法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-01-05
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/12 授权公告日:20120523 终止日期:20161108 申请日:20101108
专利权的终止
2012-05-23
授权
授权
2011-04-06
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/12 申请日:20101108
实质审查的生效
2011-02-23
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种新的中国南海线纹芋螺神经毒素基因及其编码的多肽S4.3和该多肽的制备技术，以及该多肽在制备促细胞生长工具药中的应用。
背景技术
芋螺(Genus Conus)是一类分布广、种类多的海洋生物。芋螺亦称鸡心螺，但由于其外壳呈圆锥形且具有美丽花纹，成芋头状而得名“芋螺”。在分类学上，芋螺属于软体动物门，腹足纲，前腮亚纲，新腹足目，芋螺超科，芋螺科。芋螺多数生活在太平洋和印度洋等热带海洋中的浅水区，少数在水深几米至200余米的深水区。白昼或退潮后在海藻下或珊瑚洞中栖息，夜晚外出觅食，春夏繁殖。
目前全世界发现的芋螺超过700种，其中我国热带和亚热带海域目前已经有详细记录的芋螺有70余种，主要分布在南沙群岛、西沙群岛、海南岛南部及台湾海域，少数在广东、广西及海南沿海，其中部分种类为我国首次记录。
芋螺按其食性可分为三大类：食鱼性芋螺(piscivorous)，食软体动物性芋螺(molluscivorous)和食虫性芋螺(vermivorous)。其中食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70％左右，而食鱼性芋螺虽然占芋螺总数最少，但毒性最强，至今为止报道的芋螺致死事件基本上是由该类芋螺造成的。
芋螺毒素(conotoxin，CTX)是一类来源于芋螺毒液的活性多肽，对芋螺自身而言，这些毒素主要用于捕食和防御。一般来说，每一种芋螺体内都含有50-200种不同的芋螺毒素，整个自然界中大约存在50,000-100,000种不同的芋螺毒素。而迄今为止，只有很少一部分的芋螺毒素被人类所发现，而具有确定功能的毒素则不足200个。芋螺毒素一般具有以下几个特点：(1)序列短分子量小。80％以上的毒素序列在7-41个氨基酸之间，分子量在5kDa以下。(2)结构致密稳定。由于芋螺毒素富含半胱氨酸，半胱氨酸的配对成键决定了芋螺毒素的基本构型，并使芋螺毒素形成致密而稳定的结构。(3)在一级结构上，半胱氨酸之间的序列是高度可变的。(4)靶点广泛但特异性强。芋螺毒素的靶点主要包括各种电压门控的离子通道(如钠、钾、钙等离子通道)和神经递质受体(乙酰胆碱受体、NMDA受体及G蛋白偶联受体等)，而一种毒素一般只作用于某受体的一到几个亚型，特异性强。
早在20世纪早期，人们就已经开始对芋螺的毒管装置进行解剖学方面的研究。而随着之后60多年的深入探索，人们发现了越来越多的具有不同生物活性的芋螺毒素。当人们对这些 毒素进一步研究后惊奇地发现，芋螺毒素本身就是一个天然的庞大的药源宝库，各种芋螺毒素在治疗慢性顽固疼痛、急性疼痛、癫痫、神经保护、心血管疾病、精神失常、运动失调、痉挛症、癌症及中风等疾病方面都具有广阔应用前景和潜在开发价值。因此，开展我国南海芋螺毒素的生化、生理、药理、尤其是分子生物学和基因工程领域的探索研究，以及开展芋螺毒素体外表达技术的研究，对于推动我国多肽科学的发展，促进多肽药物的开发，具有不容忽视的理论价值和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的中国南海线纹芋螺毒素基因及其编码的多肽S4.3。
本发明的另一个目的是提供一种新的重组表达载体pTRX-S4.3。
本发明的再一个目的是提供一种新型的多肽高效表达方法，从表达、分离和纯化几个方面对原有的多肽表达方法进行改良。
本发明的第四个目的在于提供该多肽在制备促细胞生长药物中的应用。
本发明使用的线纹芋螺采自中国海南省三亚市。
本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国南海线纹芋螺毒管中分离得到新的A-超家族芋螺毒素基因。
本发明将上述目的基因的cDNA序列分拆为3对互补序列，作为模板母链使用六段引物通过PCR扩增出全长的线纹芋螺毒素基因，并在该基因的5’端和3’分别加入了限制性内切酶Kpn I和Not I的酶切位点(TAA)，另外在5’端加入了肠激酶Enterokinase的识别位点，在3’端还加入了两个终止密码子。目的基因的核苷酸序列如序列表中<400>1序列所示。
上述基因所编码的多肽S4.3，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。
本发明利用Kpn I和Not I双酶切法对pTRX-IL10质粒进行线性化制备，切除IL10片段，得到线性化的pTRX载体，同时将上一步PCR扩增得到的目的基因的Oligo片断进行磷酸化、退火与互补配对，然后将配对好的目的基因与pTRX载体进行连接，构建出重组表达载体pTRX-S4.3并将其转入大肠杆菌DH5α中进行扩增。将扩增后测序正确的重组表达载体pTRX-S4.3转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。通过对培养条件的探索和优化，得到的重组融合蛋白的表达量较高，表达量为10mg/L菌液。
本发明还优化了重组融合蛋白的酶切和纯化方法，表达产物的超声裂解液采用QIAGEN公司的Ni-NTA Superflow填料，以Ni2+为配体进行亲和层析，得到融合蛋白粗提产物，该粗提产物再经EK酶酶切、层析过滤和反相高效液相层析纯化，可得到高纯度的多肽S4.3。
本发明获得的多肽S4.3具有促进细胞生长的生物学活性。原核表达的多肽S4.310μM刺激实验肿瘤细胞3株系及乳腺上皮细胞1株系作为对照，经MTT法检测细胞生存率结果证实，在作用36h后实验组细胞的数量与对照组相比有明显增加。因此，本发明的多肽S4.3可用于制备促进细胞生长药物。
附图说明
