法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-08-21
授权
授权
2011-03-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/11 申请日:20080310
实质审查的生效
2011-02-09
公开
公开
【要求的优先权】
本发明要求以下申请的优先权：2007年10月29日提交的申请号为61/000,797的美国临时申请、2007年12月17日提交的申请号为61/007,867的美国临时申请、2007年12月28日提交的申请号为61/006,179的美国临时申请和2007年12月28日提交的申请号为12/003,662的美国临时申请。需要指出的是申请号为12/003,662的美国申请要求2003年5月15日提交的申请号为10/439,262的美国申请和2006年3月31日提交的申请号为11/278,143的美国申请的优先权
【技术领域】
本发明关于一种通过内含子的微核糖核酸因子的转基因表达来开发、生成与筛选人类类胚胎干细胞的手段和方法。具体而言，本发明是关于一种用来生成非天然产生的内含子的方法与组合物。此内含子的组成能在人类细胞中被加工成小发夹样前体微核糖核酸(microRNA(miRNA))分子，因此诱导细胞中的某些与分化相关的基因以及决定命运的基因的沉默效应，进而使该等细胞转重新编程为多潜能类胚胎干细胞状态。优选地，发夹样前体微核糖核酸(pre-miRNA)包括mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d和与上述核糖核酸手工重新设计的前体同源物，以及它们的组合。
【背景技术】
近来关于人类干细胞的研究已显示其可用来移植治疗的巨大潜力。然而，可用来复制人类干细胞(hES)的来源却受到限制，并且很难控制其纯度与品质。于1998年，James Thomson等人(如US5,843,780、US6,200,806、US7,029,913及US7,220,584等专利)从人类胚胎的胚胞中分离出第一株人类胚胎干细胞(Thomson et al.，(1998)Science 282：1145-1147)。而H1与H9两株典型的细胞株则由上述分离的人类干细胞中衍生出来。两年后，Gearhart等人(如US6,090,622、US6,245,566及US6,331,406等专利)也发展出从人类胚胎的后胚胞(post-blastocyst)中分离出人类类胚胎干细胞的原始生殖细胞(primordial germ cells)的手段和方法。因为这些胚胎干细胞的分离方法必须将原来的胚胎破坏，因此许多道德上、人文宗教上的疑虑逐渐提升，以至于争论这些胚胎干细胞用于临床治疗的正当性。
近年来，人们逐渐重视使用这些分离的人胚胎干细胞系的安全性问题。举例来说，由于用于使人类胚胎干细胞系长期保持多潜能干细胞状态的培养条件需要一些由周围的的饲养层成纤维细胞所释放的未知因子，因此这些人类胚胎干细胞通常培养于小鼠或人类的成纤维细胞的饲养层层中。Reubinoff等人的先前技术包括US6,875,607尝试完成此方法，然而成纤维细胞的饲养层具有全然不同的抗原特性，而可能污染人类胚胎干细胞并造成病人免疫上的排斥。此外，虽然已经有开发出一些无饲养层的培养环境条件，但没有一种条件能维持稳定、未分化的人类胚胎干细胞持续一段时间。这是因为，被分离出来的人类胚胎干细胞的纯度通常不高。现今并无任何一株胚胎干细胞在培养环境中能达到百分的百的高纯度。即使是在最佳饲养层培养环境条件下，有比例不确定(约有3～5％或更多)的人类胚胎干细胞倾向于分化成其它细胞型态并丧失其干细胞的特性。经常观察到的胚胎干细胞分化的细胞类型是畸胎瘤(teratoma)。畸胎瘤是一种衍生自人类生殖细胞系的肿瘤，其常包含多种癌化的细胞型态，这些型态相似于内胚层、中胚层及外胚层。因此，如何避免饲养层污染及增加干细胞纯度是现今干细胞研究主要的两项课题。
诱导型多潜能干细胞(iPS)是由Takahashi及Yamanaka最近于2006年提出的(Cell 126：663-676)。将四种转录因子基因(Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4)通过使用转基因传递进入小鼠成纤维细胞中，于体外将体成纤维细胞成功地重编程和转化成类胚胎干细胞的多潜能细胞。在2007年，Okita及Wernig等人确认iPS细胞的行为特性与小鼠胚胎干细胞(mES)的相似(Okita et al.，(2007)Nature 448：313-317；Wernig et al.，(2007)Nature 448：318-324)。此外，Yu等人藉由相似的方法使用四个其它的转基因(Oct4、Sox2、Nanog及LIN28)从人类成纤维细胞开发更新颖的iPS细胞(Yu et al.，(2007)Science 318：1917-1920)。iPS的应用不近能解决以前的hES细胞中存在的道德与纯度的问题，而且如果与体细胞核转移技(SCNT)术配合还可提供一种对患者友好的治疗方式(Meissner et al.，(2006)Nature 439：212-215)。上述基于iPS细胞技术的体细胞核转移治疗技术已经在转基因小鼠模型中证实能成功治疗镰刀型贫血症(Hanna et al，(2007)Science 318：1920-1923)。然而，iPS的应用仍有缺陷。在iPS细胞生成过程中出现两个问题；第一个问题是使用反转录病毒转基因；另一个问题是使用癌基因(e.g.c-Myc)。而反转录病毒转染方式是唯一一种可有效同时转染转基因传递四种全长转录基因进入靶体细胞的方法，然而反转录病毒载体随机插入转染的细胞的基因组可能会影响非靶基因并造成不可预期的结果，当一个或多个传递的基因是癌基因时这尤其危险。
