一种用于治疗增生性瘢痕的外用中药及其制备方法

摘要

本发明提供了一种治疗增生性瘢痕的外用中药，它是以1～4重量份的豨莶草、1～8重量份的紫草和1～8重量份的红花为原料，经乙醇或植物油提取得到的提取物，加药剂学可接受的辅料按常规方法制成的外用药物。本发明中药的制备方法包括有效成分的提取和配制：分别以乙醇和植物油为溶剂，提取组方的有效成分，辅以保湿剂、成膜剂、抑菌剂、乳化剂、增稠剂及凝胶剂、软膏剂、膜剂、涂膜剂等的基质和适宜容器制成可供临床选择应用的外用制剂。本发明配伍严谨，功专效著，原料药来源广泛，成本低廉；经实验，本发明的药物能显著抑制皮肤瘢痕细胞增殖和减小瘢痕指数；同时制成透皮吸收的外用制剂，直接作用于病变部位，使药物起效迅速。

说明书

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体为一种用于治疗增生性瘢痕的外用中药及该外用中药的制备方法。

背景技术

增生性瘢痕(hyperplastic scar，HS)是皮肤损伤后，组织过度修复的一种病理现象，其产生的搔痒、刺痛、色素沉着及挛缩等常常严重影响患者的外观、功能以及生活质量，其实质是瘢痕成纤维细胞(HypertroPhic scarfibroblast，HSF)的异常增殖和细胞外基质的过度沉积。HS在有色人种中较为多见，发病率约在4-16％之间，为白色人种的5-15倍。尽管对瘢痕的发病机理和防治方法进行了大量的研究，但迄今尚无理想的结果，目前的治疗方法(如激素注射，放射治疗和冷冻治疗，应用加压、硅凝胶等)仅仅部分有效，有的方法还会导致复发，甚至更严重的后果，其原因在于上述治疗同时又诱导细胞坏死，而坏死的细胞可能恰恰是新一轮修复(增殖效应)的开始，因此，瘢痕形成的过程并未阻滞，而仅仅是被推迟，并且愈演愈烈。因此，寻求有效的治疗手段一直是医学界函待解决的难题。

增生性瘢痕与正常瘢痕的病理组织差别仅在于瘢痕深部胶原纤维的增厚，增生性瘢痕的表现为排列不规则，或呈波澜形，或缠绕成绳索状。其常见原因与某些局部或全身的诱发困素存在有关。增生性瘢痕多发生于损伤深度达真皮的创伤如深度烧伤的创面愈合后。在III度烧伤创面植皮后在皮片四周缝合处也常见网状增殖性瘢痕。另外，最常见的是任何切口经缝合后的切口瘢痕也属于这一种。增生瘢痕表现为突出表面，外形不规则，高低不平，潮红充血，质实韧。有灼痛及搔痒感。增生瘢痕的表现于环境温度增高，情绪激动，或食辛辣刺激食物时症状加重。

在祖国传统的中医药学中，预防和治疗增生性瘢痕内容十分丰富，形成了独具特色的理论体系，积累了宝贵的临床经验；虽然目前报道的相关验方较多，但处方组成较为复杂，亦缺乏必要的药理学药剂学研究，疗效尚需进一步验证。因此，筛选对瘢痕有多层面、多靶点的积极治疗作用的中药组方，并将其制成适合临床应用的、符合国家标准的安全、高效现代药物，将是今后该领域研究的重点。

发明内容

本发明的任务是提供一种用于治疗增生性瘢痕的外用中药，同时提供该中药的制备方法。

本发明是以中国传统医药“清热凉血、祛瘀软坚、镇痛止痒”理论为指导，筛选具有较强作用的中药方剂，采取不同的提取工艺提取中药的有效成分并制成适用的外用剂型。该制剂对皮肤增生性瘢痕成纤维细胞具有明显的诱导凋亡作用，且对兔耳增生性瘢痕的治疗疗效显著，集活血解毒、渗湿止痒、淡化瘢痕等功效于一体，为瘢痕患者提供一种安全、方便、有效的治疗增生性瘢痕的新途径。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种用于治疗增生性瘢痕的外用中药，是以1～4重量份的豨莶草、1～8重量份的紫草和1～8重量份的红花为原料，经乙醇或植物油提取得到的提取物，加药剂学可接受的辅料按常规方法制成的外用药物。

