鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因

摘要

本发明属生物基因工程技术领域，公开了一种鸡α干扰素(ChIFN-α)/白细胞介素2(ChIL-2)嵌合基因。该技术采用重叠延伸PCR方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将ChIFN-α与ChIL-2的成熟肽基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体，将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达并对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行快速复性和纯化。纯化的rChIFN-α-linker-ChIL-2融合蛋白在细胞上、鸡体内外的活性均具有ChIFN-α与ChIL-2蛋白活性的叠加，其抗病毒活性优于rChIFN-α蛋白。作为抗病毒制剂的主要成分，用于鸡病毒性疾病的预防和治疗，高效、广谱、安全、价格低廉。

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及鸡α干扰素与白细胞介素2嵌合基因及其构建、融合表达和纯化技术。

背景技术

我国是世界上养鸡大国，鸡的疾病种类繁多，特别是病毒性传染病造成的发病率和死亡率最高，每年给养鸡业造成巨大的经济损失，而且有些病毒性疾病(如高致病性禽流感等)还关系到人类自身的健康。因此对这些病毒性疾病的治疗和预防成为养鸡业的首要任务。

目前，尚无特效药物可以治疗病毒性疾病，尽管一些化学合成的抗病毒药物如盐酸金刚烷胺、利巴伟林等对少数病毒病有一定的作用，但由于这些药物在人医上也广泛应用，为防止药物残留及耐药菌株的产生，目前已禁止在兽医临床上应用；因此对病毒病的防控主要靠疫苗免疫接种进行预防。但是由于病毒血清型众多，毒株基因变异速度快，常常导致疫苗免疫失败；另外，新的病毒病也可能不断产生，某些病毒病目前仍无疫苗可用；这些因素往往造成病毒性传染病流行趋势扩大。

干扰素(interferon，IFN)是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫激活功能活性的细胞因子，其抗病毒活性具有种属特异性，其活性的发挥受细胞基因组的调节与控制，并涉及RNA和蛋白质的合成。干扰素分为I型和II型两大类，II型干扰素只有IFN-γ，其主要作用是免疫调节作用；I型干扰素分为五个亚型种类，其中α干扰素(IFN-α)主要由单核吞噬细胞、B细胞和成纤维细胞合成，是干扰素中最大的一个基因家族。机体内产生的IFN-α是病毒诱导白细胞产生的，其主要作用有以下几个方面：①IFN-α通过诱导机体产生抗病毒蛋白而发挥广谱的抑制病毒繁殖活性；②抑制细胞的增殖(如肿瘤细胞等)从而发挥抗肿瘤活性作用；③加强NK细胞杀伤病毒感染细胞的能力从而抑制病毒的增殖和扩散；④增强MHC I类抗原表达；调节T、B细胞功能以及许多免疫反应，特别是增强机体细胞免疫应答水平。

白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)又称T细胞生长因子，能诱导T淋巴细胞增殖，增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性，刺激细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、IFN-γ等细胞因子，促进机体的细胞免疫能力；同时也能激活B淋巴细胞，参与机体的体液免疫应答，促进抗体分泌；IL-2还可增强巨噬细胞对抗原递呈能力、杀菌力及细胞毒性，从而发挥其抗病毒和抗肿瘤作用。因而，基因工程重组IL-2蛋白(rIL-2)制剂不仅可作为抗病毒性疾病、自身免疫病与防治肿瘤方面的治疗药剂，而且还可作为佐剂增强疫苗的免疫效果，具有广阔的应用前景。

正常情况下，IFN-α、IL-2等细胞因子在动物体内的表达量较低且难以提取应用，已有的采用体外抗原刺激动物白细胞使其产生IFN-α的方法得到的产品产量和活性都低，且生产成本较高。基因工程α干扰素及IL-2具有广谱的抗病毒活性和增强疫苗免疫力作用，对细胞内寄生菌和寄生虫等的增殖和活性也有一定的作用，而且不会产生耐药性和残留，不会对人类健康造成危害，因此一直是研究抗病毒制剂关注的焦点。rChIFN-α蛋白对NDV、马立克氏病毒及禽流感H9N2型病毒具有抑制作用，rChIL-2蛋白可调节机体免疫功能，增强疫苗的免疫效果，并能明显提高鸡胚对IBDV、IBV强毒株攻毒的保护力。由于IFN-α和IL-2都具有广谱的抗病毒活性，因此将二者联合应用可发挥更强的抗病毒作用，可以对鸡的病毒性疾病能起到很好的预防作用，目前尚未见此方面的相关报道。

发明内容

本发明提供一种鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因构建、表达及其蛋白纯化方法，目的在于提供鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因，以得到抗病毒谱广、抗病毒活性高、生产成本低、易于生产、无残留、不会使病原体产生耐药性、具有ChIFN-α和ChIL-2抗病毒功能叠加的高效基因工程复合抗病毒制剂，用于鸡病毒性疾病的防治。

为实现本发明目的，本研究采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR，SOE-PCR)方法将ChIFN-α和ChIL-2成熟肽基因通过一个基因柔性接头(linker)(G₄S)₃构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因，将嵌合基因连接入pQE30原核表达载体进行融合表达，采用尿素溶解-低浓度蛋白复性液复性-PBS透析方法对融合蛋白进行复性和纯化，对纯化后的融合蛋白进行细胞上和鸡体内活性测定。