要精确地同时将四个全长转基因传递至同一个细胞是相当困难的。然而，iPS细胞技术事实上需要使用多个转录因子以弥补和调整它们之间的信号传导以及某些其它的发育因子。虽然详细的机制仍不清楚，但Oct4-Sox2-c-Myc-Klf4或Oct4-Sox2-Nanog-LIN28的基因结合效应似乎导致了细胞早期分化所需的发育信号的取消。尽管胚胎干细胞标计Oct4，在iPS细胞生成中所使用的所有其它基因与某些发育系相关。这些基因通常表达于不同胚胎细胞时期和/或位置而导引细胞走向特定分化路径。藉由错置这些基因，这些发育信号的干扰以某种方式终止了细胞分化的分化，进而使这些宿主细胞返回至类似胚胎干细胞的状态，直至另一个发育信号的出现。这一套方法能达到目的但并不自然。在自然的受精卵中，母系物质主要对干细胞的维持与复制的调控负责。这就是胚胎干细胞在128-细胞时期之前全都相同的并都具有全能的原因。母系物质产生于卵子发生时期，并存于成熟的卵子中以供早期胚胎发育。在小鼠的卵子中，核糖核酸占了母系物质很大的比例，约占整体基因组转录组的45％(Stitzel et al.，(2007)Science 316：407-408)。在母型-合子型过渡中，母系RNAs很快速地降解，合子的转录过程则早在两细胞时期开始以产生供胚胎进一步发育的信号(O’Farrell et al.，(2004)Curr.Biol.14：R35-45)。据信许多母系RNAs是合子基因产物的抑制物，以在最早期胚胎时期可抑制发育信号并维持全能/多潜能细胞分化。因此，干细胞维持及复制的秘密应该存在于母系物质中，而不存在于远远晚于多潜能干细胞时期显现的发育信号中。
简言之，为了生成并维持类人类胚胎干细胞(hES)-like cells)样细胞模仿母系物质的天然途径，需要一种新颖的方式来转基因传递分离的母系物质到人体干细胞或体细胞中，以维持干细胞特性或重编程体细胞成hES样细胞。因此，仍然需要一种使用母系物质特别是母系核糖核酸的有效、简单、安全的转基因方法和试剂组合物以产生hES样细胞。
【发明内容】
本发明是一种使用发夹样微核糖核酸(microRNA)因子的内含子表达来培育、生成与筛选类胚胎干细胞的转基因方法，所述发夹样微核糖核酸因子为例如mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d及它们相互重组的前体微核糖核酸的同源物，和它们的组合。微核糖核酸通常约长18到27(nt)的核苷酸，并取决于miRNA和它靶的物的互补程度能直接降解它们的信使核糖核酸(mRNA)靶或抑制靶蛋白的翻译。在所有哺乳动物中，mir-302家族是高度保守的，此家族由四个高度同源的微核糖核酸成员组成(＞90％同源性)，它们分别是mir-302a、mir-302b、mir-302c和mir-302d。mir-302家族一起表达成长RNA转录物的簇，该长RNA转录物编码从5端到3端的mir-302b-mir-302c-mir-302a-mir-302d-mir-367(Suh et al.，(2004)Dev.Biol.270：488-498)。虽然mir-367共同表达在mir-302簇中，然而mir-367实际上的表达水平低于mir-302家族。而mir-302家族成员的表达被发现只在小鼠卵细胞及人类胚胎干细胞中高水平地表达(Tang，et al.，(2007)Genes Dev.21：644-648；Suh et al.，(2004)Dev.Biol.270：488-498)。小鼠的卵细胞缺乏岱塞尔(Dicer)，岱塞尔是一种保守的核糖核酸酶可供微核糖核酸生成，卵细胞限制在减数分裂I的分裂时期，这现象表示微核糖核酸对于卵细胞生成的过程扮演重要的脚色(Murchison et al.，(2007)Genes Dev.21：682-693)。因此，mir-302家族非常有可能是用于干细胞维持和复制的必要的主要母系物质。
与先前使用提升四种细胞转录因子基因的表达水平的iPS细胞技术不同，每一个mir-302家族的成员接能够调控超过445种细胞基因，并且根据miRBase::Sequences程序(http:/microrna.sanger.ac.uk/)的数据库，每一个mir-302家族的成员几乎具有相同的靶基因。许多mir-302的靶基因实质上为参与引发或促进胚胎发育的早期细胞分化的发育信号。因此，mir-302的功能很可能是阻断或抑制发育信号的大量产生而不是干扰特定信号路径。例如，类胰岛素生长因子(IGF))对于神经元特定的干细胞及其先驱细胞系是潜在发育信号，此信号是经由促Ras/Raf/分裂原活化蛋白激酶(MAPK)路径或经由磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt信号传导路径。超过18种IGF受体(IGFR)与Ras/PI3K信号传导路径被发现是mir-302家族的靶基因，此现象表示在哺乳卵细胞及胚胎干细胞中有一严密的调控来阻止神经元特定的细胞分化。mir-302家族互补地与靶基因的转录物的同源序列结合，进而经由RNA干扰机制抑制他们的蛋白翻译。还观察到mir-302家族对不同组织细胞中的许多其它发育基因具有类似抑制效应。据上述证据，mir-302家族很可能对于胚胎干细胞的维持与自我复制扮演很重要的角色。藉由抑制细胞发育及分化的靶基因，mir-302家族可能不仅可将体细胞重新编程并转化成胚胎干细胞，而且还能维持该细胞的多潜能与自我复制的胚胎干细胞能力。
为了测试mir-302的干细胞生成与维持功能，本发明的发明人使用基于Pol-的内含子的微核糖核酸表达系统在不同人类体细胞中转基因表达mir-302家族成员，模仿天然内含子的微核糖核酸生成路径(图1)。内含子的miRNA的生成过程依赖于初生的Pol-Ⅱ导的pre-mRNA转录及内含子剪接/切除之间的偶合相互作用，通常发生在一些靠近基因组染色质纤维附近的细胞核中(Lin et al.(2004)Drug Design Reviews 1：247-255；Ghosh et al.(2000)RNA 6：1325-1334)。在真核细胞中，编码蛋白的基因转录物，如信使核糖核酸是由ⅡRNA聚合酶所生成。通常基因组基因的转录生成前体信使核糖核酸(pre-mRNA)，其包含四个主要部分：5’端非翻译区域(UTR)、编码蛋白的外显子、无编码的内含子及3’端非翻译区域(3’-UTR)。广义来说，5’端及3’端非翻译区域可视为特定内含子。内含子占前体信使核糖核酸中无编码序列很大的一部分。每一个内含子可以被被排列成多达约30个千碱基对，且必须在信使核糖核酸成熟前从前体信使核糖核酸中切除。前体信使核糖核酸切除和内含子移除的过程称为核糖核酸剪接，它通常通过细胞内剪接体执行。在核糖核酸剪接作用之后，一些由内含子衍生的核糖核酸片段被进一步处理而形成微核糖核酸(miRNA)样衍生分子，这些分子能有效地分别沉默抑制它们的靶基因，上述沉默抑制机制是通过类核糖核酸干扰机制实现的，而前体信使核糖核酸(pre-mRNA)的外显子会接合一起而形成成熟的信使核糖核酸以供蛋白质生合成。
