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素，优选肝素。

本发明呼吸道合胞病毒体(RS Virosome)的制备方法中RSV细胞的纯化方法为：蔗糖梯度离心或柱层析纯化方法；其中，所述蔗糖梯度离心法选用最佳蔗糖浓度为30％、45％与60％；所述柱层析纯化法选用Sepharose6FFTM分子筛并进行DEAE-SepharoseFFTM离子交换。

其中，所述的蔗糖梯度离心方法的具体步骤为：①收集培养完成的RSV细胞，离心去除细胞及杂质；②取上清液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用PBS缓冲液配置，体系采用30％蔗糖3-5mL；45％蔗糖3-5mL；60％蔗糖0.5-1.5mL；4℃100000g离心2h；③吸取30％与45％夹层，加入2-3mL PBS稀释后继续4℃100000g超离心2h；④收集沉淀，并用折射仪测量密度；保存于RSV保存液中备用。

本发明呼吸道合胞病毒体(RS Virosome)的制备方法中所述的裂解病毒的去污剂拥有14mM的较高的临界胶束浓度；所述去污剂为所述去污剂为DCPC、Triton X-100、Octylglucoside(OG)、Octaethyleneglycol monoether(C12E8)、DHPC或CHAPS。

本发明呼吸道合胞病毒体(RS Virosome)的制备方法中所述的裂解病毒和去除病毒核心的步骤为：①将灭活后的RSV在100000g，4℃，离心2h，取沉淀用pH7.4 350-400μL无菌HNE Buffer溶解，于2-8℃保存；②加等量200mM DCPC，冰上孵育30-60min，使病毒裂解；于100000g，4℃，离心2h，去除病毒核蛋白及衣壳；③上清液用0.22μm滤器过滤，去除杂质备用。

本发明呼吸道合胞病毒体(RS Virosome)的制备方法中所述的病毒体重建的步骤为：将上清液用HNE稀释5倍，再将上清液加入到透过率为10kD的透析袋中，在1-3L HNE中4℃透析过夜，换液后，继续透析3-5小时。

上述呼吸道合胞病毒体按常规方法制成疫苗，再进一步制备成临床可接受的剂型：注射剂型、喷鼻剂型、舌下含片、透皮贴剂或微针剂型。

本发明产品及方法中所述的百分含量均为质量体积百分含量。

本发明涉及一种呼吸道合胞病毒体疫苗，主要包括RS Virosom。该Virosome包含有RSV完整的病毒表面，可以激发良好双重的细胞及体液免疫应答。经此形成的Virosome蛋白抗原加入或不加入佐剂，制备的注射剂型、喷鼻剂型、舌下含片剂型、透皮剂型免疫接种不同动物或人群后，可安全、有效预防RSV感染，为不同年龄人群安全、有效免疫防控RSV感染提供了理想疫苗。本发明进行了药效实验，分别通过注射、喷鼻、舌下含片、透皮等途径免疫Balb/C小鼠、恒河猴敏感动物产生好的体液免疫与细胞免疫应答及天然免疫与获得性免疫应答以及黏膜免疫应答效果，且Th2/Th1免疫应答趋于平衡，没有免疫肺损伤的迹象，具有安全性。本发明呼吸道合胞病毒体疫苗免疫棉鼠、恒河猴敏感动物两次，进一步通过A型标准株RSV A2、B型标准株G8537及我国不同地区临床分离代表优势A和B型RSV流行野生株有95％以上的免疫保护效果。用本发明呼吸道合胞病毒体疫苗接种不同年龄段(2岁以下、3-17岁、18-59岁、60岁以上)人群，0，21天免疫两次，分别采用注射、喷鼻、舌下含片、透皮剂型疫苗免疫，均显示各年龄段人群没有出现不适，具有安全性。并能产生好的双重免疫应答和免疫保护力，其保护率达90％以上，由此表明研发的呼吸道合胞病毒体疫苗对不同年龄人群具有好的免疫保护效果。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1  本发明RSV Virosome疫苗的检定实验

本实验测定实施例7所述疫苗制备的RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗注射、喷鼻、舌下含片、透皮剂型外观见均一，无异味和染菌；通过豚鼠、家兔试验无热原、异常毒性和急性毒性反应；通过Lorry法测定蛋白含量均在剂量范围；通过电镜观察VLP直径约140-160μm；ELISA测定DNA含量均在50EU以下；通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在；通过免疫Balb/C小鼠1次血清中和抗体效价在3200以上。