图1线性质粒载体pcDNA3-SfiI的制备
图2线纹芋螺毒管双链cDNA 1.1％琼脂糖凝胶电泳结果
图3线纹芋螺毒管cDNA文库总质粒PCR扩增1％琼脂糖电泳结果
图4线纹芋螺毒管cDNA文库部分重组子PCR分析结果
图5线纹芋螺毒管cDNA文库可读序列长度分布
图6线纹芋螺毒管cDNA文库基因簇中所含有的ESTs数目的分布情况
图7线纹芋螺毒管cDNA文库ESTs分类
图8线纹芋螺毒管cDNA文库中毒素序列分类
图9表达质粒pTRX的物理图谱和多克隆位点
图10重组表达载体pTRX-S4.3构建程序示意图
图11HPLC纯化中国南海芋螺毒素多肽S4.3实验图
图12线纹芋螺毒素多肽S4.3质谱图
图13为10μM S4.3作用于Hela细胞36h的细胞形态图。图13a为正常Hela细胞培养36h图，图13b为加10uM S4.3后Hela细胞培养36h图。
图14MTT检测细胞生存率图
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步说明：
实验例1：中国南海线纹芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定
1)材料
11组织样品线纹芋螺(Conus Straitus)采自中国海南三亚。
1.2质粒和菌株
质粒载体pcDNA3购自Invitrogen公司
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由中山大学生命科学学院医药分子生物学实验室保存，其基因型为：
DH5α：supE44Δlac U169(φ80lacZΔM15)hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1
1.3RNA提取试剂
DEPC水：每1000ml去离子水中加入1ml DEPC，终浓度为0.1％，充分混匀，37℃过夜后，高压灭菌。
1.4缓冲液
1.4.1碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA所用缓冲液
溶液I：50mM葡萄糖，10mM EDTA，25mM Tris-HCl(pH8.0)；
溶液II：0.2N NaOH，1.0％SDS，使用前配制；
溶液III：60ml 5M乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5ml H2O，所配成的溶液中钾离子的浓度为3M，乙酸根的浓度为5M；
TE：10mM Tris-HCl(pH7.4、pH7.6、pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)；
STE：50mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA(pH8.0)，50mM NaCl；
STE(含溶菌酶)：50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA(pH8.0)，50mMNaCl，70μg/ml溶菌酶；
10％SDS：在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加水定容至1,000ml分装备用；
1.4.2PEG法提取质粒所用缓冲液
5M LiCl：30.205g LiCl·H2O溶于水，定容至100ml，高压灭菌。
13％PEG8000：含13％(w/v)PEG8000的1.6M NaCl溶液，过滤除菌。
10M乙酸铵：把770g乙酸铵溶解于800ml水中，加水定容至1,000ml后，过滤除菌。
1.4.3琼脂糖凝胶电泳缓冲液
50×TAE：242g Tris，57.1ml冰乙酸，18.6g EDTA，定容至1,000ml。
EB溶液：100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时至完全溶解，分装，室温避光保存。
DNA加样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，50％甘油(w/v)。
RNA甲醛变性胶加样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，1mM EDTA(pH8.0)，50％甘油(w/v)，用DEPC水配制，高压灭菌备用。
5×甲醛变性胶电泳缓冲液：0.1M MOPS(pH7.0)，40mM乙酸钠，5mM EDTA(pH8.0)，用DEPC水配制，过滤除菌，室温避光保存。淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。
甲醛变性胶的制备：0.336g琼脂糖溶于20ml DEPC水中，冷却至60℃，加入5ml 5×甲醛变性胶电泳缓冲液和5.5ml的甲醛，在通风橱内灌注凝胶，冷却30min后使用。
甲醛变性胶RNA样品的制备：适量RNA，5×甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μl，甲醛0.7μl，甲酰胺2μl，65℃加热15min，迅速冰浴，加1μl上样缓冲液和少量EB。
1.4.4转化缓冲液
100mM CaCl2：1.47g CaCl2·2H2O溶于去离子水，定容至100ml，过滤除菌，4℃保存。
1.5培养基
LB液体培养基：Tryptone(蛋白胨)10g，Yeast Extract(酵母提取物)5g，NaCl 10g，加入800ml去离子水，用5M NaOH调节pH至7.2-7.5，定容至1,000ml，分装高压灭菌，4℃保存。
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入菌用琼脂粉至终浓度为1.3-1.5％，高压灭菌，灌注平板后4℃保存。
SOB培养基：Tryptone 20g，Yeast Extract 5g，NaCl 0.5g，加入800ml去离子水，加入250mMKCl溶液10ml，用5M NaOH调节pH至7.2-7.5，定容至1,000ml，高压灭菌，4℃保存，使用前加入5ml灭菌的2M MgCl2溶液。