我们已经证实有效的miRNA能由脊椎动物基因中的内含子生成，此生成过程与小干扰核糖核酸(siRNA)或基因间微核糖核酸(miRNA)生成机制不同(Lin et al.(2003)Biochem Biophys Res Commun.310：754-760；Lin et al.(2005)Gene 356：32-38)。为了表示这个差异，图2比较了在小干扰核糖核酸(siRNA)、基因间(外显子)的微核糖核酸(miRNA)与内含子的微核糖核酸(miRNA)之中的天然的生物产生与RNAi机制。一般推测，siRNA是由两条完整互补的核糖核酸所形成，其中这两条核糖核酸是由同一DNA模板上相反位置的启动子所转录而成，然后杂交，之后进一步被RNaseⅢ核酸内切酶，即岱塞尔(Dicer)加工成约20到25碱基对的双股核糖核酸。不同于siRNA模式，基因间miRNA(如lin-4及let-7)的生成包含一长无编码初级RNA转录物，此分子是直接由Pol-Ⅱ或Pol-Ⅲ核糖核酸启动子所转录而成；然而对于内含子的pri-miRNA，只通过Pol-Ⅱ将其与它的编码基因共同转录，并在核糖核酸剪接后以剪接的内含子形式被释放。在细胞核中，pri-miRNA进一步由多希亚样(Drosha-like)RNases(用于形成基因间miRNA)或剪接体及外来体成分(用于形成内含子miRNA)切除形成发夹样茎环前体(称为pri-miRNA)，之后再被运送至细胞质中以被miRNA相关的Dicer加工而为成熟微核糖核酸。接着，上述三种形式的小调节RNA最后被掺入到核糖核酸诱导沉默复合体(RISC)中，此复合体包含双股的siRNA或单股的miRNA。Dicer与核糖核酸诱导沉默复合体用于生成siRNA与miRNA的路径是不同的路径(Tang，G.(2005)Trends Biochem Sci.30：106-114)。作为结果，一般而言miRNA的效果比siRNA的更专一并且更有利，这是因为miRNA只涉及单股链。换句话说，siRNA主要引发信使核糖核酸的降解，而miRNA能诱导信使核糖核酸的降解或抑制蛋白质生合成，或者二者，这取决于序列与它们靶基因转录物的互补性。因为内含子的miRNA路径是被细胞内多重调控机制所调整，其中多重调控机制包含Pol-Ⅱ转录机制、RNA剪接、外来体消化及无义介导降解(NMD)加工，因此内含子微核糖核酸的基因沉默效应被认为是所有三种RNAi路径中最有效、最专一、最安全的路径(Lin et al.(2008)Frontiers in Bioscience 13：2216-2230)。
本发明揭露一种内含子用于基因调控的新功能及其有关的应用。如图3A与图3B所示，基于内含子的核糖核酸剪接作用与加工机制，本发明优选实施方式是Pol-Ⅱ介导的重组基因表达系统，此系统至少包含能经剪接的内含子，此内含子在本发明当中称的为SpRNAi，SpRNAi具有抑制靶基因或抑制与SpRNAi序列高度互补的基因的功能。SpRNAi是与重组基因的前体mRNA(pre-mRNA)通过Pol-ⅡNA聚合酶共同转录的，并通过核糖核酸剪接后SpRNA被切割出来。从而，剪接后的SpRNAi进一步被加工为成熟的基因沉默剂(例如小发夹核糖核酸(shRNA))及微核糖核酸(miRNA))，该些基因沉默剂能激发RNAi相关的基因沉默效应。在内含子被剪接移除后，重组基因的外显子转录物被连接而形成成熟的信使核糖核酸分子，以供翻译合成标计或功能性蛋白。
如图3A所示，SpRNAi内含子的必要成分包含数个相同的核苷酸元件，其包含5′-剪接位点、分支点模体(BrP)、多嘧啶串以及3′-剪接位点。此外，发夹样核糖核酸(shRNA-like)的前体微核糖核酸序列是在5′-剪接位点和分支点模体(BrP)之间插入SpRNAi中。此部分的SpRNAi内含子于核糖核酸剪接和加工时能形成套马索(lariat)结构。此外，SpRNAi构建体的3′端包含多个翻译停止子密码子区(T密码子)，以提升内含子RNA剪接作用与无义介导降解过程的精确性。当T密码子显现于细胞质中的信使核糖核酸，此T密码子能传递活化无义介导降解路径的信号，以供降解细胞中任何异常的核糖核酸积累。然而，高度二级结构的shRNA与前体微核糖核酸(pre-miRNA)的插入片段能分别地被保留至Dicer剪接而形成成熟的siRNA与miRNA。再加上，为了在细胞中表达，我们利用技术手段将SpRNAi构建体在红色萤光蛋白(RGFP)基因(来自珊瑚礁紫点海葵(Heteractis crispa)的突变色蛋白)的Drall限制酶切位插入，而形成重组的SpRNAi-RGFP基因。其中红色萤光蛋白基因的第两百零八个核苷酸位置被限制酶Drall作用后会产生AG-GN核苷酸的断点，并于断点两端产生三个核苷酸突出的结构，在SpRNAi插入后上述断点分别形成5′剪接位点及3′剪接位点。因为SpRNAi的插入破坏了功能性红色萤光蛋白的结构(该破坏的结构通过内含子剪接可以被恢复，因此我们可以利用红色萤光蛋白在转染细胞中的出现来判定内含子的shRNA/miRNA的释放。红色萤光蛋白基因还能提供许多外显子剪接增强子(ESE)以提升核糖核酸的剪接作用的正确性与效率。
如图3B所示的另一种优选的实施方式中，本发明提供使用合成核糖核酸剪接与加工元件(例如以5′剪接位点、分支点模体、多嘧啶串以及3′受体剪接位点)的遗传工程方法形成人造的SpRNAi，此人造的SpRNAi至少包含所需要的用于反义核糖核酸、shRNA和/或miRNA生成的核糖核酸插入片段。去氧核糖核酸合成器(DNA synthesizer)可化学制备及连接这些元件。另一方面这些元件的连接可通过限制酶和连接酶实现。这样获得的内含子可直接转染至细胞中或与进一步参如到细胞基因中以通过Pol-Ⅱ与转录物(即pre-mRNA)共表达。在核糖核酸剪接与信使核糖核酸成熟过程中，所需要的RNA插入片段通过细胞内的剪接体及无义介导降解机制被切除并被释放，然后引发所需要的对与所述插入的RNA序列高度互补的特定基因转录物的基因沉默效应；而重组基因转录物中的外显子连接在一起以形成成熟的信使核糖核酸，而表达所需要的基因功能，例如报导基因或以下几种标计蛋白的翻译：红色萤光蛋白(RGFP)、绿色萤光蛋白(EGFP)、萤光素酶、β半乳糖苷酶(lac-Z)以及它们衍生物的同源物。报导/标计蛋白的存在能有效定位感染细胞中插入的shRNA/miRNA分子产生的位置，有利于鉴定所需基因沉默/RNAi效果。
根据本发明，由连接外显子所形成的成熟信使核糖核酸也可能有助于传统基因治疗去修补损害或缺失的基因功能，或提高特定基因表达。在其它方面，本发明提供一种新颖组合物和手段以诱导细胞通过内含子的RNA剪接和加工机制产生基因沉默分子，此沉默分子引发反义介导基因敲除或核糖核酸干扰效果(RNAi)，这些作用能有效抑制靶基因功能。这样获得的衍生自内含子的基因沉默分子包含反义核糖核酸、核糖酶、短暂小分子核糖核酸(stRNA)、双股核糖核酸(dsRNA)、小干扰核糖核酸(siRNA)、非编码小分子核糖核酸(tncRNA)、小发夹核糖核酸(shRNA)、微核糖核酸(microRNA，miRNA)及与核糖核酸干扰(RNAi)有关的前体核糖核酸结构(pri-/pre-RNA)。使用这些内含子的核糖核酸所衍生的基因沉默试剂是用于打靶和沉默不需要的以下基因的有效工具：致病转基因、病毒基因、突变基因、癌基因、与疾病相关小核糖核酸基因及任何编码和非编码蛋白的基因。