主要内容如下：

1、鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因，其构建、表达及其蛋白纯化

1.1 引物序列

共设计4条引物用于SOE-PCR的扩增，P1/P2引物对分别为扩增ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的ChIFN-α-linker部分所用上/下游引物；P3/P4引物对分别为扩增ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的linker+ChIL2部分所用上/下游引物。引物核苷酸序列如下：

P1：tcagcatgcg cctgcaacca ccttcgcc 28

P2：gccaccgcca gagccacctc cgcctgaacc gcctccacca gtgcgcgtgt tgcctgtg 58

P3：ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg catctctatc atcagcaaa 59

P4：tacaagcttt ttttgcagat atctcacaaa g 31

1.2 ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的构建

1.2.1 ChIFN-α-linker基因片段的PCR扩增

采用P1/P2引物对，以含ChIFN-α基因的重组pQE-30质粒(rpQE-30/ChIFN-α)为模板，按照TaKaRa的Pyrobest^TM DNA Chlymerase说明书进行ChIFN-α-linker基因片段的PCR扩增。扩增产物3’端带有39个核苷酸的linker序列，反应总体系为50μL，其中10×PCR Buffer 5μL，dNTP(2.5mM each)4μL，rpQE-30/ChIFN-α质粒模板添加量为1μg，P1/P2引物各50pmol，Pyrobest^TM DNA Chlymerase 2.5U，用灭菌双蒸水补齐至50μL。反应条件如下：94℃预变性3min，进入循环：94℃变性1min，64℃退火45s，72℃延伸45s，进行5个循环；接着94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min共进行30个循环，最后72℃延伸10min。利用低熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒回收大小为529bp左右的PCR产物，利用紫外-可见光分光光度计检测回收的PCR产物的纯度和含量。

1.2.2 linker-ChIL-2基因片段的PCR扩增

采用P3/P4引物对，以含ChIL-2基因的的重组pQE-30质粒(rpQE-30/ChIL-2)为模板，按照TaKaRa的Pyrobest^TM DNA Chlymerase的说明书进行linker-ChIL-2基因片段的扩增。PCR扩增产物5’端带39个核苷酸的linker序列，反应总体系为50μL，其中rpQE-30/ChIL-2质粒添加量为1μg，10×PCR Buffer 5μL，dNTP(2.5mM each)4μL，P3/P4引物各50pmol，Pyrobest^TM DNA Chlymerase 2.5U，用灭菌双蒸水补齐至50μL。反应条件如下：94℃预变性3min，进入循环：94℃变性1min，64℃退火45s，72℃延伸45s，进行5个循环；接着94℃ 1min，65℃ 45s，72℃ 45s共进行30个循环，最后72℃延伸10min。利用低熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒回收linker-ChIL-2基因片段的PCR产物(约403bp)，利用紫外-可见光分光光度计检测回收的PCR产物的纯度和含量。

1.2.3 ChIFN-α-linker与linker-ChIL-2基因片段的拼接

将回收的ChIFN-α-linker和linker-ChIL-2基因片段的PCR产物按质量比1.2∶1的比例混合后，取0.3μg混合物用作拼接模板，拼接反应体系中另加入10×ExTaq buffer(Mg²⁺ plus)5μL；2.5mM dNTP 4μL，ExTaq聚合酶1.25U，用无菌去离子水补至总体系50μL。94℃预变性2min，进入循环：94℃变性1min，65℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共进行20个循环。

1.2.4 ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的PCR扩增

利用P1/P4引物对、以上步的拼接反应产物为模板进行ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的PCR扩增，反应体系为50μL，其中上步的拼接反应产物2μL，P1/P4引物各50pmol，10×Pyrobest Buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，Pyrobest^TM DNA Polymerase 2.5U。按以下条件进行PCR扩增，94℃预变性3min，进入30个循环(94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min)，最后72℃延伸10min。用低熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒回收915bp左右的PCR产物，PCR产物两端分别带有Sph I和Hind III限制性内切酶位点。

1.3 ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的克隆、测序与表达

将上步中回收的915bp左右的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体，筛选阳性克隆质粒(pGEM-T/ChIFN-α-linker-ChIL-2)送大连(宝)生物工程有限公司自两端测序。阳性克隆质粒经Sph I和Hind III双酶切后粘端连接到经相同酶双切后的表达载体pQE30，将构建好的重组pQE30/ChIFN-α-linker-ChIL-2表达质粒(rpQE30/ChIFN-α-linker-ChIL-2)转入宿主菌大肠杆菌(E.coli.)JM109中，筛选阳性重组菌送大连(宝)生物工程技术公司测序。选取核苷酸序列和插入方向都正确的重组菌、JM109空菌对照、pQE30/JM109空载体菌对照进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达产物，经凝胶成像系统薄层扫描分析表达蛋白的含量。

1.4 重组ChIFN-α-linker-ChIL-2融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)的表达和纯化

具体方法见申请单位已申请专利，申请号200910064233.7。其核苷酸序列见序列表NO.1中所表述。

2、合成(G₄S)₃基因柔性接头(linker)