实验例2  本发明RSV Virosome疫苗对Balb/C小鼠体内的免疫应答效果实验

本发明实施例7制备的RSVirosome A疫苗、RSVirosome B疫苗、RSVirosome A+B疫苗加入或不加入相应佐剂制备的注射、喷鼻、舌下含片、透皮疫苗剂型，并用PBS、铝盐、SP01、SP02、P3BSK4、rLT、细菌鞭毛为对照组，分别按各自途径免疫6-8周Balb/C小鼠，其免疫剂量按实施例7疫苗低剂量组，免疫两次(0，21天)；末次免疫后14天采集各组小鼠的尾静脉血、分离血清和免疫细胞，采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价在6400以上，采用MTT法测定中和抗体效价在3200以上，采用流失细胞仪、ELISPOT仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Th1应答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗体效价在160以上。结果显示，本发明RSVirosome疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组、高剂量高于低剂量组免疫应答效果，而对照组没有产生双重免疫应答；制备的NDV-NH/RSV VLP疫苗不管是注射还是喷鼻、舌下含片、透皮贴剂、微针剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于微针剂型、喷鼻、舌下含片、透皮贴剂型，喷鼻、舌下含片、微针剂型黏膜和细胞免疫效应好于注射剂型；制备的RS Virosome A+B疫苗免疫应答效力优于RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗。由此制备的RS Virosome疫苗在小鼠体内具有好的免疫应答效果。

实验例3  本发明RSV Virosome疫苗对棉鼠体内的免疫保护效果实验

本发明实施例7制备的RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗加入或不加入相应佐剂制备的注射、喷鼻、舌下含片、透皮疫苗剂型为试验组，并用PBS、铝盐、SP01、SP02、P3BSK4、rLT、细菌鞭毛及F1-RSV灭活疫苗为对照组，分别按各自途径免疫6-8周棉鼠，其免疫剂量按实施例7疫苗低剂量组，免疫两次(0，21天)，末次免疫后14天各试验组、对照组小鼠用3×106pfu临床分离RSV代表株(A、B型)分别气溶胶鼻腔攻毒观察保护效果。结果显示，本发明RS Virosome疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90％以上，且RS Virosome A+B疫苗保护率达98％、RS Virosome A疫苗保护率达96％、RS Virosome B疫苗保护率达94％，而对照组FI-RSV灭活疫苗保护率达60％、其他各对照组保护率达为0％。由此制备的RS Virosome疫苗在小鼠体内具有高效的免疫保护效果。

实验例4  本发明RSV Virosome疫苗对恒河猴体内的免疫应答及免疫保护效果实验

本发明实施例7制备的RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗加入或不加入相应佐剂制备的注射、喷鼻、舌下含片、透皮疫苗剂型，并用PBS、铝盐、SP01、SP02、P3BSK4、rLT、细菌鞭毛和F1-RSV灭活疫苗为对照组，分别按各自途径免疫3岁恒河猴，其免疫剂量按实施例7疫苗高剂量组，免疫两次(0，21天)；末次免疫后14天采集各组小鼠的尾静脉血、分离血清和免疫细胞，采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价在12800以上，采用MTT法测定中和抗体效价在6400以上，采用流失细胞仪、ELISPOT仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Th1应答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗体效价在200以上。结果显示，本发明RS Virosome疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组、高剂量高于低剂量组免疫应答效果，而对照组没有产生双重免疫应答；本发明RS Virosome疫苗不管是注射还是喷鼻、舌下含片、透皮贴剂、微针剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于微针剂型、喷鼻、舌下含片、透皮贴剂型，喷鼻、舌下含片、微针剂型黏膜和细胞免疫效应好于注射剂型；本发明RS Virosome A+B疫苗免疫应答效力优于RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗。由此制备的RS Virosome疫苗在恒河猴体内具有好的免疫应答效果。

呼吸道合胞病毒体疫苗末次免疫后14天各试验组、对照组恒河猴用2×107pfu临床分离RSV代表株(A、B型)分别气溶胶鼻腔攻毒观察保护效果。结果显示，本发明RS Virosome疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90％以上，且RS Virosome A+B疫苗保护率达100％、RS Virosome A疫苗保护率达98％、RS Virosome B疫苗保护率达96％，而对照组F1-RSV灭活疫苗保护率达68％、其他各对照组保护率达为0％。由此制备的RS Virosome疫苗在恒河猴体内具有高效的免疫保护效果。