本发明治疗增生性瘢痕的外用中药，可以是以乙醇提取物作为药效成分，添加辅料制成凝胶、膜剂、涂膜剂、软膏剂、巴布剂或喷雾剂，且各剂型的制剂中含有的药效成分相当于原料药总和的5％～50％。

本发明治疗增生性瘢痕的外用中药，可以是以乙醇提取物作为药效成分，添加乙醇至适量，制成酊剂或搽剂，且酊剂或搽剂中含有的药效成分相当于原料药总和的5％～50％。

本发明治疗增生性瘢痕的外用中药，可以是以植物油为提取溶剂提取的油溶性成分作为药效成分，并添加辅料制成油膏剂，且油膏剂中含有的药效成分相当于原料药总和的5％～50％。

本发明外用中药可制备成凝胶剂、膜剂、涂膜剂、软膏剂、喷雾剂、贴剂、酊剂、搽剂、橡胶膏剂、油膏剂或巴布膏剂中的一种。

凝胶剂系指药材提取物与适宜基质制成的、具凝胶特性的半固体或稠厚液体制剂。

涂膜剂系指药物溶解或分散于含成膜材料的溶剂中，涂搽患处后形成薄膜的外用液体制剂。

贴剂系指药材提取物或和化学药物于适宜的高分子材料制成的一种薄片状贴膏剂。

巴布膏剂系指药材提取物、药物与适宜的亲水性基质混匀后，涂布于布上制成的外用制剂。巴布膏剂常用的基质有聚丙烯酸钠、羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、聚乙烯醇、明胶、甘油等。

酊剂系指药物用规定浓度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液体制剂，亦可用流浸膏稀释制成。酊剂可用溶解法、稀释法、浸渍法或渗漉法制各。

橡胶膏剂系指药材提取物、药物与橡胶等基质混匀后，涂布于布上的外用制剂。

膜剂系指药物与适宜的成膜材料经加工制成的膜状制剂。

软膏剂系指药物、药材细粉、药材提取物与适宜基质混合制成的半固体外用制剂。常用基质分为油脂性、水溶性和乳剂型基质。其中用乳剂型基质的亦称乳膏剂。软膏剂常用的基质有凡士林、液状石蜡、羊毛脂、蜂蜡、植物油、单硬脂酸甘油脂、高级脂肪醇等亲油性基质；聚乙二醇、淀粉甘油、甘油明胶、羧甲基纤维素钠等水溶性基质；皂类、脂肪醇硫酸酯类、高级脂肪醇及多元醇酯类、聚氧乙烯醚的衍生物类等乳化剂形成的基质。必要时可加入保湿剂和透皮吸收促进剂。

搽剂系指药材提取物、药材细粉或挥发性药物，用乙醇、油或适宜的溶剂制成的澄清或混悬的外用液体制剂。搽剂常用的分散剂有水、乙醇、液状石蜡、植物油、甘油等。

油膏剂是将植物油加热至180℃左右，按配方加入原料药，煎炸至焦黄，过滤，油液中加入蜂蜡或其它适宜的增稠剂，搅拌熔化，放冷后分装。

气雾剂系指药材提取物或药材细粉与适宜的抛射剂装在具有特制阀门系统的耐压严封容器中，使用时借助抛射剂的压力将内容物呈细雾状或其他形态喷出的制剂。不含抛射剂，借助手动泵的压力将内容物以雾状等形态喷出的制剂称为喷雾剂。

所述的药剂学可接受的辅料包括但不限于水、乙醇、十八醇、甘油、二甲硅油、明胶、凡士林、淀粉、液状石蜡、羊毛脂、蜂蜡、植物油、山梨糖醇、司盘-60、聚乙烯醇、山梨醇脂肪酸酯、高级脂肪醇、聚丙烯酸钠、羧甲基纤维素钠、单硬脂酸甘油脂、皂类、脂肪醇硫酸酯类、多元醇酯类、聚氧乙烯醚的衍生物类、半合成脂肪酸甘油酯、可可豆脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、羟苯乙酯、对羟基苯甲酸丙酯中的一种或多种。