设计并合成富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性接头(G₄S)₃，通过(G₄S)₃基因柔性linker连接的2个基因表达后各自的蛋白空间构象和活性不会相互影响，保证了表达后融合蛋白的生物学活性，其核苷酸序列见序列表NO.2。

本发明创新点及优点：1、通过采用基因柔性linker将鸡α干扰素与白细胞介素2基因构建成嵌合基因并对其进行表达、复性和纯化从而得到在鸡体内外具有α干扰素和白细胞介素2抗病毒活性叠加的融合蛋白。2、设计合成了富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性接头(G₄S)₃，通过该Linker连接鸡α干扰素与白细胞介素2基因，使表达后各自的空间构向和活性不相互影响，保证了Linker两端所连接的基因表达蛋白的双重活性。3、采用“尿素溶解-低浓度蛋白复性液复性-PBS透析”进行融合蛋白的快速复性、纯化，免去过镍铬亲合层析柱进行纯化的步骤，得到的rChIFN-α-linker-ChIL-2融合蛋白纯度可达96％以上，大大简化了操作过程，使基因工程重组鸡α干扰素/白细胞介素2融合蛋白可以商品化应用。4、该融合蛋白在细胞上、鸡体内外均具有好的抗病毒活性，在鸡胚成纤维细胞(CEF)上具有抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)的增殖活性；在鸡胚上具有抑制新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV H9N2)的增殖活性；在鸡体内具有显著的抗NDV和IBDV活性和免疫增强活性。在体外具有促ConA刺激的鸡T淋巴细胞增殖活性，可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应；从实验数据上可以看出，rChIFN-α-linker-ChIL-2融合蛋白在细胞上、鸡体内外的活性均具有ChIFN-α与ChIL-2蛋白活性的叠加，其抗病毒活性优于rChIFN-α蛋白。作为抗病毒制剂的主要成分，用于鸡病毒性疾病的预防和治疗，对鸡的病毒性疾病能起到很好的防治作用，高效、广谱、安全、价格低廉。

附图说明

图1：SOE-PCR扩增全长ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因图；图中：M.100bp梯度DNA分子量标记，1.ChIFN-α-linker部分；2.linker-ChIL-2部分；3.ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因；

图2：ChIFN-α-linker-ChIL-2的表达与纯化SDS-PAGE电泳图；图中：M.低分子量蛋白Marker；1.JM109诱导表达对照；2.pQE30空载体菌表达对照；3.含pQE-30/ChIFN-α-linker-ChIL-2重组质粒的全菌诱导表达产物；4.包涵体沉淀；5.纯化后的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白；

图3：rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白促鸡外围血T淋巴细胞促增殖活性(MTS法)；图中，柱.表示rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白的OD490值(样品测量值-细胞对照值)；柱.表示rhIL-2蛋白阳性对照品的OD490值(样品测量值-细胞对照值)；

图4：rChIL-2蛋白阳性对照与抗ChIL-2单抗反应的ELISA检测标准曲线；图中：X轴表示2倍系列稀释数，Y轴表示OD₄₅₀值；

图5：接种不同剂量rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白对NDV活疫苗产生抗体水平的影响；图中：X轴表示免疫后天数，Y轴表示NDV HI抗体滴度；

图6：接种不同剂量rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白对NDV灭活疫苗产生抗体水平的影响；图中：X轴表示免疫后天数，Y轴表示NDV HI抗体滴度；

图7：第1(阴性对照组)、2(阳性对照组)、3组(rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白注射组)存活鸡法氏囊萎缩及出血程度比较；图中：自左向右依次为：第1、2、3组存活鸡法氏囊；

图8：rpQE30/ChIFN-α-Linker-ChIL-2表达质粒正向测序的DNA序列图片；

图9：rpQE30/ChIFN-α-Linker-ChIL-2表达质粒正向和反向测序的DNA序列图片；

图10：rpQE30/ChIFN-α-Linker-ChIL-2表达质粒反向测序的DNA序列图片；

图11：rpQE30/ChIFN-α-Linker-ChIL-2表达质粒正向测序的图谱；

图12：rpQE30/ChIFN-α-Linker-ChIL-2表达质粒反向测序的图谱。

具体实施方式

1 方法

1.1 引物的设计与合成

基因接头为富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性接头(G₄S)₃，共15个氨基酸。根据我们已测序的rpQE-30/ChIFN-α中ChIFN-α基因序列(GenBank登录号：AB255630)和GenBank中ChIL-2基因序列(AB194099)，利用Oligo6.0软件共设计4条引物用于SOE-PCR的扩增，序列如下：P1：5’-TCAGCATGCG CCTGCAACCA CCTTCGCC-3’(含Sph I酶切位点)；P2：5’-GCCACCGCCA GAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCAGTGCGCGTGTTGCCTGTG-3’，为扩增ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的ChIFN-α-linker部分所用下游引物；P3：5’-GGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCATCTCTATCATCAGCAAA-3’，为扩增嵌合基因的linker+ChIL2部分所用上游引物；P4：5’-TACAAGCTTTTTTTGCAGATATCTCACAAAG-3’，(含Hind III酶切位点)。以上引物由大连(TaKaRa)宝生物工程技术公司合成。