实验例5  本发明RSV Virosome疫苗对人群体内的免疫应答及免疫保护效果实验

本发明实施例外制备的RS Virosome疫苗加入或不加入相应佐剂的注射、喷鼻、舌下含片、透皮疫苗剂型，并用PBS、铝盐、SP01、SP02、P3BSK4、rLT、细菌鞭毛为对照组，分别按各自途径接种健康不同年龄人群(2岁以下、2-17岁、18-59岁、60岁以上)组，2岁以下、2-17岁年龄组免疫剂量按实施例7疫苗低剂量、18-59岁、60岁以上年龄组免疫剂量按实施例7疫苗高剂量，接种两次(0，21天)，末次免疫后14天采集各组人群静脉血、分离血清和免疫细胞，采集鼻腔灌洗液，并全程观察试验疫苗组人群生命体征变化。通过ELISA法测定血清抗体效价在3200以上，采用MTT法测定中和抗体效价在1600以上，采用流失细胞仪、ELISPOT仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化TH2/Th1应答趋于平衡，采用ELISA法鼻腔灌洗液SIgA抗体效价在60以上；全过程观察接种疫苗人群90天无明显不适等反应症状；通过现场流行病学经过360天的跟踪随访其疫苗有很好的免疫保护效果，其保护率达85％以上，且RS Virosome A+B疫苗保护率达96％、RS Virosome A疫苗保护率达94％、RS Virosome B疫苗保护率达92％，而各对照组保护率达为12％。由此制备的A、B型RS Virosome疫苗不管是注射或是喷鼻或是舌下含片或是透皮免疫接种在不同年龄人群中有很好的免疫应答和免疫保护效果。

实验例6  本发明RSV Virosome疫苗中RSV病毒体疫苗的安全性实验

(1)无菌、支原体试验：将实施例7制备的RS Virosome疫苗接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25℃、35℃。结果显示，A、B型RSV病毒体疫苗未见细菌生长。将RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗分别用半流体和肉汤培养基，37℃初代培养21天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示RS Virosome疫苗无支原体生长；用DNA染色法将毒种接种2BS细胞培养3天，传代一次，用二苯甲酰胺荧光染料染色。结果显示，RS Virosome疫苗无支原体生长。

(2)溶血性试验：选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗(由实施例7制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此，RS Virosome疫苗无溶血反应。

(3)急性毒性试验：取实施例7制备的RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗0.5ml腹腔注射体重为12～18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明RS Virosome疫苗在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重为8～10kg的Beagle狗体内的急性毒性结果：取实施例7制备的RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗肌肉注射15mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，RSV Virosome疫苗无急性毒性反应，使用是安全的。

(4)过敏试验研究：取实施例7制备的RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗皮下接种体重为250～350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5ml，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳静脉给予相同RS Virosome疫苗0.5ml，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，RS Virosome疫苗在动物体内无过敏反应。

(5)兔热源质试验：取预检合格的体重为2～3kg家兔3只固定，30分钟后测量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0.2℃，各家兔2次平均温度在38.6-39.5℃。将实施例7制备的RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗预热至38℃，于第2次测温后15分钟内，自家兔耳边静脉缓缓注入0.5ml/只。注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6次。结果显示：RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗给予家兔个体升温未超过0.2℃，3只家兔升温总和未超过0.4℃，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的RS Virosome疫苗疫苗无热源质。

(6)免疫病理损伤试验：由实施例7制备的RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗通过小鼠、恒河猴和人群外周血抗体亚型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性细胞及气管、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等检测。试验结果显示，RS Virosome疫苗免疫接种不管在大小动物，或是在人体内Th2/Th1免疫应答趋于平衡，没有免疫器官损伤的迹象，因此具有安全性。

实验例7  本发明RSV Virosome疫苗的稳定性实验

由实施例7制备的RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RSV Virosome A+B疫苗，分别置于2-8℃、室温(20-25℃)、37℃1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样观察外观、PH值、无菌、电镜观察粒径、免疫动物观察安全性。结果显示：RS Virosome A疫苗、RS Virosome B疫苗、RS Virosome A+B疫苗放置2-8℃24个月内均无变色分层等现象，pH值在7.0-7.2之间无变化，电镜观察粒径大小保持一致，且注射或滴鼻或透皮给Balb/c小鼠表现正常；RS Virosome疫苗放置室温25℃3个月内均有好的稳定性；RS Virosome疫苗放置室温37℃1个月内均有好的稳定性效果。由结果说明，RS Virosome疫苗放置2-8℃理化性质、生物学性能稳定，有效期至少24个月。