使用Pol-Ⅱ介导的SpRNAi-RGFP表达系统，我们已成功地于人类前列腺癌细胞LNCaP、人类子宫颈癌细胞HeLa以及大鼠神经干细胞细胞HCN-A94-2(Lin et al.(2006a)Methods Mol Biol.342：295-312)产生具有全基因沉默效果的成熟shRNA及miRNA；在斑马鱼、鸡以及小鼠体内(Lin et al.(2006b)Methods Mol Biol.342：321-334)亦有相同的效果。我们已于斑马鱼与许多不同人类细胞株中，靶向于绿色萤光蛋白与其它细胞基因转录物和表达，测试过不同的前体微核糖核酸加入片段的构建体，并得知较有效的基因沉默微核糖核酸是来源于5’剪接位点与分支点模体之间的内含子序列的靠近5’端。如图3C所示，显著的基因沉默效果近发生在被抗绿色萤光蛋白的前体微核糖核酸(anti-EGFP pre-miRNA)的插入片段(泳道4)转染中，然而在由左到右的泳道所示的其它插入片段的组中没有检测到此效果：1、空载体控制组(Ctl组)；2、针对爱滋病病毒蛋白(HIV-p24)的前体微核糖核酸插入片段组(模拟组)；3、无发夹环结构的反义绿色萤光蛋白插入片段且组(anti组)；以及5、与抗绿色萤光蛋白的前体微核糖核酸完全互补的反转抗前体微核糖核酸序列(miR*组)组。对于其它非靶基因，例如标记红色萤光蛋白以及管家β肌动蛋白并没有效果，这表示这种内含子miRNA介导的核糖核酸干扰(RNAi)具有高度靶专一性。为了进一步证实核糖核酸剪接在内含子的核糖核酸干扰的效果，我们已测试三种不同的SpRNAi-RGFP表达系统，如图3D显示(由左到右)：1.表达无内含子的红色萤光蛋白的载体(无任何前体微核糖核酸插入片段的SpRNAi-RGFP表达系统)；2.表达具有内含子的抗绿色萤光蛋白前体微核糖核酸插入片段的红色萤光蛋白的SpRNAi-RGFP表达系统；和3.与2构建体类似的但在SpRNAi中具有缺陷的5’-剪接位点的SpRNAi-RGFP表达系统。由Northern印迹法分析资料显示，成熟的微核糖核酸只从SpRNAi-RGFP表达系统2构建体的剪接的内含子中释放出来(泳道2)，此SpRNAi-RGFP表达系统与图3C的具有抗绿色萤光蛋白前体微核糖核酸插入片段的SpRNAi构建体(泳道4)完全相同，这表明需要靠细胞内RNA剪接来形成内含子的miRNA。
基于上述理解，我们进一步确定前体微核糖核酸(pre-miRNA)插入片段的优选的结构设计以诱导最显著的基因沉默效应并认识到在RNAi效用物(核糖核酸诱导基因沉默复合体(RISC))的装配过程中细胞对成熟miRNA链的选择存在很强的结构偏好(Lin et.al.(2005)Gene 356：32-38)。RISC是一种蛋白核糖核酸复合体，能导致靶基因转录物降解或通过核糖核酸干扰机制抑制翻译。siRNA双链体的形成在与siRNA相关的RISC的组装中起了关键的作用。siRNA双链体的两条链在功能上是不对称的，而且组装成RISC复合体只偏好一条链。这种偏好是由每一条链5’端碱基对的热动力稳定所决定。基于siRNA的模式，推测miRNA及与其互补的miRNA(miRNA*)双链体的形成在与miRNA相关的RISC的组装中是必需的步骤。假如此模式是真的话，则在pre-miRNA的茎环结构中应当观察不到任何功能偏好。然而我们发现，在斑马鱼中，内含子的pre-miRNA的茎环结构的参与了用于RISC组装的成熟miRNA的链的选择。
如图4A所示，我们构建了含有一对对称的pre-miRNA构建体的两个不同的插入了内含子的微核糖核酸的SpRNAi-RGFP表达载体，它们分别命名为miRNA*-茎环-miRNA[1]及miRNA-茎环-miRNA*[2]。这两组的前体微核糖核酸具有相同的双链茎臂结构，该茎臂结构针对于EGFP第280到第302的核苷酸序列。具体而言，miRNA是指全长完整的成熟微核糖核酸序列，而miRNA*是指与成熟微核糖核酸的序列互补的逆向核苷酸序列。经脂质体将表达这些miRNA的SpRNAi-RGFP的载体(每一个60μg)转染到两周大的斑马鱼幼胚24小时后(Lin et al.(2005)Gene 356：32-38)，我们使用mirVana微核糖核酸分离管柱(Ambion，Austin，TX)分离了斑马鱼小RNAs并随后通过含有靶序列的乳胶珠(latex beads)将所有与靶EGFP区匹配的具有潜力的微核糖核酸(miRNA)沉淀下来。测序后，一个有效的微核糖核酸(miR-EGFP(280-302))被鉴定为在5’-miRNA-径环-miRNA*-3’[2]构建体的转染中具有活性，如图4B所示的灰色阴影序列。因为成熟的微核糖核酸(miRNA)只有在转染了5’-miRNA-径环-miRNA*-3’[2]构建体的斑马鱼中被发现，因此与miRNA相关的RISC可能倾向于优先与5’-miRNA-径环-miRNA*-3’[2]构建体作用而不是与5’-miRNA*-径环-miRNA-3’[1]的前体微核糖核酸，这表明对于内含子miRNA-RISC组装存在结构倾向性。在此实验中，利用经由肌动蛋白启动子驱动的斑马鱼Tg(UAS：gfp)链，即Tg(actin-GAL4：UAS-gfp))，此斑马鱼会在鱼体的几乎所有类型的细胞中组成型表达绿色萤光EGFP。如图4C所示，在此斑马鱼中转染SpRNAi-RGFP载体后，将使靶EGFP沉默并共表达红色萤光标记蛋白RGFP，该蛋白作为内含子miRNA在感染的细胞中生成的阳性指示剂。胃肠部份的基因沉默效应较弱于其它组织，推测可能是此部位的核糖核酸酶(RNase)活性较强的原故。图4D中，基于Western印迹法，在用5’-miRNA*-茎环-miRNA-3’[1]或5’-miRNA-茎环-miRNA*-3’[2]pre-miRNA转染的鱼中均检测到指示剂RGFP蛋白的表达；而靶EGFP的表达的基因沉默只存在用5’-miRNA-茎环-miRNA*-3’[2]构建体中，这验证了图4C的结果。因为5’-miRNA*-茎环-miRNA-3’[1]及5’-miRNA-茎环-miRNA*-3’[2]的5末’端的茎臂的热动力稳定力相同，因此我们推论内含子的前体微核糖核酸的径环参与了在RISC组装中成熟微核糖核酸的链选择。假设已知Dicer在茎臂上的切割位点用于确定成熟微核糖核酸的链选择(Lee et al.(2003)Nature 425：415-419)，则内含子的前体微核糖核酸的径环可能用于确定特定切割位点的识别。