本发明处方配伍严谨，功专效著，原料药来源广泛，本领域普通技术人员运用制剂学的公知技术，可以制备各种常用的外用中药剂型，成本低廉。经过临床初步的药效验证，疗效确切，起效快、症状消失快，使用安全。

中医理论认为增生性瘢痕为腠理肌肤损伤，经络受阻，正气虚弱，营卫失调，邪毒外入，壅滞气血，邪泄未排，气滞血淤，淤积作肿，创面虽合，而邪泄未泄。本发明外用中药配伍独特，相辅相成，多靶点、多环节、多层次作用于增生性瘢痕。

本中药组方中紫草是君药，功能凉血、活血、解毒透疹。用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤。清热凉血，用于麻疹，热病癍疹，湿疹，尿血，血淋，血痢，疮疡，丹毒，烧伤。主要使皮肤增生性瘢痕脱屑变软，还能止痒止痛，使瘢痕颜色变浅或接近正常皮肤。

红花为臣药，具活血通经、散瘀止痛之功，能改善瘢痕组织中的微血管及周围神经末梢的缺氧状况，有利于抑制瘢痕增生，促使瘢痕变软、变平。

豨莶草为佐使药，是本方的精妙之所在，豨莶草性寒味微苦，归肝、肾经，功能祛风湿，利关节，解毒。内服用于风湿痹痛，筋骨无力，腰膝酸软，四肢麻痹，半身不遂，风疹湿疮。外用则善清热解毒，化湿热，除风痒，长于风湿热痹，红肿热痛以及湿热疮疡、风疹、湿毒瘙痒等证；针对增生性瘢痕，能有效促进创面愈合减轻瘢痕挛缩，具有迅速止痛、止痒、控制渗出、抗感染力强，达到自身组织生长，痂下愈合后不留瘢痕的疗效。三者相互配合，相辅相成，治疗增生性瘢痕功专效著。

现代药理研究证实，紫草的主要有效成分为萘醌色素如乙酰紫草素(acetylshikonin)、1-甲氧基乙酰紫草素(1-methoxyacetylshikonin)等脂溶性成分，豨莶草主要含豨莶苷、奇壬醇等二萜类成分，红花含有苷类和红花黄素等；可见，三药的主要活性成分都是醇溶性和脂溶性的。因此，本发明结合中医药的传统理论与现代药理研究结论，分别以乙醇和植物油为溶剂提取组方中的醇溶性成分和油溶性成分，乙醇提取的中药成分包括除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外的诸多亲水性成分，还有难溶于水的亲脂性成分，油溶性成分则包括游离生物碱、挥发油及许多芳香族化合物等脂溶性成分。

动物实验结果显示，应用本发明原料药材的乙醇提取物或植物油提取物对增生性瘢痕中的多个环节均有显著疗效，因此，以乙醇提取物或植物油提取物作为药效成分、辅以可以接受的药用辅料，分别制成适宜的外用制剂。

本发明处方配伍严谨，功专效著，原料药来源广泛，成本低廉；经体外人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞凋亡实验和兔耳增生性瘢痕的抑制实验，本发明的药物能显著抑制皮肤瘢痕细胞增殖和减小瘢痕指数。本发明的创新性在于提供了作为活性组分的上述药物配方，同时制成透皮吸收的外用制剂，直接作用于病变部位，使药物起效迅速。

附图说明

图1本发明的制备工艺流程图。

图2培养72h的HSF细胞形态。

图3100μg/ml受试药物培养72h的HSF细胞形态。

图4-6瘢痕组织学观察结果：图4为模型组；图5为软膏治疗组；图6为阳性组。

图7-9：TGF-β1免疫组织化学：图7为模型组；图8为软膏治疗组；图9为阳性组。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作的本领域任何等同替换，均属于本发明的保护范围。