SOB固体培养基：含20mM MgSO4及1.3-1.5％的琼脂粉的SOB培养基，高压灭菌，灌注平板后4℃保存。
SOC培养基：SOB培养基高压灭菌后，当温度降至60℃以下时，加入20ml过滤除菌的1M葡萄糖溶液，4℃保存。
2×YT：Tryptone 16g，Yeast Extract 10g，NaCl 5g，加入800ml去离子水，用5M NaOH调节pH至7.2-7.5，定容至1,000ml，高压灭菌，4℃保存。
1.6试剂和酶
LS试剂购自Gibcol BRL公司；SMARTTM cDNA Library Construction Kit为CLONTECH公司产品；Gel Extraction Kit和Plasmid Miniprep Kit购自OMEGA BIOTEK公司；Vitagene 96-easy plasmid Mini-prep Kit购自Vitagene Biochemical Technique公司；ABIPRISM Big-DyeTM Terminator v3.0Ready Reaction Cycle Sequencing Kit购自Applied Biosystems公司；Bacto tryptone和Bacto yeast extract购自OXOID公司；dNTP、RNaseA、DEPC、MOPS、重蒸酚和氨苄青霉素钠盐购自上海生工生物工程公司；Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶和T4DNA Ligase购自NEB公司；DNA ladder购自Promega公司；T7promoter sequencing primer、SP6promoter sequencing primer等引物由上海博亚公司合成；其它试剂均为国产分析纯试剂。
1.7其它溶液
氨苄青霉素溶液：用无菌去离子水配成100mg/ml，分装，-20℃保存，工作浓度为100μg/ml。
RNaseA溶液：将RNaseA溶于10mM Tris-HCl(pH7.5)，15mM NaCl溶液中，配成10mg/ml的贮存浓度，100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装后在-20℃保存备用。
50％甘油：用去离子水配制50％(w/w)甘油，高压灭菌后备用。
dNTP：用灭菌超纯水配制，分别含10mM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP，分装后在-20℃保存备用。
T7和SP6引物：用灭菌超纯水将引物配成50pmol/μl的溶液，分装后在-20℃保存备用。
2)方法
2.1线纹芋螺毒管组织的处理
取活螺体，使用喉闸破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，称重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量体积的 LS试剂(即1g组织中加入15ml)，冰浴中充分匀浆，-80℃冰箱中保存以备提取总RNA。
2.2总RNA的提取
参照Gibcol BRL公司的 LS试剂说明书进行。取50-100mg组织样品，用0.75ml LS试剂匀浆，15-30℃静置5min。然后加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒后，15-30℃静置2-15min。4℃、12,000rpm离心15min，取上层水相。加入0.5ml异丙醇，15-30℃静置10min后，4℃、12,000rpm离心10min，弃上清。再加1ml 75％乙醇漂洗沉淀，5,000rpm离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。取1μl进行1％甲醛变性胶电泳，1μl用紫外分光光度计分别测定样品在260nm、280nm波长上的光密度及初步估算RNA的纯度，-20℃保存备用。
2.3 RNA甲醛变性胶电泳
加样前，甲醛变性胶先预电泳5min，电压降为5v/cm；随后将样品加至凝胶孔，可用已知大小的RNA作分子量标准参照物，按3-4v/cm的电压进行电泳；紫外灯下观察电泳结果。
2.4碱裂解法提取质粒DNA
从平板中随机挑选转化DH5α单菌落于含Amp(终浓度为100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、225rpm振荡培养过夜。取1.5ml菌液于离心管中，4℃、12,000rpm离心1min，弃上清，用1ml STE溶液悬浮细菌沉淀，4℃、12,000rpm离心1min，弃上清，加100μl预冷的溶液I重新悬浮菌体，室温放置5min，加入200μl现配的溶液II，轻缓混匀，冰上放置5min，再加入150μl溶液III，温和颠倒震荡10s，冰上放置3-5min，4℃、12,000rpm离心5min，取上清，用等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)及氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次；水相加1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10min，12,000rpm离心5min，弃上清，再加1ml 75％乙醇漂洗沉淀，12,000rpm离心5min，弃上清，室温干燥10min，加适量含RNaseA(20μg/ml)灭菌去离子水或TE缓冲液溶解，-20℃保存。
2.5PEG沉淀法纯化质粒DNA
