一株用于处理高浓度造纸黑液的菌株Pandoraea sp.B-6及应用

摘要

本发明公开了一株直接用于高浓度造纸黑液处理的细菌Pandoraea sp.B-6，保藏号为CGMCC No.4239。发明人采集长沙简牍博物馆收藏的爆发了蚀斑病的三国时期吴国竹简浸泡液为原料，经过富集培养、分离纯化和筛选，得到一株能够在碱木质素为唯一碳源的培养基上生长的菌株。该菌可直接用于处理未经任何物化预处理的高浓度碱法草浆造纸黑液，能使初始pH＝11，COD为30000mg/L，色度为8500的高浓度碱法草浆造纸黑液在五天时间内COD降低39.1％。

说明书

技术领域

本发明涉及高浓度造纸黑液的生物处理技术，特别涉及一株用于直接处理高浓度、高碱度、高色度的碱法草浆造纸黑液的细菌及其应用。

背景技术

造纸工业废水约占全国工业总废水量的10％，对我国的水资源环境造成的污染日趋严重。制浆过程中产生的造纸黑液是造纸工业的重要污染源。草浆是中国造纸厂的主要浆种，草浆碱法蒸煮黑液是造纸国内造纸厂的主要污染物。碱回收法是现阶段最成熟的造纸黑液处理方法，但并不适用于草浆黑液的治理，且投资大、运行成本高，造成大多数造纸企业将蒸煮黑液不治理或不完全治理排放，导致了严重的环境污染，成为制约造纸行业发展的重大问题。

目前对于造纸黑液的处理方法主要还有：碱回收法、酸析法、碱析法、膜分离法、絮凝沉淀法，它们各具优缺点，但是都不能达到很好的效果，限制了在造纸黑液治理中的应用。生物处理法是利用自然界大量存在的、依靠有机物生活的微生物氧化、分解黑液中的有机物，同时采取一定的人工措施，创造有利于微生物生长、繁殖的环境，提高微生物氧化、分解有机物的效率。近年来，国内对草浆黑液生物处理技术进行了不少研究，也取得了一定的成绩，某些技术已经通过中试。但这些传统生物处理工艺应用于黑液治理普遍存在以下一些缺陷：1、黑液pH高，需要先调节pH后才能进入生物处理单元；2、黑液中一些高浓度的盐离子对细菌有毒害作用如Na⁺；3、黑液中含有单宁等对微生物有毒性的物质，传统生物法只能处理稀释或脱毒后的黑液；4、碱法蒸煮溶解的木质素难以生物降解，大多数微生物不能降解和利用木质素；5、黑液可生化性差，污泥增长差。所以说常规的生物技术处理方法并不能很好地进行黑液治理。

发明内容

本发明的目的是提供一株用于处理高浓度造纸黑液的菌株Pandoraea sp.B-6及应用。

一株用于处理高浓度造纸黑液的菌株Pandoraea sp.B-6，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.4239。

所述的菌株的培养基组成为：碱木质素3g，(NH₄)₂SO₄2g，K₂HPO₄1g，MgSO₄0.2g，CaCl₂0.1g，FeSO₄0.05，MnSO₄0.02g，KH₂PO₄1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.4。

所述菌株直接用于碱法草浆造纸黑液处理。

本发明从造纸黑液微生物处理技术角度出发，通过采集、分离、驯化，得到一株能直接用于处理高COD、高色度以及高pH造纸黑液的细菌。

结合菌落菌体形态特征和基于细菌16S rDNA基因序列的系统发育分析，将该菌鉴定为Pandoraea菌，命名为Pandoraea sp.B-6。该菌株已于2010年10月22日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提交生物保藏，保藏号为CGMCC No.4239。该菌可直接用于处理未经任何物化预处理的高浓度碱法草浆造纸黑液，能有效降低黑液的COD、色度以及pH。

发明人根据湖南长沙简牍博物馆收藏的一批走马楼出土的三国时期吴国竹简，在出土后保存过程中，暴发了竹简蚀斑病，竹简竹体被微生物侵蚀，其中的木质素、纤维素被某种或者某群微生物所降解，蚀斑中的竹简竹体变为半透明膜状物质，并且容易破裂脱落的情况，从该批竹简的浸泡液中分离，筛选出本发明菌株。

本发明菌株的分离、纯化和筛选过程为：

将长沙简牍博物馆密封保藏的竹简浸泡液分别接种丰富培养基进行富集培养。培养物以稀释平板法结合划线分离法在相应的固体平板上进行分离，直至获得各种微生物的纯培养。培养温度为30℃。将分离得到的菌株纯培养接种到以木质素为唯一碳源的固体平板筛选培养基上，放入生化培养箱中在30℃下恒温静置培养，每天观察，根据平板上菌株的生长情况，再划线分离得到最终的纯培养菌株。

所述丰富培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.4。所述木质素为唯一碳源的培养基组成为：碱木质素3g，(NH₄)₂SO₄2g，K₂HPO₄1g，MgSO₄0.2g，CaCl₂0.1g，FeSO₄0.05，MnSO₄0.02g，KH₂PO₄1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.4。

本发明弥补了常规微生物不能直接用于处理高浓度造纸黑液的不足。本发明所述菌株Pandoraea sp.B-6可直接投入pH＝11，COD高达30000mg/L，色度为8500的高浓度造纸黑液中进行处理，经过5天的生物处理，可使黑液的COD下降39.1％。目前为止，国内外尚未有关于Pandoraea属的菌株应用于造纸黑液处理的报道，本发明为造纸黑液的生物处理技术提供了一种新的微生物资源。

附图说明

图1：本发明菌株的菌落形态图；

图2：本发明菌株的菌体扫描电镜图；

图3：本发明菌株处理高浓度造纸黑液的COD去除率及菌体生长情况。

具体实施方式：

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：菌株的生物学鉴定

1.菌株形态特征

(1)菌落形态特征：菌落呈浅绿色，表面扁平而光滑、边缘为波状，见图1。

(2)菌体形态特征：对菌株进行革兰氏染色，利用光学显微镜观测，显示该菌株为短杆状革兰氏阴性菌；并利用扫描电子显微镜观察菌株，菌株扫描电镜照片见图2。

2.菌株16S rDNA分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒，抽提菌株基因组DNA，以菌株基因组DNA为模板，引物为细菌16S rDNA通用引物(27F，1492R)，扩增菌株的16SrDNA片段，将得到的细菌16S rDNA序列与NCBI中的核酸数据库进行Blast同源性比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，与数据库中已知细菌Pandoraea sp.JBl的16S rDNA序列的相似性达到了100％，将该菌株鉴定为Pandoraea属，命名为Pandoraea sp.B-6。

实施例2：菌株对高浓度造纸黑液的处理效果

将细菌在液体的丰富培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.4)中培养至对数期，按1％(V/V)的接种量接种到初始pH＝11，COD为30000mg/L，色度为8500的高浓度碱法草浆造纸黑液中，在30℃，120r/mm下振荡培养5天，每天取样一次，样品经12000r/min离心6min，沉淀用无菌水洗涤两次后，重复离心操作，80℃烘干，称重，得到菌体干重，用于测定菌株生长情况；测定上清液COD，用于检测菌株对造纸黑液的COD去除率，结果见图3。