以下通过具体的实施例来说明本发明药物的制备过程：

实施例1.制备软膏剂

取豨莶草44g、红花88g、紫草132g，加80％乙醇8倍量，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15～1.20(60℃)清膏；加入十八醇80g、单硬脂酸甘油酯20g、司盘-602g、液状石蜡100g、二甲硅油5g，加热(85℃)使溶解，搅拌均匀备用；另取三乙醇胺10g、甘油150g、对羟基苯甲酸丙酯0.12g、羟苯乙酯0.24g、十二烷基硫酸钠1.5g加热(85℃)使熔融，与上述清膏混合，加水至1000g，搅拌均匀，即得本发明所述的“消疤”软膏。

实施例2.制备搽剂

取豨莶草15g、红花30g、紫草60g，粉碎成粗粉，加入70％乙醇500ml密闭，浸渍20天，每2天振摇1次；滤过，自滤器上加入70％乙醇至500ml，即得本发明所述的“消疤”搽剂。

实施例3.制备酊剂

取豨莶草20g、红花30g、紫草40g，粉碎成粗粉，混匀，照浸膏与浸膏剂项下的渗漉法(2010版中华人民共和国药典一部附录附录IO)，用80％乙醇作溶剂，浸渍48小时后缓缓渗漉，收集渗漉液，以80％乙醇调整至400ml，滤过，即得本发明所述的“消疤”酊剂。

实施例4.制备凝胶剂

取豨莶草5g、红花10g、紫草25g，加80％乙醇8倍量，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15～1.20(60℃)的清膏；取卡波姆0.8g撒于适量的纯化水中，放置24h溶胀完全，加三乙醇胺适量调pH；另取丙二醇15g、甘油10g和氮酮1.0g研磨均匀，再加入到溶胀好的卡波姆中混匀，制得卡波姆凝胶；最后取上述清膏、PVP 2.0g加入适量的纯化水，加热使其溶解，冷却，加入上述卡波姆凝胶中，搅匀，加纯化水至100g，混匀，即得本发明所述的“消疤”凝胶。

实施例5.制备膜剂

将PVA17-88、明胶和HPMC各30g加入水中溶涨24h后，加热(80-90)℃使之溶解，加入甘油5ml、水溶性月桂氮酮3ml，搅匀后置50℃水浴中保温.作为基质溶液备用。取豨莶草50g、红花50g、紫草75g，粉碎过20目筛，以乙醇回流提取，回收乙醇，得清膏，加入上述备好的基质溶液中搅匀，超声脱气；在干净玻璃板上均匀涂上液体石蜡作脱膜剂，将制得的含药基质溶液均匀铺在水平的玻璃板上(20cm×50cm)，室温下自然风干，60℃干燥，启膜，切成2cm～2cm大小的膜剂，包装，即得本发明所述的“消疤”膜剂。

实施例6.制备涂膜剂

取豨莶草30g、红花50g、紫草100g，粉碎过20目筛，加95％乙醇润湿后，置于密闭容器中，40％乙醇浸渍4d，装渗漉筒渗漉，以3-5mL/min速度缓缓渗漉，收集渗漉液备用。将PVA-12430g加入150ml 40％乙醇，浸泡使之溶化成胶浆。将渗漉液、月桂氮卓酮20g、甘油60mL倒入胶浆中边加边搅拌混匀，最后加乙醇调整使乙醇含量达40％，搅拌后迅速分装密闭，即得本发明所述的“消疤”涂膜剂。

实施例7.制备喷雾剂

取豨莶草20g、红花30g、紫草50g，干燥后粉碎为粗粉(40目)，10倍量80％乙醇浸泡1h，回流提取2h，滤过。药渣继续加80％乙醇6倍量回流1.5h，滤过。合并滤液，备用。另取羧化壳聚糖10g，用适量蒸馏水溶解，聚维酮15g，用适量90％乙醇溶解，分别在搅拌下缓缓加入上述滤液中，用蒸馏水调至1000ml，50ml喷雾剂瓶分装，钴60辐照灭菌，即得本发明所述的“消疤”喷雾剂。

实施例8.制备油膏剂

取豨莶草60g、红花120g、紫草180g，粉碎成粗粉；另取麻油1200g，加热至180℃左右，先投入豨莶草炸5min后，滤过，去渣；投入红花、紫草炸10min，滤过，去渣；趁热在药油中投入蜂白蜡，搅拌熔化，过8号筛抽滤，放冷后，分装，即得本发明所述的“消疤”膏。