随机挑取转化菌落接种于50ml含Amp(终浓度为100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃震摇培养过夜；取50ml细菌培养物，5,000rpm，4℃离心5min；用10ml STE重新悬浮菌体；5,000rpm，4℃离心5min；菌体重悬于3ml的溶液I中，加入6ml新配的溶液II，颠倒混和均匀，冰浴5min；加入4.5ml溶液III，温和地颠倒5次，冰浴15min；5,000rpm，4℃离心30min；将上清转移至新的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10min；5,000rpm， 室温离心20min；去上清，用75％乙醇洗涤沉淀，5,000rpm，室温离心10min；去乙醇残液，沉淀于室温干燥后，用1.5ml TE溶解；转移至7ml离心管中，加入等体积预冷的5M LiCl溶液，充分混匀；10,000rpm，4℃离心10min；将上清转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混和均匀后室温放置10min；室温10,000rpm离心10min；去上清，用75％乙醇洗涤DNA沉淀；室温10,000rpm离心10min；去除乙醇残液，沉淀在室温干燥；DNA沉淀用700μlTE溶解后转移到1.5ml离心管中，加入RNaseA至终浓度为20μg/ml，室温放置30min；加入等体积的13％PEG8000溶液，充分混匀，室温放置10min；室温12,000rpm离心10min；去上清，沉淀用500μl TE充分溶解，经等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)及氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次后，将水相转移至新的离心管中，加入1/4体积的10M乙酸铵和2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10min；室温，12,000rpm，4℃离心10min；去上清，沉淀用1ml 75％乙醇洗涤；4℃12,000rpm离心5min；去除乙醇残液，沉淀室温干燥片刻，加入适量的灭菌去离子水或TE缓冲液，-20℃保存备用。
2.6线性质粒载体pcDNA3-SfiI的制备
pcDNA3-SfiI质粒是经过本实验室改造的载体，改造过后在pcDNA3载体中引入了新的SfiI酶切位点(图1)。PEG沉淀法提取并纯化pcDNA3-SfiI质粒，经限制性内切酶SfiI酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。按OMEGABIOTEK公司的Gel Extraction Kit说明书操作，胶回收上述酶切线性载体DNA。重复酶切和回收操作各一次，线性载体DNA以50ng/μl浓度保存备用。
2.7线纹芋螺毒管cDNA的合成
按CLONTECH公司SMARTTM cDNALibrary Construction Kit说明书操作。其原理是利用真核生物mRNA 5’端的甲基化G(m7G)且5’-5’三磷酸键连接的特殊的帽子结构和3’端的PolyA尾的特点设计锚定引物，分别进行第一链合成，LD PCR cDNA高保真扩增，酶切消化和柱回收cDNA，从而实现富集全长cDNA的目的。
2.7.1cDNA第一链的合成
在5μl反应体系中加入下列组分(冰上操作)：1μg总RNA，SMART III olignucleotide和CDS III/3’PCR引物各1μl，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72℃温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。再依次加入2μl 5×First Strand Buffer、1μl 20mmol/L的DTT、1μl 10mmol/L的dNTP Mix和1μl PowerScript RT(CLONTECH)后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42℃反应1hr逆转录合成第一链，冰浴终止反应，-40℃保存。
2.7.2LD PCR扩增cDNA第二链
在100μl的反应体系中加入下列组分：2μl第一链产物，10×Advantage 2PCR Buffer 10μl，50×dNTPs Mix 2μl，20μmol/L上下游锚定引物各2μl，50×Advantage 2Polymerase Mix 2μl和超纯水80μl补齐体积，混匀，放入预热至95℃的PCR仪，运行如下反应程序：95℃变性 1min后，继续循环程序95℃15sec、68℃6min共18个循环，冷却至4℃后取5μl PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。剩余PCR产物于-20℃保存。
2.7.3蛋白酶K消化
在50μl上一步的PCR产物(2-3μg dscDNA)中加入2μl蛋白酶K(20μg/μl)灭活DNA聚合酶，45℃温育20min，再经酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)和氯仿/异戊醇(24∶1)混合液各抽提一次，取上清，加入10μl3M乙酸钠，1.3μl糖原(20μg/μl)，260μl室温放置的95％乙醇，室温14,000rpm离心20min，用80％乙醇洗涤沉淀，空气干燥，加入79μl去离子水充分溶解沉淀。
2.7.4SfiI酶切消化
在100μl酶切体系中加入下列组分：79μl的dscDNA，10μl 10×SfiI Buffer，1μl 100×BSA和10μl SfiI内切酶。充分混匀，短暂离心。50℃温育2hr后，加入2μl 1％的二甲苯腈蓝混匀。
2.7.5cDNA的分部柱回收
将上一步酶切消化好的dscDNA上样到预处理好的CHROMASPIN-400柱，分管收集大小不一的dscDNA，每管1滴，当收集完16滴后，盖上柱子上盖；从每支收集管中取出5ul样品进行电泳检测，1％琼脂糖凝胶电泳确定符合要求的收集管号，集中后加入0.1倍体积的3M NaAc(pH4.8)、1.3μl的20mg/ml糖原及2.5倍体积的95％乙醇，-20℃放置沉淀过夜；室温14,000rpm离心20min；吸去上清，沉淀用80％乙醇洗涤，室温14,000rpm离心5min，吸去上清，沉淀在空气中干燥10min左右；用7μl去离子水溶解干燥后的dscDNA，-20℃保存备用，也可直接与载体连接。
2.7.6dscDNA与载体的连接