1.2 ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的构建

1.2.1 ChIFN-α-linker基因片段的PCR扩增

采用P1/P2引物对，以含ChIFN-α基因的重组pQE-30质粒(rpQE-30/ChIFN-α)为模板，按照TaKaRa的Pyrobest^TM DNA Chlymerase说明书进行ChIFN-α-linker基因片段的PCR扩增。扩增产物3’端带有39个核苷酸的linker序列，反应总体系为50μL，其中10×PCR Buffer 5μL，dNTP(2.5mM each)4μL，rpQE-30/ChIFN-α质粒模板添加量为0.3μg，P1/P2引物各50pmol，Pyrobest^TM DNA Chlymerase 2.5U，用灭菌双蒸水补齐至50μL。反应条件如下：94℃预变性3min，进入循环：94℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸1min，进行5个循环；接着94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min共进行30个循环，最后72℃延伸10min。利用低熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒回收ChIFN-α-linker基因片段的PCR产物，利用紫外-可见光分光光度计检测回收的PCR产物的纯度和含量。

1.2.2 linker-ChIL-2基因片段的PCR扩增

采用P3/P4引物对，以含ChIL-2基因的的重组pQE-30质粒(rpQE-30/ChIL-2)为模板，按照TaKaRa的Pyrobest^TM DNA Chlymerase的说明书进行linker-ChIL-2基因片段的扩增。PCR扩增产物5’端带39个核苷酸的linker序列，反应总体系为50μL，其中rpQE-30/ChIL-2质粒添加量为2μg，10×PCR Buffer 5μL，dNTP(2.5mM each)4μL，P3/P4引物各20pmol，Pyrobest^TM DNA Chlymerase 2.5U，用灭菌双蒸水补齐至50μL。反应条件如下：94℃预变性3min，进入循环：94℃变性1min，63℃退火45s，72℃延伸45s，进行5个循环；接着94℃ 1min，65℃ 45s，72℃ 45s共进行30个循环，最后72℃延伸10min。利用低熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒回收linker-ChIL-2基因片段的PCR产物，利用紫外-可见光分光光度计检测回收的PCR产物的纯度和含量。

1.2.3 ChIFN-α-linker与linker-ChIL-2基因片段的拼接

将回收的ChIFN-α-linker和linker-ChIL-2基因片段的PCR产物按质量比1.2∶1的比例混合后，取0.5μg混合物用于ChIFN-α-linker基因与linker-ChIL-2基因的拼接模板，拼接反应体系中另加入10×ExTaq buffer(Mg²⁺ plus)5μL；2.5mM dNTP 4μL，ExTaq聚合酶1.25U，用无菌去离子水补至总体系50μL。94℃预变性2min，进入循环：94℃变性1min，65℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共进行20个循环。

1.2.4 ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的PCR扩增

利用P1/P4引物对、以上步的拼接反应产物为模板进行ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的PCR扩增，反应体系为50μL，其中上步的拼接反应产物2μL，P1/P4引物各25pmol，10×Pyrobest Buffer 5μL 2.5mM dNTP 4μL，Pyrobest^TM DNA Chlymerase 2.5U。按以下条件进行PCR扩增，94℃预变性3min，进入30个循环(94℃ 1min，65℃ 1.5min，72℃ 1.5min)，最后72℃延伸10min。用低熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒回收915bp左右的PCR产物，PCR产物两端分别带有Sph I和Hind III限制性内切酶位点。

1.3 ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的克隆、测序与表达

将上步中回收的915bp左右的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体，筛选阳性克隆质粒(pGEM-T/ChIFN-α-linker-ChIL-2)送大连(宝)生物工程有限公司自两端测序。阳性克隆质粒经Sph I和Hind III双酶切后粘端连接到经相同酶双切后的表达载体pQE30，将构建好的重组pQE30/ChIFN-α-linker-ChIL-2表达质粒(rpQE30/ChIFN-α-linker-ChIL-2)转入宿主菌大肠杆菌(E.coli.)JM109中，筛选阳性重组菌送大连(宝)生物工程技术公司测序。选取核苷酸序列和插入方向都正确的重组菌、JM109空菌对照、pQE30/JM109空载体菌对照进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达产物，经凝胶成像系统薄层扫描分析表达蛋白的含量。

1.4 重组ChIFN-α-linker-ChIL-2融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)的纯化

采用“尿素溶解-低浓度蛋白复性液复性-PBS透析”进行融合蛋白纯化方法，具体操作步骤见本申请人已申请专利，申请号200910064233.7。

1.5 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白的生物学活性检测

1.5.1 实验动物、病毒及检测用试剂 SPF鸡、鸡胚由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂实验室提供；水泡性口炎病毒(VSV)由河南农业大学动物医学院惠赠；传染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒株(107ELD50)、低致病性禽流感病毒H9N2亚型E3代病毒株(105ELD50)均由河南省动物疫病预防控制中心保存并提供；新城疫弱毒活疫苗(NDVLaSota株)，哈药集团黑龙江省生物制品一厂产品；NDV血凝抑制(haemoglutinationinhibition，HI)试验用标准抗原和标准阳性血清均为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所产品。