实施例9以下通过应用本发明的软膏剂(“消疤”软膏)进行药效学试验来阐述本发明的有效性。

试验一.本发明的中药配方提取物体外干预人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast，HSF)的实验研究

1.材料：

1.1.药物：按照“消疤”软膏的制备方法，制备原料药的提取物，即：豨莶草4g、红花8g、紫草12g，加80％乙醇8倍量，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15～1.20(60℃)的清膏，用二甲基亚砜(DMSO)配制成摩尔浓度为10mM、5mM、2.5mM三个浓度的母液，充分溶解过滤，-20℃冰箱保存待用；使用时根据实验分组的终浓度要求及实验组细胞培养液的体积加入相应的母液量。

1.2.主要试剂和仪器MTT显色剂(购自美国SIGMA公司)，DMEM细胞培养液、小牛血清、胰蛋白酶(购自北京华美生物工程公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)，3350型自动酶联免疫检测仪(美国BECKMAN公司)，XL流式细胞仪(美国COULTER EPICS公司)。

2.实验方法

2.1.增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养

将手术切除的瘢痕组织，在无菌条件下剪成0.5cm³～1.0cm³的小块，立即投入含200U/ml青、链霉素的培养液中。在超净工作台上用刀片削去脂肪、表皮及结缔组织，将瘢痕用洗必泰浸泡消毒8分钟，再用生理盐水清洗3次。把瘢痕用无菌眼科剪剪成0.5～1.0mm³的小块，以枪状镊将组织块送入培养瓶，按适当间隔接种于培养瓶壁上，反转使有组织块的一面向上，加入含15％FBs的F12/DMEM培养基3ml，置37℃、5％CO₂孵箱中孵育4小时后，轻轻倒转，使培养液浸没组织块，待培养液变黄后更换。在倒置相差显微镜下观察培养物，当迁出的成纤维细胞汇合成片，覆盖大约75％的生长面时，即可进行传代。

2.2.传代培养

吸尽原培养液；对于组织块培养，先要用吸管取出组织块。然后用PBS清洗培养物2次，除去残留的血清。加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA混合消化液，液量以刚能覆盖单层细胞为度。轻轻摇动培养瓶。大约10分钟后，在倒置相差显微镜下观察。当90％的细胞已变为圆形时，慢慢倾斜培养瓶，用吸管轻轻吸出消化液。加入含血清的培养液终止胰蛋白酶。用吸管吸取培养液，反复吹打瓶壁，使细胞与瓶壁分离，并分散为单个细胞悬液，然后根据实验需要用培养液调节细胞密度。将细胞悬液接种到新培养瓶内，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。每2～3天换液一次。

2.3.实验分组

A组：空白对照；                B组：加入受试药物25μg/ml；

C组：加入受试药物50μg/ml；    D组：加入受试药物100μg/ml。

2.4.MTT比色法检测细胞增殖

将处于生长期的HSF，以2×10⁵/ml的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，每孔体积100μl，分别于加入受试药物，24h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态，并向每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl，每组设3个复孔。在37℃、5％CO₂条件下继续培养4h，终止培养后弃上清液。每孔加入150μlDMSO液，在振荡器上振荡混匀，使紫色结晶物充分溶解后，用自动酶联免疫检测仪检测细胞的增殖率，倒置相差显微镜下观察细胞形态。

2.5.检测细胞周期

于加入受试药物24h后收集各组细胞，调整细胞密度为1×10⁶/ml，离心弃上清液，用PBS液离心洗涤2次后，加1ml的PBS液于试管中，置快速混匀器上充分振荡成单细胞悬液，再加入4℃预冷的无水乙醇2ml，立即振荡混匀，置4℃冷藏12h，用PBS液离心洗涤2次弃去固定液，加入1ml PI染色液混匀，4℃避光孵育30min后，用流式细胞仪检测细胞周期。