在以上早期的设计中，因为许多天然的前体微核糖核酸的径环结构太大而不适用于SpRNAi-RGFP表达载体的有效表达，因此采用小的tRNAmet环(即，5’-(A/U)UCCAAGGGGG-3’)(SEQ.ID.NO.29)来取代天然的pre-miRN环。tRNAmet环被证明能有效促进设计的微核糖核酸(miRNA)通过相同的Ran-GTP及出核转运蛋白(Exportin)-5运输机制从核内运输至细胞质中(Lin et al.(2005)Gene 356：32-38)。当前，本发明使用一对人工改良的pre-mir-30环(即5’-GCTAAGCCAGGC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTAGC-3’(SEQ.ID.NO.2)，它们能提供同样有效的天然前体微核糖核酸的核运输并且不干扰转移核糖核酸的运输。这些新的前体微核糖核酸环的设计是基于模仿mir-302s的小径环的改进，其能在胚胎干细胞中高水平表达，但在分化的组织细胞中表达程度较低。因此，用这种人造的前体微核糖核酸环并不会干扰天然的微核糖核酸在人体中的运输路径。
关于前体微核糖核酸的插入，因为重组的SpRNAi-RGFP构建体的内含子插入位点在其5’端及3’端分别与PvuI及MluI的限制酶切位点侧翼链接，此初级内含子的插入片段能被各种具有匹配的粘性末端的基因专一性的前体微核糖核酸插入片段取代(例如，抗绿色萤光蛋白及mir-302的前体微核糖核酸)。通过改变针对于不同基因转录物的前体微核糖核酸插入片段，这种内含子的微核糖核酸产生系统能被应用于在体内和体外诱导靶基因沉默的一种强大工具。为了确认正确的插入片段尺寸，插入pre-miRNA的SpRNAi-RGFP构建体(10ng)可通过采用一对寡核苷酸引物(即，5’-CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA-3’及5’-TCTAGAAGTT GGCCTTCTCG GGCAGGT-3’)的聚合酶链式反应(PCR)扩增，PCR反应条件是在94℃(1分钟)、52℃(1分钟)、及70℃(1分钟)循环25个周期。得到的PCR产物再通过2％的琼脂糖凝胶电泳层析并然后用凝胶提出试剂盒(Qiagen，CA)提取并纯化以进行测序确认。
本发明采用原理论证设计的Pol-Ⅱ介导的SpRNAi-RGFP表达系统，并利用此系统在人类和/或小鼠细胞中转基因表达mir-302基因家族(mir-302s)。在一个优选的实施方式中，本发明提供一种使用非天然存在的内含子及其以下成分的方法，所述成分能被人类或小鼠细胞加工成mir-302-类似核糖核酸分子，以诱导细胞中与发育或分化相关基因的特定基因沉默效应；所述方法包含下列步骤：a)提供1)一种表达mir-302s所靶向的与发育或分化相关的多种基因的细胞底物；并提供2)能表达的包含能产生驱动内含子的初级RNA转录物的重组基因的组合物，所述的驱动内含子的初级RNA转录物能通过细胞内RNA剪接和/或加工机制从内含子中生成人工设计的mir-302-类似核糖核酸分子，从而在所述细胞底物中下调靶基因的表达或抑制靶基因功能；b)在所述细胞底物中靶基因的功能是被抑制的条件下用所述组合物处理所述细胞底物。之后，所述细胞底物被转化为表达胚胎干细胞标志(如Oct3/4，SSEA3及SSEA4)的类胚胎干细胞。所述细胞底物能在体外(in vitro)、体内(in vivo)、离体(ex vivo)等情况下表达靶基因。广义而言，内含子为基因中不编码的序列，其包含阅读框内含子与5’端非反译区域及3’端非反译区域。在某些层面，人工设计的mir-302-类似核糖核酸分子包含mir-302a、mir-302b、mir-302c或mir-302d序列的最靠前的17个核苷酸(如5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3))。所有mir-302家族的微核糖核酸皆拥有从5’端数来相同的前17个核苷酸。或者，人工设计的mir-302-类似核糖核酸分子也能插入到细胞基因中的内含子的区域以与这些基因共同表达。一般而言，内含子插入技术的种类包含类质粒的转基因转染、同源基因重组、转座子传递、跳跃基因整合及反转录病毒感染。
在另一方面，本发明的重组基因表达前体信使核糖核酸(pre-mRNA)结构的构建体。该重组基因主要由外显子与内含子两大不同部分组成。所述外显子部分在核糖核酸剪接后能被连接形成功能性信使核糖核酸(mRNA)进而转翻译成蛋白，以供辨认内含子的核糖核酸的释出，而所述内含子从所述重组基因转录物中被剪接出来并进一步被加工成充当基因剪接效用物的所需要的内含子RNA分子，其可为反义核糖核酸、微核糖核酸(miRNA)、小发夹核糖核酸(shRNA)、siRNA、双股核糖核酸以及以上核糖核酸的前体(即，pre-miRNA与Pi RNA)。这些所需要的内含子的核糖核酸分子可包含发夹样茎环结构，此结构包含与5’-GCTAAGCCAG GC-3’(SEQ.ID.NO.1)或是5’-GCCTGGCTTA GC-3’(SEQ.ID.NO.2)同源的序列模体，该序列不仅能促进核所需要的糖核酸分子正确地从所述内含子中被剪接出来，还能促进该分子由细胞核运输至细胞质中。而且这些内含子衍生的核糖核酸分子的茎臂包含互补或同源或者既互补有同源于靶基因或者所述靶基因转录物的编码序列的序列。所述需要的核糖核酸分子的同源或互补序列的大小从约15个核苷酸碱基到约1500个核苷酸碱基，最优选为约18个到约27个核苷酸碱基。这些所需要的内含子的核糖核酸分子对于靶基因序列的互补或同源率为约30％到100％之间，对于所需要的小发夹样内含子的核糖核酸更优选为35％到49％之间，对于线形内含子的核糖核酸则更优选为90％到100％。