1.5.2 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIFN-α抗病毒活性检测 采用细胞病变抑制法分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上抑制VSV和IBDV增殖活性，同时设rChIFN-α蛋白对照。CEF细胞在96孔细胞培养板培养至单层后，每孔分别加入100μL 2倍系列稀释的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白、rChIFN-α蛋白，每一稀释度设8个重复孔。37℃孵育24h后，弃上清，在CEF细胞中分别加入100μL 100TCID50的VSV和500TCID50的IBDV，分别继续培养24h和80h后观察细胞病变(CPE)情况。实验时分别同时设只用rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白处理不攻毒的对照组、正常细胞对照组和只用病毒攻毒对照组。采用Reed-Muench法计算rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抗VSV和IBDV活性并与rChIFN-α蛋白进行比较。

1.5.3 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2蛋白生物学活性检测

1.5.3.1 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白促ConA刺激的鸡外周血T淋巴细胞增殖活性采用MTS法测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2促鸡外周血T淋巴细胞促增殖活性。参照文献报道的方法(Zhou J Y，Wang J Y，Chen J G，Wu J X，Gong H，Teng Q Y，Guo J Q，Shen H G.Cloning，in vitro expression and bioactivity of duckinterleukin-2.Molecular Immunology，2005，42(5)：589-598.)进行鸡外周血T淋巴细胞的分离、ConA刺激、计数及96孔细胞培养板分板培养。MTS细胞增殖检测试验操作步骤参照CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒说明书进行，以人重组白细胞介素2(rhIL-2)标准品为阳性对照、PBS为阴性对照。将2倍系列稀释(最大稀释度1∶256)的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白、rhIL-2蛋白依次加入96孔细胞培养板中(100μL/孔)，同一浓度样品做3孔平行试验，置37℃ 5％ CO₂培养箱中培养48h，加MTS显色液(20μL/孔)后置37℃、5％ CO2培养箱中培养4h，490nm读取吸光度值。

1.5.3.2 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2特异性免疫学活性检测 采用Chicken IL-2ELISA检测试剂盒检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白是否可与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应以判定其是否具有ChIL-2蛋白的免疫学活性，并对融合蛋白中的ChIL-2含量进行相对定量。试验操作参照Chicken IL-2 ELISA检测试剂盒说明书进行，采用试剂盒中的rChIL-2蛋白阳性对照标准品进行2倍系列稀释后制作OD450/蛋白浓度标准曲线。将rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白进行ELISA反应后的OD450值(检测数值-标准品稀释液的本底OD450值)和标准曲线进行比对来计算ChIL-2蛋白的相对含量。

1.5.4 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡胚内抗病毒活性检测 参照文献报道的方法(Xia C，Liu J，Wu Z G，Lin C Y，Wang M.The interferon-alpha genes from threechicken lines and its effects on H9N2 influenza viruses.Animal Biotechnology，2004，15(1)：77-88.)进行rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白、rChIFN-α蛋白对照在鸡胚内抗病毒活性检测。首先比较不同IFN-α活性单位的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡胚内对NDV的抑制活性：100枚9日龄SPF鸡胚平均分为10组，分别设阴性对照组(接种PBS)、大剂量rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对照组(抗病毒活性100 000 IU)、阳性对照组和7组不同IFN-α活性单位(50000U/0.1mL、10000U/0.1mL、5000U/0.1mL、1000U/0.1mL、500U/0.1mL、200U/0.1mL、100U/0.1mL)的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白试验组，鸡胚接种量为0.1mL/枚(表3)；24h后阳性对照组和7组不同IFN-α活性单位的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白试验组鸡胚分别接种100 ELD₅₀的NDV，连续观察96h，比较不同试验组鸡胚的死亡时间、出血程度、胚体大小等指标。进一步比较按照上步筛选出的最佳IFN-α活性单位的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白和rChIFN-α蛋白在鸡胚内抗NDV/AIV H9N2病毒活性差异。以上操作均在III级生物安全隔离器中进行。以上操作均在III级生物安全隔离器中进行。

1.5.5 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内生物学活性检测 将120只35日龄的SPF鸡随机分成12组，每组10只分别饲养于独立的鸡笼里。第1-7组分别进行rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白对NDV弱毒活疫苗的免疫增强作用。其中，第1、2组分别接种1mL的PBS和28μg rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白，第3组为NDV活疫苗对照组，第4-7组为不同浓度(2.8、0.28、0.028、0.0028μg/mL)的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白对NDV弱毒活疫苗免疫增强试验组；第8组为NDV灭活疫苗对照组，第9-12组为不同浓度(2.8、0.28、0.028、0.0028μg/mL)的rChIFN-α-Linker-ChIL-2对NDV灭活疫苗免疫增强试验组；试验时将rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白与NDV疫苗分别同时接种于鸡不同部位，于疫苗接种后0、7、14、21、28、35、42、49、56、63日分别采取12组鸡的血清，采用血凝抑制实验(HI)检测每组鸡NDV血清抗体平均滴度。