2.6.统计学处理

数据经SPSS 10.0软件包进行统计分析，所有数据均用表示，各组间比较采用Student′t检验，P＜0.05为有显著差异水平。

3.结果

3.1.对HSF增殖的影响

应用MTT比色法测定HSF的增殖力。与A组比较，B、C、D组的HSF增殖力均降低，其差异有统计学意义(P＜0.05)；受试药物浓度越高HSF增殖力越弱，即具有浓度依赖性(表1)；在倒置相差显微镜下观察可见D组的细胞形态明显收缩，部分细胞飘浮、崩解死亡，其他各组的细胞形态正常(附图2、3)。

表1受试药物对HSF细胞增殖的影响(n＝6，)

  浓度(μg/ml)  吸收度  浓度(μg/ml)  吸收度  0  0.434±0.015  50  0.253±0.021^*

  25  0.271±0.011^*  100  0.237±0.014^*

注：^*P＜0.05。

3.2.细胞周期

与A组比较，B、C、D组的HSF在G₀/G₁期时细胞比例均升高，统计学分析其差异有统计学意义(P＜0.05)；也具有浓度依赖性(表2)

表2受试药物对HSF的周期变化情况(n＝6，)

  浓度(μg/ml)  G₀/G₁期(％)  S期(％)  0  31.13±2.31  49.26±5.12  25  37.35±3.70^*  43.08±1.68^*  50  44.92±2.32^*  39.01±1.72^*  100  51.24±2.45^*  31.31±3.51^*

注：^*P＜0.05。

4.结论

(1)受试药物在一定浓度范围内可以抑制体外培养HSF的增殖，并具有浓度依赖性；

(2)细胞周期检测结果表明，受试药物的主要作用是阻止HSF由G₀/G₁期进入S期，即导致G₀/G₁期的HSF增加，S期的减少，这也可能是其抑制HSF增殖的关键所在。

综上所述，一定浓度范围内的受试药物具有抑制HSF增殖的作用，即具有体外抗瘢痕纤维化的作用。该发现为进一步探索受试药物对HS纤维化的防治作用和作用机制提供了实验依据。

试验二.本发明的“消疤”软膏治疗兔耳增生性瘢痕的实验研究

增生性瘢痕是整形外科基础研究的重要课题之一，严重创伤、烧伤及外科手术后常常遗留增生性瘢痕，影响外观和功能，但一直都缺乏理想的治疗方法。近年来大量的研究热衷于从祖国中医中药中筛选出疗效确切、副作用小的有效药物来抗疤痕纤维化。但对于药物防治瘢痕增生的研究手段，主要有3种途径：一是细胞培养，尤其是成纤维细胞培养，通过药物对成纤维细胞的作用来进行筛选；二是将人的病理性瘢痕组织移植到裸鼠的皮下，研究药物对瘢痕组织作用产生的变化；三是通过药物临床实践来总结有关药物防治和瘢痕的经验。这些方法已经取得了一定的成绩。然而，只有动物本身产生的瘢痕模型，才能深入地研究瘢痕发生、发展及其转归。

在多种器官纤维化的研究中，TGF-β1是研究得最多、作用最强的致纤维化因子，也是首先被发现得有利于创口愈合的因子，TGF-β1的持续存在会不断刺激成纤维细胞诱导基质产生，导致过度的细胞外基质(ECM)沉积的纤维反应。在各种实验模型和临床纤维化疾病中，TGF-β1持续上调，抑制TGF-β1的生物活性会抑制基质生成和调节纤维化过程，这个指标是检测瘢痕形成或者预后的比较好的指标之一，因此我们选用它作为测量指标。

1.材料

1.1.药物按照实施例1制备的软膏剂100g。

1.2.仪器与试剂转化生长因子β1(TGF-β1)抗体(武汉博士德生物工程公司)。手术常用无菌器械、电子数显卡尺(上海恒量量具有限公司)、德国leica倒置显微镜、德国Leica切片机、德国leica DM4000B光学显微镜、德国leica Qwin V3图像分析软件(均由同济医学院提供)；移液器(法国GILSON公司)。

2.实验动物及饲养条件

日本大耳白兔，雌雄不限，(2.5±0.5)kg，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(生产许可证号：SCXK(鄂)2004-0007)；试验前后均单笼饲养，自由饮水，室温(22±3)℃，湿度55％～65％。