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

具体实施方式

实施例1：呼吸道合胞病毒体疫苗株筛选及确定

从我国东西南北中不同地区20个省市CDC现场收集呼吸道感染临床咽拭子样本，通过用于疫苗生产的细胞培养扩增、过斑纯化RSV病毒，采用理化与生物学、全基因测序、血清学、病毒滴毒及外源因子等检定，筛选候选优势疫苗病毒株。进一步制备候选优势疫苗病毒株免疫血清，进行与近年不同区域临床分离RSV流行野生株、购买A型RSV A2标准株、B型G8537标准株以及以往中国CDC和中检所保存RSV临床分离毒株免疫交叉中和研究，结果显示，确定的候选优势RSV的A、B型疫苗毒株与临床分离株、标准株等免疫中和交叉达到90％以上，证明所选用的RSV的A、B型疫苗毒株具有很好的代表性和免疫交叉保护性。同时从临床样品分离具有高致病性RSV的A、B型野毒株，为疫苗评价提供了良好试验材料。

实施例2：细胞培养及细胞批库建立

以人二倍体细胞(2BS Cell)细胞培养并建库为例：2BS细胞来源于American Type Culture Collection(ATCC)。培养基采用Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)，添加庆大霉素，不加或加入一定量胎牛血清(2-10％)在细胞工厂或细胞发酵罐进行培养，建立细胞工作种子批库，并及对传代后的外援源因子、致瘤性及稳定性等全面检定，细胞使用代数控制在40代以内，均符合疫苗生产介质的要求。

所述细胞培养及细胞批库建立可以为如下细胞中的一种：①人二倍体细胞；②ELL-0细胞；③Vero细胞；④CHO细胞；⑤Hep-2细胞；⑥MDCK细胞。

实施例3：RSV培养增殖规模化生产及纯化

①RSV接种于布满瓶底的人二倍体细胞(2BS)细胞中，37℃培养48h后收集细胞，4℃5000rmp离心5min，去除细胞及杂质。②取上清液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用PBS缓冲液配置，体系采用30％蔗糖4mL；45％蔗糖4mL；60％蔗糖1mL。4℃100000g离心2h。③吸取30％与40％夹层，加入适量PBS稀释后继续4℃100000g超离心2h。④收集沉淀，并用折射仪测量密度。保存于RSV保存液(17.4％Glycerol，145mMNaCl，2.5mM HEPES，0.1mM MgCl2，0.1mM CaCl2，pH 7.4)中备用。所述RSV包括A亚型和B亚型。

实施例4：RSV灭活及验证

将实施例3得到的RSV病毒用HNE缓冲液溶解。用0.025％Beta-丙内脂按1∶1000(v/v)4℃灭活16小时。其间轻微摇动。然后于37℃孵育2小时，使Beta-丙内脂失活。用HNE缓冲液透析去除Beta-丙内脂。将灭活的RSV悬液进行ELISA检测，结果呈阳性。将灭活的RSV悬液按0.2mL/只接种BALB/C小鼠，结果显示小鼠无死亡。将灭活的RSV悬液按1％接种铺满整板的Hep-2细胞，37℃培养5天，结果显示细胞无病变，说明RSV病毒已灭活。

实施例5：RS Virosome形成及纯化

①将实施例4得到的灭活RSV在100000g，4℃，离心2h，沉淀用pH7.4 375μL无菌HNE Buffer溶解，于4℃保存。②加375μL200mM DCPC，4℃孵育45min，使病毒裂解。6)100000g，4℃，离心2h，去除病毒核蛋白及衣壳。③上清液用0.22μm滤器过滤，去除杂质。④病毒体重建：将上清液用HNE稀释5倍，然后加入到透过率为10kD的透析袋中，在2L HNE中4℃透析过夜。换液，继续透析4小时。此过程可重复。⑤回收粗产品，用HNE配置10％/50％的蔗糖，并100000g，4℃，梯度离心1.5小时，去除未结合物。⑥回收纯化产品，并加入到透析袋中，在2L HNE中4℃透析过夜。换液，继续透析4小时，并重复3次。