1.5.6 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内抗传染性法氏囊病毒活性 55只28日龄SPF鸡分为6组，第1组5只鸡为阴性对照，第2组10只鸡为阳性对照组，第3-6组每组各10只鸡为实验组，以上6组鸡分别饲养于6个负压隔离器中。第3-6组鸡经口接种鸡传染性法氏囊BC6/85株病毒液0.2mL(约10BID)，分别在攻毒前和攻毒后每天分别注射rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白(抗病毒活性为1000IU)、rChIFN-α蛋白和rChIL-2蛋白混合物(抗病毒活性和促鸡外周血T淋巴细胞促增殖活性分别与抗病毒活性为1000IU的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白等量)、rChIFN-α蛋白(抗病毒活性1000IU)、单rChIL-2蛋白(促鸡外周血T淋巴细胞促增殖活性与抗病毒活性为1000IU的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白等量)，2.0mL/只/天，连用3天。攻毒96h后6组鸡全部扑杀，观察不同鸡死亡率、全身出血及法氏囊病变情况。

2 结果

2.1 ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的构建

ChIFN-α-linker PCR扩增产物大小为529bp左右；linker-ChIL-2PCR扩增产物大小为403bp左右；采用P1/P4引物对扩增到了大小为915bp左右的ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因，这些扩增产物大小均与预期的相一致(附图1)。说明采用SOE-PCR方法成功构建了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。

2.2 rpQE30/ChIFN-α-linker-ChIL-2表达质粒的构建

ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因成功克隆入了pGEM-T Easy载体，测序表明，包括酶切位点和保护性碱基的嵌合基因序列全长915bp，其核苷酸序列与原模板质粒中的ChIFN-α和ChIL-2序列相比没有发生变异，linker序列也与设计的序列相同。对阳性rpQE30/ChIFN-α-linker-ChIL-2质粒测序表明，插入pQE30载体中的ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因(不包括酶切位点序列)长度为897bp，其核苷酸序列与pGEM-T/ChIFN-α-linker-ChIL-2克隆质粒中的相应基因序列完全一致，没有发生核苷酸的突变或缺失，插入方向和位置正确。表明成功构建了rpQE30/ChIFN-α-linker-ChIL-2表达质粒。

2.3 ChIFN-α-linker-ChIL-2的表达与纯化

ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因在E.coli.JM109中得到了高效表达，rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白的表达量占整个菌体表达总量的46.8％，大小约为35.9kD，与预期大小相一致；对照JM109空菌和含pEQ30空载体的JM109菌在相应位置均无条带。纯化后的目的蛋白纯度达96％以上(附图2)。

2.4 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上抗病毒活性检测

2.4.1 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抗VSV活性 能抑制50％细胞病变的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白稀释度的对数log₂X为18.29(表1)，计算X＝320507，即rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白的效价为3.205×10⁶IU/mL(1.14×10⁸IU/mg)。rChIFN-α蛋白对照的效价为8.19×10⁴IU/mL(4.09×10⁶IU/mg)。正常细胞对照组、rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白不攻毒对照组所有细胞均无CPE，病毒对照组所有细胞都出现CPE。说明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上抑制VSV增殖活性要高于单rChIFN-α蛋白的活性。

     表1 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上抗VSV活性测定

  表2 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上抗IBDV活性测定

2.4.2 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抗IBDV活性 能抑制50％细胞病变的干扰素稀释度的对数log₂X＝12.12(表2)，计算X＝4451.3，即rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白能够完全抑制IBDV增殖的活性单位为44 513IU·mL^-1(1.59×10⁶IU/mg)。rChIFN-α蛋白对照抗IBDV的活性为5564IU/mL(2.78×10⁵IU/mg)。正常细胞对照组、单用rChIFN-α蛋白不攻毒对照组所有细胞均无CPE，病毒对照组所有细胞都出现CPE。说明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上抑制IBDV增殖活性高于单rChIFN-α蛋白。

2.5 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2活性检测

2.5.1 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2促外围血T淋巴细胞促增殖活性rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白和rhIL-2蛋白对照均具有明显的促鸡外周血T淋巴细胞增殖活性，rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白和rhIL-2标准品对照均可以显著促进鸡外围血T淋巴细胞增殖，其增殖活性随浓度的降低而下降；对鸡T淋巴细胞具有明显增殖活性所需要的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白最小剂量为原液做1∶8稀释、rhIL-2标准品对照最低剂量为312IU(1∶32倍稀释)(附图3)。

2.5.2 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2与抗ChIL-2单抗反应活性rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白和rChIL-2蛋白对照都可以和抗ChIL-2单抗反应，测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白的OD450值为0.135，将该数值与rChIL-2蛋白阳性对照标准品曲线(附图4)进行比较，计算rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2蛋白的相对含量约为1.3×10³pg/mL。说明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中的ChIL-2具有与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的生物学活性。

2.6 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡胚内抗病毒活性检测

2.6.1 不同IFN-α活性单位的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡胚中抗病毒活性不同IFN-α活性单位的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白抑制NDV在鸡胚上的增殖活性不同，200、500和100IU的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV所引起的鸡胚死亡数量、减轻死亡鸡胚胚体出血程度，并能显著延长鸡胚存活时间；1 000IU和5 000IU的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白抑制NDV的增殖活性较200、500和100IU低；但过大剂量(10 000IU以上)的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白不能显著抑制NDV所引起SPF鸡胚死亡数量及死亡鸡胚胚体出血程度，只能稍稍延长少部分鸡胚死亡时间。超大剂量的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白不会对鸡胚造成损害(表3)。这表明只有合适IFN-α活性单位(本试验中200IU效果最佳)的rChIFN-α-lFNinker-ChIL-2蛋白在鸡胚内具有最佳的抗病毒活性(鸡胚死亡率40％)。