此外，非天然存在的内含子的5’端包含5’剪接位点，其中该5’剪接位点与以下序列同源：5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或GU(A/G)AGU模体(即，5’-GTAAGAGGAT-3’、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)；而它们的3’端是与GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG模体(即，5’-GATATCCTGC AG-3’、5’-GGCTGCAG-3’和5’-CCACAG-3’)同源的3’剪接位点。此外，分支点序列是位于5’端与3’端剪接位点之间，其包含同源于5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)模体，如，5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’)。该分支点序列中的腺苷酸(A)通过细胞内(2’-5’)-寡腺苷酸合成酶及剪接体在几乎所有的剪接体内含子中形成(2’-5’)-连接的套马索的内含子核糖核酸的一部分。此外，多嘧啶串是位于所述分支点模体与3’-剪接位点之间，并且与5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)或5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)同源的高含量的胸腺嘧啶与胞嘧啶的寡核苷酸序列。其中，符号“m”与“n”是指大于或等于1的多重复序列；更优选地，m的数值为1-3，而n的数值为7-12。符号“-”是指无任何核苷酸。一些接头核苷酸序列能用来连接所有这些内含子成分。根据37CFR1.822指南中对用于核苷酸和/或氨基酸序列资料的符号和格式的规定，符号W是指腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号K是指鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号S是指胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，符号Y是指胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号R是指腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)以及符号N是指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。
在本发明的另一个优选的实施方式中，重组基因组合物可被掺入到表达载体以供基因转染。所述表达载体选自DNA转基因、质粒、跳跃基因、转座子、反转录转座子、反转录病毒载体、慢病毒载体(lentiviral vectors)、腺病毒(AMV)载体、腺相关病毒(AAV)载体、改性的肝炎病毒(HBV)载体、巨细胞病毒相关(CMV)的病毒载体。在转染SpRNAi-RGFP构建体过程中，能表达不同内含子的基因沉默效应物的多功能载体能用于实现多个靶基因的沉默效应。或者，多基因沉默效应物能衍生自SpRNAi-RGFP构建体的内含子的发夹核糖核酸插入片段，以提供多基因沉默效应。此方法的优势是通过使用基于载体的转基因转染或病毒感染而稳定传递，从而提供稳定及相对长期的特定基因沉默效应。一方面，在控制以下核糖核酸启动子的条件下，本发明经由细胞内核糖核酸剪接及加工机制能产生核糖核酸干扰相关的基因沉默效应物，该基因沉默效应物包含小干扰核糖核酸(siRNA)、微核糖核酸(miRNA)和/或小发夹核糖核酸(shRNA)；所述启动子选自Ⅱ型核糖核酸聚合酶启动子(Pol-Ⅱ)、Ⅲ型核糖核酸聚合酶启动子(Pol-Ⅲ)及病毒启动子。该病毒启动子为类Ⅱ型核糖核酸聚合酶激活启动子，并从巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒长末端区域、乙型肝炎病毒(HBV)、腺病毒(AMV))和腺相关病毒(AAV)中分离得到。例如，慢病毒(lentiviral LTR)启动子能在每个细胞内足以提供高达5x105拷贝的前体信使核糖核酸。此外，在所述慢病毒启动子的前端插入对药物敏感的抑制子以控制其基因沉默效应物的表达转录速率也是可行的。所述抑制子能被化学药物或抗生素抑制，这些化学药物或抗生素选自G418、四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素及上述抗生素的衍生物等。
本发明提供了在细胞内产生内含子的核糖核酸以及在体内通过核糖核酸剪接和加工机制的新颖手段和方法，以产生成熟的siRNA、miRNA及shRNA，这些RNA可诱导核糖核酸干扰相关的基因沉默效应。取决于细胞如何表达与加工本发明内含子前体miRNA/shRNA插入片段的机制，所需要的siRNA、miRNA和/或shRNA可产生单个单位或多个单位。例如，据报道在斑马鱼中一个抗绿色萤光蛋白的前体微核糖核酸(pre-miRNA)插入的内含子的异位表达，如同图3A所示，实际上产生两组不同长度的成熟微核糖核酸，如mir-EGFP(282/300)与mir-EGFP(280-302)，这暗示SpRNAi的一种基因沉默RNA插入物能产生超过一种的基因沉默效应物。相同或相异的基因沉默效应物能产生与靶基因转录物互补的正义或反义的构型或者二者。在某些情况下，内含子的基因沉默效应物能与靶基因转录物(即mRNA)杂交，以形成双链核糖核酸(dsRNA)以引发二级核糖核酸干扰(RNAi)效应。因为内含子的基因沉默效应物是由本发明的表达载体持续产生，这能减轻小核糖核酸在体内应用时被快速降解的疑虑。
此外，本发明可产生干细胞。本发明潜在应用包含无饲养层细胞的人类胚胎干细胞系的维持并避免上述细胞株系分化、成体干细胞系在体外复制并培养、纯化同构型干细胞群及利用上述干细胞进行移植。本发明亦可为用来研究干细胞功能及机制的工具或可供改变干细胞性质以致于用于特定用途的组合物和方法。在不同的实施方式中，本发明的类胚胎干细胞的多潜能细胞选自正常体细胞、癌化体细胞、哺乳类(如人类、猴子、大鼠及小鼠)的成体干细胞衍生而得。
【附图说明】
图1显示天然内含子的微核糖核酸(miRNA)生成机制；所述内含子的微核糖核酸通过Pol-Ⅱ与前体信使核糖核酸共同转录并经RNA剪接作用从前体信使核糖核酸中切割出来；而链接的外显子成为成熟的信使核糖核酸以供蛋白质的合成。经剪接并具有反义或者发夹样二级结构的内含子的微核糖核酸被进一步加工成为成熟的微核糖核酸，该成熟的微核糖核酸能够引发RNAi相关基因沉默效应。因此，我们设计了至少包含前体微核糖核酸结构(或称SpRNAi)、并能模拟天然内含子的微核糖核酸的生物合成(图3A及图3B)的人造内含子。SpRNAi被掺入到细胞或重组基因中；在Pol-Ⅱ启动子或病毒启动子(P)调控下，其通过Pol-ⅡRNA聚合酶表达。在细胞内转录生成后，这样产生的基因转录物在感染细胞中通过RNA剪接和加工，然后释放预先设计的内含子的核糖核酸分子。在某些情况下，所需要的核糖核酸分子为反义核糖核酸构建体，该反义结构可用作反义寡核苷酸探针用于基因敲除。在其它情况下，所需要的核糖核酸分子包含小反义核糖核酸及正义核糖核酸片段以形成双链siRNA以诱导RNAi。在一些其它情况下，所需要的核糖核酸分子为能够导致RNAi相关基因沉默效应的发夹样核糖核酸构建体。