3.实验方法

3.1.动物模型的建立

动物瘢痕模型的制作参照Morris方法并加以改良：速眠新臀部肌注(0.2ml/kg)麻醉。常规消毒兔耳腹侧面，在每侧的兔耳腹侧中部沿长轴避开血管做4个边长为1cm的正方形切口，完整切除全层皮肤及软骨膜，保留软骨，其间相距1cm，创面用湿盐水纱布压迫止血、油纱覆盖，其上用弹力胶带固定，每日更换敷料1次，直至其痊愈后形成瘢痕增生块。

3.2.动物分组及处理

20只日本大耳白兔共制备160个全层皮肤缺损创面，伤后21d创面均上皮化，每天局部外用软膏一次，涂抹适量软膏后，轻柔按摩10～15分钟左右。造有瘢痕的兔子随机分为5组，其中实验组3组：A组：浓度为500mg软膏治疗组(高)、B组：浓度为250mg软膏治疗组(中)、C组：浓度为100mg软膏治疗组(低)、阳性对照组D组：相同容积的生理盐水对照组、阴性对照组E组：未处理的瘢痕组，A、B、C、D、E各4只兔子(32个瘢痕)，于其后1周(术后32d)取材、取每组瘢痕数的一半；取材后当天接着外用剩余的瘢痕，其后1周(术后43d)行剩余瘢痕取材。取材方式：按上述麻醉方式及消毒，切口沿瘢痕边缘位于兔耳正常皮肤与瘢痕交界处，垂直于皮肤表面，深达软骨表面，整个瘢痕组织完整切取。作HE及TGF-β1免疫组织化学染色。

3.3.瘢痕厚度测定

术后32、43d用彩色超声诊断仪(探头超声频率为13MHz)，于同一测定人在相同条件下测定各组创面形成瘢痕的厚度。

3.4.瘢痕组织HE染色

瘢痕组织标本用4％多聚甲醛固定，石腊包埋，连续5μm厚度切片，常规切片，做HE染色，观察增生性瘢痕的病理表现。

3.5.组织胺的测定

(1)各EP管中分别加入去离子水1ml，加热煮沸(破坏细胞，释出组织胺)20min，摇匀后于1500g离心10min，吸出上清液(0.5ml)，贮存于-70℃冰箱作组织胺分析。

(2)上清液的处理：以上步骤提取的上清液，加双蒸水1.15ml后，缓缓加入25％(w/v)三氯乙酸0.35ml，混匀后取上清液0.3ml。

(3)组织胺的提纯：将0.3ml上清液置入已加1.5gNaCl的10ml带塞试管中，再加入4.0ml正丁醇和0.2ml2.5M的NaOH，立即混匀，置震荡器震荡5min，将组织胺提取到正丁醇中，静置后取3.6ml正丁醇相，加到已含1.2ml0.1MHCl和2.0ml正庚烷的试管内，震荡5min弃去有机相，组织胺回到水溶液中，取出0.8ml HCl相。上述步骤已去除干扰物质，将组织胺移到酸性水溶液中。

(4)荧光物质的生成：0.8ml HCl相用双蒸水稀释一倍，加0.4ml 0.4M的NaOH碱化，混匀并迅速加入新鲜配制的0.1％(w/v)邻苯二醛(O-phthaldehyde，OPT)甲醇液0.1ml，立即混匀在21-22℃反应10min，加0.4ml0.5M HCl酸化终止缩和反应，并使组织胺与OPT形成的荧光物质稳定。

(5)空白对照的制备：0.5ml的双蒸水，与样品平行操作，但步骤(4)中加液顺序为0.4ml 0.5MHCl、0.1％(w/v)OPT甲醇液0.1ml、0.4ml 0.4M的NaOH。