  表3 不同剂量的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白在鸡胚中的抗NDV活性

^a+：用NDV攻毒；^a-：不用NDV攻毒；^b+：+号数量越多表示死亡鸡胚出血程度越重，阳性对照组死亡鸡胚出血程度定为4个“+”号(++++)；^b-：表示鸡胚体无出血

2.6.2 相同IFN-α活性单位rChIFN-α-Linker-ChIL-2和rChIFN-α蛋白在鸡胚中抗NDV/AIV H9N2活性比较200IU的rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白及rChIFN-α蛋白在SPF鸡胚内均可明显降低NDV毒株所引起鸡胚死亡数量、减轻死亡鸡胚胚体出血程度，并能显著延长鸡胚存活时间；rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白对NDV的抑制效果显著优于rChIFN-α蛋白(96h以前鸡胚死亡率分别为50％、70％)。接种200IUrChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白的鸡胚采用H9N2病毒攻毒后96h以前没有出现死亡，胚体无出血，活胚体较rChIFN-α蛋白试验组活鸡胚胚体稍大，但比阴性对照组鸡胚胚体稍小；接种200IU rChIFN-α蛋白的试验组鸡胚采用H9N2病毒攻毒后死亡率为10％，死亡鸡胚轻微出血，活胚体无出血(表4)。以上结果表明rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白在鸡胚内具有显著抗病毒作用，且其抗病毒效果明显优于rChIFN-α蛋白。

表4 rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白和rChIFN-α蛋白在鸡胚中抗NDV/AIV H9N2活性比较

^a+：用NDV攻毒；^a-：不用NDV攻毒；^b+：用AIV H9N2病毒攻毒；^b-：不用AIV H9N2病毒攻毒；^c+：+号数量越多表示死亡鸡胚出血程度越重，NDV和H9N2病毒阳性对照组死亡鸡胚出血程度分别定为4个+号(++++)；^c-：表示鸡胚体无出血

2.7 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内生物学活性

2.7.1 rChIFN-α-Linker-ChIL-2对NDV IV系活疫苗的抑制作用 试验组鸡群在接种疫苗后7d时单接种NDV疫苗组(第3组)的抗体水平开始明显高于应用不同剂量rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白的佐剂组(第4-7组)，并一直维持到试验结束。接种后28d，所有NDV接种试验组鸡抗体水平均达到各组的峰值，峰值一直维持到49d后。接种后14-56d，第4-7组鸡相互之间NDV抗体滴度出现细小差异，相对而言，第7组鸡抗体滴度最低，其最低抗体滴度比NDV疫苗对照组低3倍以上。第1、2组曲线重合，第4、5组曲线重合(附图5)。这说明rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白在鸡体内抑制了部分NDV活疫苗的增殖，从而造成鸡体抗NDV抗体滴度下降。

2.7.2 rChIFN-α-Linker-ChIL-2对NDV灭活疫苗的免疫增强作用 NDV灭活疫苗试验组鸡群在接种后14d时抗体已上升到较高滴度，第8-12组相互之间平均抗体滴度差异不显著。接种后21d，第9-12组鸡NDV抗体水平已明显高于第8组，并一直维持到试验结束；第9-12组相互之间平均抗体滴度存在一定差异，其中第11组最高，第9组最低。接种后28d，所有NDV试验组鸡抗体水平均达到各组的峰值，并一直维持到49d后；达到峰值后，第11组鸡平均抗体滴度比对照组鸡高4倍以上。试验组鸡抗体水平在免疫后49d后开始下降。第1、2组曲线重合(附图6)。说明rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白对NDV灭活疫苗具有显著免疫增强作用，但对其免疫抗体产生时间及抗体滴度峰值出现和维持时间均没有明显的影响。

2.8 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内抗传染性法氏囊病毒活性

攻毒后96h，第2组(阳性对照组)10只鸡有7只死亡(死亡率70％)，第3-6组(rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白实验组)鸡死亡率分别为10％、20％、30％、60％，阴性对照组鸡均正常存活。所有死亡鸡均出现典型法氏囊病理剖检病变症状，表现为胸部、腿部肌肉出血，法氏囊萎缩出血，肾脏肿大出血等症状。第2组存活鸡出现了严重传染性法氏囊病临床和剖检症状；第3和第4、5组存活鸡分别出现了轻微和中度传染性法氏囊病症状；第6组存活鸡出现法氏囊病症状和剖检变化程度只稍重轻于阳性对照鸡，但重于第3、4、5组。第3、4、5组鸡法氏囊萎缩和出血程度较阳性对照组鸡轻，但比阴性对照组鸡重(附图7)；相对而言，第3组存活鸡临床和剖检病变症状等指标均较其他试验组轻微，表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抗病毒效果最高。

rChIFN-α-linker-ChIL2蛋白、rChIFN-α蛋白、rChIFN-α和rChIL-2蛋白混合物在鸡体内均可显著抑制IDBV的增殖，从而大大减轻了实验组鸡的传染性法氏囊病症状和死亡率；rChIFN-α-linker-ChIL2蛋白对IBDV在鸡体内的抑制作用显著优于单rChIFN-α蛋白和单rChIL-2蛋白，优于与rChIFN-α-linker-ChIL2蛋白各自等量的rChIFN-α和rChIL-2蛋白混合物。这说明rChIFN-α-linker-ChIL2蛋白在鸡体内发挥了rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白的协同生物学活性。参见表5实验结果。