参照特定的附图仅用于说明的目的，而不是用于限制的目的；说明如下：
图1显示细胞内天然内含子的微核糖核酸(miRNA)生成机制。
图2显示siRNA、外显子(基因之间)的微核糖核酸及内含子的微核糖核酸的不同生成机制路径。
图3A到3D显示本发明优选的实施方式的在表达载体组合物中SpRNAi-RGFP重组基因构建体(A)和使用这种组合物产生能模仿天然内含子的微核糖核酸生物合成的人造微核糖核酸的策略(B)。针对于绿色EGFP的SpRNAi-RGFP表达组合物在鱼中的体内测试显示，通过蛋白质印迹分析确定专一于靶向绿色萤光蛋白基因表达的基因敲低效果超过85％(C)。通过1％甲醛琼脂糖凝胶电泳及RNA印迹分析后可以观察到内含子衍生的抗绿色萤光蛋白的微核糖核酸及其剪接前体(D)。
图4A到4C显示SpRNAi-RGFP构建体中的不同设计的内含子的核糖核酸插入片段的效用评价。有效的miRNA生物合成，及观察到它在两周大的斑马鱼幼鱼中针对靶向的绿色萤光蛋白导致基因沉默效应，证实了核糖核酸诱导沉默复合体组装中对在5’-miRNA*-径环-miRNA-3’[1]与5’-miRNA-径环-miRNA*-3’[2]的发夹核糖核酸结构分别具有不对称的偏好(A)。绿色萤光蛋白的基因沉默只在转染前体微核糖核酸结构[2]中发现，而不是在转染结构[1]中被发现。因绿色萤光蛋白与红色萤光蛋白的颜色重迭后会呈现红色大于绿色(如图所显现的深橘色)，因此靶绿色萤光蛋白的表达量在前体微核糖核酸结构[2]转染组中降低，而载体的指示物红色萤光蛋白则在所有载体转染组中等量表达(B)。用蛋白质印迹分析绿色萤光蛋白的量，证实在转染前体微核糖核酸结构组[2]中具有明显的基因沉默效应(C)。在用其它物质，例如仅用脂质体(Lipo)、无任何插入片段的空载体(Vctr)以及siRNA(siR)组处理的鱼中没有观察到任何基因沉默效应。
图5A到5C显示在mir-302-类似的核糖核酸分子在人类原代表皮细胞(hpESC)、人类前列腺癌细胞株(PC3)及人类原发性黑色素瘤细胞株(primary melanoma culture)(Colo)中转基因表达后细胞型态及细胞增殖的改变。在mir-302转染后，表达mir-302的细胞分别称为hpESC+mir-302、PC3+mir-302及Colo+mir-302。
图6A到6E显示具有转染mir-302表达(例如，Colo+mir-302及PC3+mir-302)的Colo及PC3的细胞株的胚胎干细胞特性，这些特性包含形成胚样体，如图6A所示；Oct3/4、SSEA-3及SSEA-4标记表达的蛋白质印迹分析，如图6B；基因组的去甲基化分析，如图6C；CpG去甲基化分析，如图6D；及细胞迁移，如图6E。
图7A到7B显示微核糖核酸微阵列分析的结果，证实mir-302家族成员在转染的Colo细胞(Colo+mir-302)中全部高水平表达。
图8A到8B显示在具有转基因mir-302表达的Colo细胞(Colo+mir-302)中改变的基因表达的基因微阵列的分析结果(Affymetrix human GeneChip U133A&B，CA)，结果显示，有许多胚胎标志基因的表达水平明显升高，而癌症标记及发育信号基因的表达则显著下降，这与人类胚胎干细胞HuEC8及H9细胞的基因表达模式相似。
图9A到9C显示表达转基因mir-302Colo细胞(Colo+mir-302)在用不同的发育信号物质(如，荷尔蒙或生长因子)能分化为各种细胞类型，这些细胞类型类似于衍生自外胚层、中胚层、内胚层及生殖细胞的组织细胞，这证实其具有与胚胎干细胞的多潜能性相似的多潜能性。
【具体实施方式】
尽管下文参照附图描述了本发明特定的实施方式，但应当理解为这些实施方式仅作为实施例并仅仅说明少量的多种可能的具体实施方式，它们代表本申请原理的应用。各种改变和修饰对于本发明所述领域的技术人员来说是显而易见的，并属于本发明的宗旨、范围和打算，这些进一步由所附权利要求所限定。
本发明提供了一种新组合物及方法，该方法通过使用内含子衍生的核糖核酸使真核细胞遗传特性改变。不局限于任何特定的理论，这种遗传特性改变是通过新发现的内含子驱动的基因沉默机制而产生，此机制是通过将至少包含能进行RNA剪接的内含子(命名为SpRNAi)的重组基因转染到目标细胞或有机体中实现的。SpRNAi还携带内含子的核糖核酸插入片段，该插入片段通过细胞内核糖核酸的剪接与加工机制而被释出来，并然后对靶基因转录物引发RNAi/转录后基因沉默(PTGS)相关的基因的沉默效应，所述靶基因转录物与所述内含子的核糖核酸的插入片段高度互补。一般来说，如图4及图5所示，当重组基因利用化学方式或脂质体转染或病毒感染进入真核细胞时，该内含子的核糖核酸的插入片段经由Pol-Ⅱ与所述重组基因共转录，并然后通过核糖核酸的剪接与加工的机制如剪接体、外来体与无义介导降解系统(NMD)等作用后而释出。在核糖核酸的剪接期间，内含子的核糖核酸形成套马索核糖核酸并进一步加工成基因沉默效应物，如短暂小分子核糖核酸(stRNA))、反义核糖核酸、小干扰核糖核酸、小发夹核糖核酸(shRNA)、微核糖核酸(miRNA)、Piwi相互作用的核糖核酸(piRNA)及这些核糖核酸的前体。因此，这些基因沉默效应物将经由RNA诱导的转录沉默复合物(RISC)及RNA诱导的转录沉默引发剂(RNAi-induced initiator of transcriptional silencing(RITS))的功能组装作用而降解它们的标的靶基因转录物或抑制靶蛋白翻译。
为了模仿天然的前体信使核糖核酸(pre-mRNA)剪接及加工机制，我们使用细胞内剪接体、外来体与NMD系统来催化内含子移除并加工我们构建的SpRNAi-RGFP表达系统。经由一连串细胞内剪接体组成物对SpRNAi的几个snRNP辨识元件(如snRNPs、U1、U2及U4/U6.U5tri-snRNP的结合位点)组装后，SpRNAi被释出以进一步加工成基因沉默效应物。将合成的snRNP辨识元件掺入SpRNAi中并随后将该SpRNAi掺入本发明的重组的RGFP构建体表达系统的方法将分别于实施例1及二2中描述。
设计、建构及评估能诱导内含子核糖核酸介导的基因沉默效应的Pol-Ⅱ介导的重组的SpRNAi-RGFP基因表达系统