建立如下三个连接反应体系：经SfiI酶切的pcDNA3-SfiI载体DNA(50μg/μl)各取1μl，dscDNA分别取0.5、1.0、1.5μl，10×连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶(100units)0.5μl，加无菌去离子水至体积为10μl，设定自连对照反应体系，16℃连接16hr，以确定最佳比例。
2.7.7线纹芋螺毒管cDNA文库的电转化
DH5α电转化感受态细胞的制备：37℃划线活化的E.coli DH5α，挑取1个单菌落，接种到LB培养基中37℃剧烈震荡培养过夜。次日取新鲜LB液体培养基，按1∶100的比例扩大培养至OD600＝0.6。将菌液迅速冰浴，30min后，4℃、4,800rpm离心10min收菌，弃上清，分别用等菌液体积和一半体积的超纯水洗涤菌体一次，每1升菌液以300μl 10％甘油重悬，按每管40μl分装。
连接产物电转化DH5α感受态细胞：每40μl菌液加入1μl连接产物或对照质粒溶液，混匀，转入电转化杯，冰浴不超过5min，用卷纸擦干外壁，马上置于BioRad电穿孔仪进行电转 化，电转化参数：电压2.0kV；电流25μF；电阻200Ω；电激时间4.5mS。电击后立刻与800μl 37℃预热的SOB培养基混合，用枪混匀，尽量吸出杯内菌液，装于干净无菌的离心管中。37℃、225rpm复苏细胞1hr，涂布于Amp+的LB平板上，37℃培养箱中倒置培养12-16hr。转化产物则被分为两部分，其中一部分作为cDNA文库总库保存于25％甘油中，-80℃冻存；另一部分涂平板，4℃存放备用。
2.7.8cDNA克隆序列测定
随机挑取单克隆菌于96孔培养板中(孔中加有含Amp的培养基1ml)，塑料粘纸封住板口，于摇床中37℃震荡培养过夜。次日取100μl菌液加100μl 50％的甘油于96孔细胞培养板中保种，每板两份。一份用于测序，另一份-20℃保存备用。
利用Vitagene 96-easy plasmid Mini-prep Kit提取线纹芋螺毒管cDNA文库质粒。操作过程依照试剂盒说明书进行。琼脂糖凝胶电泳检测质粒浓度，以T7序列(5’-TAATAC GAC TCA CTA TAG GGA-3’)为测序引物，依照Applied Biosystems公司提供的ABI PRISM Big-DyeTM Terminator v3.0Ready Reaction Cycle Sequencing Kit说明书进行5’端单向序列测定。在10μl的反应体系中加入下列组分：5×Sequencing Buffer 2μl，Reaction Mix 1μl，质粒模板200ng，T7引物(3.2pmol/μl)1μl和灭菌去离子水补齐体积，混匀反应物，放入预热至96℃的PCR仪，运行如下反应程序：96℃10s，50℃5s，60℃4min，循环30次，冷却至4℃后取出反应产物。将反应产物转入96孔PCR纯化板，加入70％乙醇90μl，封上粘膜，震荡器上震荡混匀，室温避光放置20min，4℃、4,000rpm离心40min，弃上清，再倒置PCR板(PCR板下垫有纸巾)，4℃、300rpm离心30sec，去掉痕量乙醇。避光室温干燥30min，用10μl灭菌去离子水溶解沉淀。采用Perkin Elmer公司的ABI PRISM 3700自动测序仪进行序列测定。
2.7.9序列分析和同源检索
测序结果输入实验室数据库，利用计算机程序去除各测序结果所含的载体序列，对确定的序列进行拼接，并将相同的EST序列聚类。然后，分别应用BLASTX和BLASTN(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索National Center for Biotechnology Information(NCBI)的核酸和蛋白序列数据库，进行序列相似性分析和检索同源序列。利用CLUSALW进行序列比较，及DNATOOLS 6.0分析序列开放读码框。通过网站http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP并结合文献分析预测蛋白信号肽序列。
3)结果与分析
3.1线纹芋螺毒管RNA的提取
用 LS试剂提取的线纹芋螺毒管总RNA，1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测，显示样品总RNA完整性良好。测得OD260＝0.100，OD280＝0.056，根据公式：总RNA浓度(μg/ml) ＝A260×30(稀释倍数)×40，计算出总RNA的浓度约为120μg/ml；总RNA样品的A260/A280比值为1.78，位于1.7-2.0之间，说明总RNA的纯度较高。
3.2cDNA的合成
取约1μg总RNA直接进行逆转录合成第一链，取2μl的第一链产物用LD PCR法扩增富集cDNA，cDNA的一半经酶切消化和柱回收得到双链cDNA 7μl。LD PCR产物电泳结果呈现从大到小均匀的smear分布，大小在0.3-2.0kb范围内，且主要集中于500bp以上，但未见特征性亮带(见图2)。表明线纹芋螺毒管的成分多样而且转录的mRNA较为复杂。
3.3线纹芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定
取cDNA1μl用于连接反应，反应体系5μl，转化其中1μl，取1/100体积转化菌液涂板，其余用于摇总库菌落；隔日记数平板的平均单菌落数为949个。
通过计数平板的单菌落数，计算得到7ul线纹芋螺毒管双链cDNA可获得的cDNA文库克隆数为：949×100×7×5/3＝1.107×106。
通过文库总质粒PCR分析结果，表明利用载体多克隆位点两端的T7和SP6引物扩增的PCR产物电泳也出现呈现0.3-2.0kb的均匀分布(见图3)，这与cDNA的大小相互吻合。随机挑取50个单克隆，通过载体自连片段的特异引物PCR扩增鉴定，重组率超过95％(48/50)。
对已确定的重组子，利用载体多克隆位点两端的T7和SP6引物扩增后发现，大部分的插入片段大于250bp(22/24)，平均插入片段长度约为600bp(见图4)。减去上下游无关序列，线纹芋螺毒管cDNA文库平均插入子长度为405bp。
考虑到芋螺毒素分子的长度较小(7-41个氨基酸)，因此文库中所包含的cDNA插入序列也会相对较短。以上结果和分析可以显示我们构建的线纹芋螺毒管cDNA文库在文库重组子数、重组率和插入片段大小等方面均符合良好文库的质量标准。