实施例6：RS Virosome原液的检定

RS Virosome原液的外观为澄清液体；pH值为7.0-7.2；通过血平板进行杂菌鉴定结果为阴性；通过半流体和肉汤培养基培养进行支原体鉴定结果为阴性；通过PAGE-SDS电泳检测结果显示目的条带清晰、无其他杂带；采用Reed&Muench法计算抗血清中和效价高于2800。

通过电镜观察RS Virosome，结果显示其外观完整，大小在146nm左右，与活病毒接近。RS Virosome所包含的蛋白质通过micro Lowry assay法检测、磷脂含量用磷酸盐分析法检测，结果显示膜蛋白含量占活病毒90％，磷脂含量占活病毒84％。膜蛋白功能通过检测RSV F蛋白鉴定，结果显示，在pH6时，融合率达到8％。

实施例7：RS Virosome疫苗剂型配制

①注射剂型配制：将纯化RS Virosome不加佐剂，配制10ug/0.5ml的低剂量、20ug/1.0ml高剂量的无佐剂注射剂型；将纯化RS Virosome蛋白加入氢氧化铝或磷酸铝配置7.5ug(蛋白)/0.5mg(铝盐)/0.5ml、15μg(蛋白)/1.0mg(铝盐)/0.5ml有佐剂疫苗剂型；将纯化NDV NH/RSV VLP蛋白加入SP01佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚)、SP02佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚、10ug细菌鞭毛)、SP03佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚、10ug P3BSK4)混匀水包油样，分别配制5.0ug/0.5ml低剂量、10ug/1.0ml高剂量的有佐剂注射呼吸道合胞病毒体疫苗剂型。以上注射疫苗溶液装入吸顶瓶，放2-8℃备用。

②喷鼻剂型配制：将纯化RS Virosome不加佐剂吸附，配制7.5μg/0.2ml低剂量、15μg/0.2ml高剂量的无佐剂喷鼻疫苗剂型；将纯化NDV NH/RSV VLP蛋白加入等体积季胺化壳聚糖水凝胶黏膜佐剂与传递系统，配制5.0μg/0.2ml、10μg/0.2ml有佐剂喷鼻疫苗剂型；将纯化RS Virosome蛋白加入等体积季胺化壳聚糖水凝胶与10μg细菌鞭毛或10μg P3BSK4黏膜佐剂及传递系统，配制4.0μg/0.2ml、8μg/0.2ml有佐剂喷鼻呼吸道合胞病毒体疫苗剂型。以上喷鼻疫苗溶液装入定量喷鼻装置，放2-8℃备用。

③舌下含片剂型配制：将纯化RS Virosome 10μg、20μg分别加入0.5％明胶、5％蔗糖、0.2％维生素C、0.1％谷维素和0.1％脱脂奶粉，用磷酸盐缓冲液调PH7.2，压片冷冻干燥，配制10μg/片低剂量、20μg/片高剂量的无佐剂舌下含片剂型；将纯化RS Virosome蛋白7.5μg、15μg与15μgP3BSK4或Flagellin分别加入0.5％明胶、5％蔗糖、0.2％维生素C、0.1％谷维素和0.1％脱脂奶粉，用磷酸盐缓冲液调PH7.2，压片冷冻干燥，配制7.5μg/片低剂量、15μg/片高剂量的有佐剂呼吸道合胞病毒体疫苗舌下含片剂型；以上舌下含片疫苗装入密封板片内，放2-8℃备用。

④透皮贴剂剂型配制：将纯化RS Virosome75μg、100μg分别加入类脂C，配置75μg/贴片、100μg/贴片无佐剂透皮贴剂剂型；将纯化RS Virosome蛋白50μg、100μg分别加入油酸促渗剂和LT佐剂，配置50μg/贴片低剂量、100μg/贴片高剂量的有佐剂舌下含片透皮贴剂剂型。放2-8℃备用。

⑤透皮微针剂型配制：将纯化RS Virosome不加佐剂，配制5μg/0.5ml低剂量、10μg/1mL高剂量的微针剂无佐剂剂型；将纯化RS Virosome蛋白加入SP01佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚)或SP02佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚、10μg细菌鞭毛)或SP03佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚、10ug P3BSK4)混匀水包油样，分别配制3.0μg/微针剂低剂量、5μg/微针剂高剂量的有佐剂舌下含片微针剂剂型。放2-8℃备用。