      表5 rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内抑制IBDV增殖活性试验

  分组  死亡数  (率)  临床法氏囊  症状  病死鸡法氏囊萎缩程  度(以+号表示轻重  程度)  存活鸡法氏囊出血及萎缩  程度(以+号表示轻重程  度)  第1组  (阴性对照组)  0/5(0％)  无  -  -  第2组  (阳性对照组)  7/10(70％)  重、典型  ++++  萎缩，出血严重(+  +++)  第3组(rChIFN-α-linker-ChIL-2  蛋白注射组)  1/10(10％)  轻微  ++  萎缩和出血程度极轻  (+)  第4组  rChIFN-α蛋白和rChIL-2蛋白等  量混合物注射组)  2/10(20％)  中等  ++  萎缩和出血程度轻  (++)  第5组  (rChIFN-α蛋白注射组)  4/10(30％)  中等  ++  萎缩和出血程度轻  (++)  第6组  (rChIL-2蛋白注射组)  6/10(60％)  重，但稍优  于阳性对照  鸡  +++  萎缩和出血程度重，  但稍优于阳性对照组(+  ++)

注：+号表示法氏囊萎缩、病变程度，将阳性对照组鸡病变程度定为++++

注：pQE30质粒载体购自Qiagen公司河南代理商(河南宝赛生物技术有限公司)，其为原核表达载体；载体长度3461bp；氨苄青霉素抗性；T5启动子，Lac操纵子；加了6个His标签编码序列；多克隆位点；IPTG诱导表达，宿主菌为大肠杆菌(E.coli)；可采用镍铬鏊合亲和层析纯化。

pGEM-T Easy载体购于Promega公司河南代理商(河南宝赛生物技术有限公司)，为克隆载体；利用PCR产物3`末端的A与pGEM-T Easy载体3`末端上的单T进行连接，凡应用Taq、Tth DNA聚合酶扩增的PCR产物，可直接连接入该载体进行筛选；宿主菌为大肠杆菌(E.coli)；载体含LacZ基因，在X-gal和IPTG作用下，可进行蓝白菌斑筛选；多克隆位点，在插入序列的两端带有EcoR I酶切位点，可采用EcoR I酶切回收插入序列；可利用T7或SP6引物对克隆的产物进行测序。

序列表

<110>河南省动物疫病预防控制中心

<120>鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因

<160>6

<170>Patentin version 3.4

 

<210>1

<211>897

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因

<400>1

gcctgcaacc accttcgcct ccaggatgcc accttctctc acgacagcct ccagctcctc 60

cgggacatgg ctcccacact accccagctg tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc 120

aacgacacca tcctggacac cagcaacacc cggcaagccg acaaaaccac ccacgacatc 180

cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc cccagcactc cagcccactg gaacgacagc 240

caacgccaaa gcctcctcaa ccggatccac cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg 300

gacagcagcg acacgcgctc ccggacgcga tggcctcgca accctcacct caccatcaaa 360

aaacacttca gctgcctcca caccttcctc caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg 420

gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac 480

acgcgcactg gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcggcatct 540

ctatcatcag caaaaaggaa acctcttcaa acattaataa aggatttaga aatattggaa 600

aacatcaaga acaagattca tctcgagctc tacacaccaa ctgagaccca ggagtgcacc 660

cagcaaactc tgcagtgtta cctgggagaa gtggttactc tgaagaaaga aactgaagat 720

gacactgaaa ttaaagaaga atttgtaact gctattcaaa atatcgaaaa gaacctcaag 780

agtcttacgg gtctaaatca caccggaagt gaatgcaaga tctgtgaagc taacaacaag 840

aaaaaatttc ctgattttct ccatgaactg accatctttg tgagatatct gcaaaaa    897

 

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>连接鸡α干扰素/白细胞介素2基因的柔性接头

<400>2

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45

 

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>P1引物，为扩增ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的ChIFN-α-linker部分所用上游引物

<400>3

tcagcatgcg cctgcaacca ccttcgcc 28

 

<210>4

<211>58

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>P2引物，为扩增ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的ChIFN-α-linker部分所用下游引物

<400>4

gccaccgcca gagccacctc cgcctgaacc gcctccacca gtgcgcgtgt tgcctgtg 58

 

<210>5

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>P3引物，为扩增ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的linker+ChIL2部分所用上游引物

<400>5

ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg catctctatc atcagcaaa  59

 

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>P4引物，为扩增ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的linker+ChIL2部分所用下游引物

<400>6

tacaagcttt ttttgcagat atctcacaaa g 31