3.4线纹芋螺毒管cDNA文库的序列测定和分布
对500个随机cDNA克隆使用T7引物进行了单向的序列测定。将测序结果输入本实验室建立的生物信息学平台的数据库，通过质检去掉载体序列和不确定的模糊序列，并对确定的序列进行拼接，进一步根据序列的相似性聚类为cluster，并与公共数据库进行序列同源性比较，其结果初步显示了线纹芋螺毒管中所蕴涵的基因信息可读序列。
根据质检的结果，有效的EST总数为429条，长度分布见图5。得到的429个EST序列被聚成137个基因簇(cluster)，其中，有21个基因簇包括两个以上的EST序列(contig)，116个基因簇由唯一的EST序列组成(singleton)。由于线纹芋螺毒管cDNA文库是非均一化的原始文库，所以其基因簇的分布在一定程度上能有效地反映相关mRNA的多样性。
根据所含EST的数量，基因簇主要分五大类(如图6所示)：
(1)有2个基因簇包含30个以上的EST序列，占总基因簇数的1.46％(2/137)，总克隆数的20.74％(89/429)。它们是线纹芋螺毒管cDNA文库中表达量最高的两种基因，分别比对上芋螺毒素A-超家族的两种前体序列。
(2)有2个基因簇包含20至29个的EST序列，占总基因簇数的1.46％(2/137)，总克隆数的11.42％(49/429)。分别与线纹芋螺毒素ω-SVIA突变体1的前体和线纹芋螺毒素κA-SIVA前体具有较高的相似性。
(3)有7个基因簇包含10至19个的EST序列，占总基因簇数的5.11％(7/137)，总克隆数的22.14％(95/429)。分别比对上线纹芋螺毒素ω-SVIA突变体2的前体，线纹芋螺毒素α-SII前体，线纹芋螺毒素SO6前体，线纹芋螺毒素SO5前体，以及18S核糖体RNA和16S核糖体RNA序列。
(4)有10个基因簇包含2至9个的EST序列，占总基因簇数的7.30％(10/137)，总克隆数的6.06％(26/429)。它们分别比对上线纹芋螺毒素ω-SVIB的前体，织锦芋螺毒素。
(5)有116个基因簇包含唯一的EST序列，即被称为singletons，占总基因簇数的84.67％(116/137)，总克隆数的27.04％(116/429)。
3.5线纹芋螺毒管cDNA的序列分类
将137个基因簇的序列提交到GenBank进行BLAST X和BLAST N同源性分析。结果表明，有对应于300个克隆的63个基因簇(占总基因簇的45.98％)与已知的功能蛋白基因具有高度的同源性(E value＜10-4)。上述基因簇主要被分成三类(见图7)。第一类为毒素蛋白基因类，其成员最多，占到了总基因簇的一半以上。第二类为看家基因，例如，线粒体RNA、核糖体蛋白基因等等。另有129个克隆与任何已知蛋白均无明显相似性，缺乏足够的信息确定其功能，被列为第三类基因。这些未知基因可能是线纹芋螺毒管中特异表达的基因，它们的多样性揭示了线纹芋螺毒管中mRNA转录结果的复杂性。
由于线纹芋螺毒管是高度特性的组织，文库主要研究的对象是在其表达量中居于主导地位的毒素蛋白序列(共计221个克隆)，又考虑到文库测序中出现较多的重复序列，因此，已有的测序数量已经可以使得我们对线纹芋螺毒管组织中毒素的基因表达概况有一个大致的了解。从图8中我们可以看到A-超家族成员芋螺毒素和O-超家族成员芋螺毒素在线纹芋螺毒素序列中占有相当大的比例。其中，前者共有132个克隆，占毒素序列克隆总数的59.7％，后者共有80个克隆，在毒素序列总数中所占的比例为36.2％。其它，如T-超家族、M-超家族、S-超家族以及含有一对二硫键的Contryphan等芋螺毒素成员在文库中也有发现(见表1)。
表1线纹芋螺毒管cDNA文库中毒素序列主要代表
实施例2：中国南海线纹毒素多肽S4.3融合表达载体的构建
1)质粒与菌株
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自Invitrogen公司，由本实验室保存，其基因型为：
DH5α：supE44Δlac U169(φ80lacZΔM15)hsdR17recA1endAl gyrA96thi-1relA1
大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)购自Stratagene公司，基因型为：
BL21(DE3)：F-ompT hsdSB(r-B，m-B)dcm galλ(DE3)
2)试剂与其他材料
限制性内切酶KpnI、NotI及T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer和dNTP购自鼎国公司；Gel Extraction Kit和Plasmid Miniprep Kit为OMEGA BIOTEK公司产品；BCATM Protein Assay Kit为PIERCE公司产品；Trans2K DNA Marker购自TransGen公司；低分子量标准蛋白14,400～108,000kD和14,300～97,200kD分别购自凯基生物和TaKaRa公司；肠激酶(EK酶)购自上海启发生物技术有限公司；色谱级TFA(三氟乙酸)为Sigma公司产品；氨卞青霉素钠盐为华北制药厂产品；Tryptone和Yeast Extract为Oxoid公司产品；T7promoter sequencing primer(T7)。中国南海线纹芋螺毒素多肽基因合成步骤中目的基因的寡聚核苷酸引物由Invitrogen公司合成；其它试剂均为国产分析纯试剂。
3)实验方法
3.1中国南海线纹芋螺毒素基因的合成
从实施例1中构建的cDNA文库中获得目的基因序列，经测序确定其全长为102个核苷酸，核苷酸序列如序列表中<400>1所示。按照核苷酸数量将目的基因的cDNA序列分拆为3对互补序列，并作为模板母链进行PCR扩增。
引物合成：设计六段引物经过PCR的方法扩增出全长的线纹芋螺毒素基因，在该基因的5’端和3’端分别加入了限制性内切酶Kpn I和Not I的酶切位点。另外在5’端加入了肠激酶Enterokinase的识别位点，在3’端还加入了两个终止密码子(TAA)，以防止发生核糖体的跳跃，引物合成序列如下所示：