(6)荧光强度测定：用F-2500型荧光分光光度仪，在激发波350nm，荧光波600nm下测定荧光强度。

3.6.增生性瘢痕组织中TGF-β1免疫组化检测

切片经二甲苯脱腊和梯度酒精脱水，3％过氧化氢阻断过氧化物酶。然后与TGF-β1一抗(1∶100)4℃冰箱孵育过夜，滴加适量生物素标记山羊抗鼠IgG，37℃孵育20min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3×5min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育20min，PBS冲洗3×5min，DAB显色，自来水充分冲洗，如需要，苏木素复染，脱水，透明，封片。于光镜下观察阳性信号，阳性信号为黄色。在400倍光镜下观察结果，在每张切片的上、中、下、左、右找5个视野进行计数，阳性细胞反应率(R)＝阳性细胞数/细胞总数，结果取均数。

3.7.统计学处理

数据经SPSS 10.0软件包进行统计分析，所有数据均用表示，各组间比较采用Student′t检验，P＜0.05为有显著差异水平。

4结果

4.1.瘢痕厚度

在术后32、43d兔耳瘢痕组织对照组D组、E组愈合创面厚度接近，明显高于A、B、C组，而C组又高于A、B组。且术后43d的愈合创面厚度与术后32d相比有明显的降低。

表1各组瘢痕厚度(mm)(n＝16，)

  组别  32d  43d  空白对照组  1.862±0.143  1.846±0.145  生理盐水组  1.874±0.146  1.853±0.144  低浓度组  1.696±0.142  1.516±0.141^*  中浓度组  1.533±0.144^*  1.313±0.164^*

  高浓度组  1.343±0.167^*  1.071±0.152^*

注：与对照组比较，^*P＜0.05。

4.2.瘢痕组织学观察结果

在术后32、43d兔耳瘢痕组织治疗组瘢痕面积变小，高度变低，质地变软，与对照组相差十分显著，在HE染色法切片上，对照组瘢痕组织内大量成纤维细胞、细胞外基质和毛细血管，浅部可见环形或螺旋样分布，组织内少量炎性细胞，软膏治疗组瘢痕组织内成纤维细胞明显少于对照组，表皮层增厚，成纤维细胞排列较规则，细胞外基质多，可见少量毛细血管，在术后43d兔耳瘢痕组织治疗组较术后32d真皮层更薄，成纤维细胞排列较整齐(附图4-6)。

4.3.组胺测定结果

表2各组组胺含量(ng/g)(n＝16，)

  组别  组胺含量(ng/g)  空白对照组  187.00±5.82  生理盐水组  163.27±3.26  低浓度组  140.97±7.71  中浓度组  90.89±10.57^*  高浓度组  56.97±8.09^*

注：与对照组比较，^*P＜0.05。

4.4.TGF-β1免疫组织化学

在术后32、43d兔耳瘢痕组织对照组D组、E组TGF-β1表达明显，黄色为阳性表达，在A、B软膏治疗组TGF-β1表达明显下降，C组TGF-β1表达有所下降。且术后43d的TGF-β1表达比术后32d有明显下降(附图7-9)。

5.结论

(1)本实验成功建立了兔耳瘢痕动物模型，有利于对瘢痕治疗的进一步研究；

(2)本实验采用软膏局部外用对兔耳瘢痕进行治疗，为避免外用不同浓度或对照药物出现相互影响，我们对造模兔子随机分组后行局部药物干预，发现治疗组中瘢痕厚度、硬度与药物浓度呈负相关；

(3)本软膏可以明显减少TGF-β1产生；同时HE染色结果显示，软膏治疗组中成纤维细胞明显少于对照组，表皮层增厚，成纤维细胞排列较规则，细胞外基质多，可见少量毛细血管，充分说明本软膏通过抑制成纤维细胞及TGF-β1的增生，起到减轻瘢痕形成的作用，并且在一定范围内其疗效与药物浓度成正比。

(4)本软膏能显著降低增生性瘢痕组织中组织胺的含量。有研究表明，瘢痕局部组织中组胺含量的升高与瘙痒有关，组胺含量升高瘙痒程度加重。

总之，实验结果显示本软膏剂能够抑制兔耳增生性瘢痕组织的增生，其可能的机制之一是减少TGF-β1蛋白的表达，而其止痒作用可能与抑制组胺的活性有关；本软膏剂是治疗增生性瘢痕较好的药物。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰或演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰或演变等，均仍属于本发明的技术方案范围。