(a)5’C GAT GAT GAT GAT AAA CAG AAA GAA CTG GTG CCG AGC AAA ACC 3’
(b)3’CATGG CTA CTA CTA CTA TTT GTC TTT CTT GAC CAC GGC TCG TTT TGG TGG TGG AC 5’
(c)5’ACC ACC TGC TGC GGC TAT AGC CCG GGC ACC ATG TGC CCG AGC T 3’
(d)3’G ACG CCG ATA TCG GGC CCG TGG TAC ACG GGC TCG ACG TAC ACG 5’
(e)5’GC ATG TGC ACC AAC ACC TGC CCG CCG CAG TAA TAA GC 3’
(f)3’TGG TTG TGG ACG GGC GGC GTC ATT ATT CGCCGG 5’
经合成和PCR扩增后得到目的基因的Oligo片断。
3.2重组表达载体pTRX-S4.3的构建
pTRX-IL10质粒是将人IL10基因插入pTRX质粒(pTRX质粒为申请人自行构建并申请中国专利，专利名称为：一种高效原核表达载体；专利号CN00124832.4，授权公告号CN1189565)的Kpn I和Not I酶切窗口构建而成，pTRX质粒的物理图谱如图9所示。现利用Kpn I和Not I双酶切法对pTRX-IL10质粒进行线性化制备，切除IL10片段，得到线性化的pTRX载体。pTRX载体线性化后进行胶回收和纯化操作，同时将步骤(1)得到的目的基因的Oligo片断进行磷酸化、退火与互补配对，然后将配对好的目的基因与线性化后的pTRX载体进行连接，并转入大肠杆菌DH5α中进行扩增。测序结果正确，说明重组表达载体pTRX-S4.3构建成功。反应过程如下：
3.2.1提取的pTRX-IL10质粒DNA经限制性内切酶Kpn I和Not I双酶切。
酶切反应体系为(30μL)：
将样品置于37℃酶切12hr，然后将酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，切下含目的核酸带的琼脂糖凝胶块，采用OMEGA BIOTEK公司的Gel Extraction Kit(Cat.No.D2500-02)并按照其说明书进行胶回收操作。pTRX-IL10质粒DNA经限制性内切酶Kpn I和Not I双酶切得到线性化后的载体pTRX。
3.2.2重组表达载体pTRX-S4.3的构建
将步骤3.2.1中合成的十段6条引物(Oligo)片断用原子级水溶解成10μmol/L的溶液。将引物分为互补配对的三组分别进行磷酸化与退火。
磷酸化体系为(10μL)：
互补配对：磷酸化好的互补Oligo片段加在一起，94℃反应2.5min，然后在水浴中自然冷却至45℃，得到配对好的目的基因。
然后使用T4DNA连接酶将配对好的目的基因和pTRX载体连接。
pTRX-S4.3连接反应体系为(20μL)：
将样品混匀，16℃连接过夜，其构建程序如图10所示。将连接产物加入DH5α感受态细胞进行转化，测序，结果正确，说明S4.3基因克隆成功，得到重组表达载体pTRX-S4.3。将测序正确的重组表达载体pTRX-S4.3转化至大肠杆菌BL21(DE3)构建成工程菌株。
实施例3：中国南海线纹芋螺毒素多肽基因的高效原核表达
1)重组融合蛋白粗提产物的获得
挑取上一步转化后的工程菌株单菌落接种于Amp+LB液体加富培养基中，37℃振荡培养过夜作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种于新鲜的Amp+LB丰富培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至OD600约为1.0，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，同时加入20％葡萄糖至终浓度0.2％，于18℃诱导表达12hr。诱导结束后4℃、10,000rpm离心10min，收菌，所得菌体用预冷的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤菌体一次，离心，再用预冷的Lysis Buffer(50mmol/LNaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)以1∶10的比例重悬。以300W功率，冰浴下超声1.5h破碎细菌细胞。超声结束后4℃离心两次：10,000rpm离心10min，12,000转离心20min，收集上清，得到重组融合蛋白的粗提产物。
2)重组融合蛋白的纯化
2.1重组融合蛋白的亲和层析
由于重组融合蛋白在融合伴侣和目的蛋白之间具有6×His标签，与Ni2+、Cu2+、Zn2+等金属离子有特异的结合能力。因此可利用Ni2+金属离子层析纯化融合蛋白。
采用QIAGEN公司的Ni-NTA Superflow填料，以Ni2+为配体，层析柱的灌注及使用前后的处理方法见说明书。
Ni-NTA Superflow柱料孔径为60-160μm，整个操作过程维持2.0ml/min的恒定流速。用5倍柱床体积的Lysis Buffer清洗封存的Ni-NTA Superflow亲和层析柱，去除乙醇并平衡层析柱，接着将超声后的离心上清上柱，用Lysis Buffer洗柱至紫外吸收值达到基线，过程中留取穿流峰样品。然后使用咪唑浓度为20mmol/L的Wash Buffer进行杂蛋白洗脱，最后使用咪唑浓度为150mmol/L的Elution Buffer洗脱目的蛋白。得到初步纯化后的重组融合蛋白。
2.2重组融合蛋白的酶切
采用Pharmacia公司的Sephadex G25柱更换样品缓冲系统。层析柱的灌注及处理方法详见说明书。整个操作过程维持2.0ml/min的恒定流速。先用2倍体积的EK酶酶切Buffer平衡层析柱，接着将Ni2+纯化后的目的蛋白上柱，然后继续使用EK酶酶切Buffer进行洗脱并收集目的蛋白峰。样品经Sephadex G25凝胶过滤层析将缓冲液更换为酶切缓冲液后，加入2％的EK酶酶切18h。
2.3酶切产物G50凝胶过滤层析
Sephadex G50Fine分子筛层析柱规格为Pharmacia XK50(5.0cm×100cm)，使用AKTAexplorer系统进行中压层析，流速恒定为2ml/min。用50mM NH4HCO3平衡Sephadex G50层析柱1～1.5个柱床体积，上样50ml酶切产物样品。设定自动收集程序，收集紫外吸收目的蛋白峰。得到产物多肽S4.3。
2.4多肽S4.3的HPLC检测与纯化
冻干后的目的蛋白用少量去离子水溶解后直接上C18反相柱进行检测并纯化。线性梯度洗脱，程序如图11所示，215nm和280nm处双波长检测，收集少量洗脱峰样品准备进行质谱检测，检测质谱图见图12。其余样品再次进行真空冷冻干燥并保存于-20℃。实例4：MTT法检测多肽S4.3对细胞生存率的作用
MTT全称3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
1)试剂与其他材料
MTT浓度为5mg/ml，称取MTT 0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
2)MTT用途及原理
MTT主要有两个用途：
(1)药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定；
(2)细胞增殖及细胞活性测定。
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
3)MTT法实验步骤
(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入160ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔；
(2)5％CO2，37℃孵育12h，至细胞贴壁后即可加药，每孔加40ul，设3个复孔；
(3)5％CO2，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察；
(4)每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液；
(5)每孔加入100ul二甲基亚砜，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪用双波长OD570nm/630nm处测量各孔的吸光值；
(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
本实验选取的4株细胞系分别为：乳腺上皮细胞系(MCF-10A)，乳腺癌细胞系(MB-MDA-231)，乳腺癌细胞系(MCF-7)以及子宫颈癌细胞系(Hela)。
4)结果分析
图13为用Carl Zeiss-ImagerZ1正置荧光显微镜(100X)所拍摄的10μM多肽S4.3作用于Hela细胞36h的细胞形态图，图5a为正常Hela细胞培养36h图，图5b为加10uM S4.3后Hela细胞培养36h图。由图5可直观地看出，加入10μM多肽S4.3的实验组细胞生长速度明显快于未加入多肽S4.3正常生长的对照组细胞。
图14为MTT检测细胞生存率图，本实验使用1/2倍比稀释的方法检测多肽S4.3对四种不同细胞株生长情况的影响。设定不加入S4.3多肽的实验组细胞生长率为100％，实验组细胞生长率＝实验组细胞MTT吸光值的平均值/对照组细胞MTT吸光度的平均值。由图可见，MCFl0A细胞株在多肽S4.3浓度为[0，0.5]mg/ml时没有出现明显促进生长的现象(p＞0.05)，但在浓度为1.0mg/ml的S4.3多肽作用下，生长率为136％(p＜0.01)，证明在高浓度下，多肽S4.3对MCF10A细胞株生长有明显促进作用。MB-MDA-231细胞株在S4.3的加入量为0.0039mg/ml的条件下，已经出现促进细胞生长的效果，生长率为154％(p＜0.05)；而在S4.3浓度达到0.5mg/ml时，生长率达到实验中的最高值185％(p＜0.01)，说明在此浓度下，S4.3有显著刺激MB-MDA-231细胞株生长的作用。同样，Hela细胞株和MCF-7细胞株在S4.3不同浓度作用下，也显示出明显的加快生长的效果。
序列表
<110>中山大学
<120>中国南海线纹芋螺毒素S4.3的制备及应用
<160>2
<210>1
<211>105
<212>DNA
<213>中国南海线纹芋螺(Conus Striatus)
<220>
<221>precursor peptide
<222>(1)…(102)
<400>1
cag aag gag ctg gtc cct tcg aaa acc acg act tgc tgt ggt tat 45
Gln Lys Glu Leu Val Pro Ser Lys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Tyr
1 5 10 15
agt cca ggg aca atg tgc cct tct tgc atg tgc aca aat acc tgt 90
Ser Pro Gly Thr Met Cys Pro Ser Cys Met Cys Thr Asn Thr Cys
20 25 30
ccc ccc caa taa taa 105
Pro Pro Gln *
<210>2
<211>33
<212>PRT
<213>中国南海线纹芋螺(Conus Striatus)
<220>
<221>precursor peptide
<222>(1)…(33)
<400>2
Gln Lys Glu Leu Val Pro Ser Lys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Tyr
1 5 10 15
Ser Pro Gly Thr Met Cys Pro Ser Cys Met Cys Thr Asn Thr Cys
20 25 30
Pro Pro Gln
机译： 中国The-Honeysuckle花卉制剂在制备抗冠状病毒药物制备中的应用及中国梭罗根屋牙布花卉制剂的制备方法
机译： 芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt103及其制备方法和应用
机译： 芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104及其制备方法和应用