用于在体内引发细胞内核糖核酸剪接与加工导致基因沉默效应机制的策略已经被测试，本发明使用含有人工剪接内含子(SpRNAi)的Pol-Ⅱ转录的重组基因载体(称为SpRNAi-RGFP)以表达内含子的基因沉默效应物(如图3A与3B)，所述基因沉默效应物如miRNA与发夹样shRNA。将SpRNAi通过顺序链接几段合成的DNA序列基因工程地掺入红移萤光蛋白基因(RGFP)中，如实施例1及实施例2所述。SpRNAi包含前体miRNA或shRNA插入片段，这些插入片段可以通过细胞核糖核酸的剪接与加工的机制(例如剪接体，外来体和NMD系统组成)被释放，然后通过产生成熟的miRNA或shRNA基因沉默效应物引发内含子RNA介导的基因沉默机制。尽管在本文中我们显示了通过内含子RNA剪接和加工重组基因转录物或构建体诱导靶基因沉默的模型，然而同样的原理还可以用于设计和产生通过RNA加工核糖体前体核糖核酸(pre-rRNA)发挥功能的基因沉默效用物，该基因沉默效用物主要通过I型核糖核酸聚合酶(Pol-I)转录。此外能用来携带和产生SpRNAi的核糖核酸转录物包含不均一核核糖核酸(hnRNA)、核糖体核糖核酸(rRNA)、转移核糖核酸(tRNA)、小核仁核糖核酸(snoRNA)、小核核糖核酸(snRNA)、病毒核糖核酸以及上述核糖核酸的衍生物及前体。
如实施例1与2及图3A所示，SpRNAi被合成被被掺入无内含子-红移萤光蛋白(RGFP或rGFP)基因，该基因来自紫点海葵(Heteractis crispa)的HcRed1突变的色蛋白。因为SpRNAi的破坏了造成红色萤光蛋白有功能的荧光蛋白的结构，我们通过在成功转染的细胞或者有机体在570nm波长处重新出现红色荧光发射能够检测内含子的去除和RGF基因转录物的信使核糖核酸(mRNA)的成熟。重组的SpRNAi-RGFP构建体的构建是基于前体信使核糖核酸(pre-mRNA)中剪接体内含子的天然结构。SpRNAi的主要组成包含数个snRNP辨识位点及接头，如用于精确切割的在末端的5’-剪接位点和3’-剪接位点、用于剪接识别的分支点模体(BrP)、用于与剪接体相互作用的多嘧啶串((PPT))、用于连接每一个所述组分的接头，以及一些用于所需内含子插入片段的限制酶切位点。如图3B所示，本发明的SpRNAi在结构上从5’端到3’端包含5’-剪接位点、抗-(靶基因)内含子的插入片段(可被剪接和加工后而形成基因沉默效应物)、分支点模体(BrP)、多嘧啶串(PPT)及用于功能性剪接体组织的3’-剪接位点。此外，一些翻译终止密码子(T codon))位于靠近SpRNAi的3’-剪接位点的接头序列中。
一般来说，5’-剪接位点是包含或同源于5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或是GU(A/G)AGU模体(例如，5’-GTAAGAGGAT-3’、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)核苷酸序列；而3’-剪接位点是包含或同源于GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG模体(例如，5’-GATATCCTGCAG-3’、5’-GGCTGCAG-3’及5’-CCACAG-3’)。此外，分支点序列是位于5’-与3’-剪接位点之间，该分支点序列包含或同源于5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)模体(例如，5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’)。该分支点序列的腺苷酸(A)通过细胞内2’-5’寡腺苷酸合成酶及剪接体在几乎所有的剪接体内含子中形成(2’-5’)-连接的套马索内含子核糖核酸的一部分。此外，多嘧啶串位于所述分支点与3’-剪接位点之间，其是与5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)与5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)同源的高含量的胸腺嘧啶(T)与胞嘧啶(C)的寡核苷酸序列。符号“m”与“n”是指大于或等于1的多重复序列；更优选地，m的数值是1-3，而n的数值是7-12。符号“-”是指无任何核苷酸。所有这些内含子的组成是通过一些接头核苷酸来连接的。根据37CFR1.822指南中对用于核苷酸和/或氨基酸序列资料的符号和格式的规定，符号W是指腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T))尿嘧啶(U)，符号K是指鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号S是指胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，符号Y是指胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号R是指腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)以及符号N是指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。对于所有上述剪接体辨识组成，脱氧胸苷(T)核苷酸/可由尿苷(U)取代。
为了确定剪接后的SpRNAi的插入片段的功能。许多寡核苷酸序列可以被克隆到重组SpRNAi-RGFP构建体的抗-(靶基因)内含子插入片段位点。这些抗-(靶基因)内含子插入片段位点包含数种限制酶切位和克隆位点，它们被以下限制酶识别：AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI内切酶以及它们的组合。这些内含子的寡核苷酸插入片段是DNA模板，此模板可供录成具有相当多的二级结构的转录分子，上述分子选自套马索型核糖核酸、短暂小分子核糖核酸(stRNA)、反义核糖核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)、双链核糖核酸(dsRNA)、小发夹核糖核酸(shRNA)、微核糖核酸(miRNA)、Piwi相互作用的核糖核酸(piRNA)、核酶及这些核糖核酸的前体或衍生物，它们可为正义或反义的构型或具有正义和反义的构型，以及上述核糖核酸的组合。
为了在感兴趣的细胞或有机体中方便地传送基因和活化，本发明的重组SpRNAi-RGFP构建体优选被掺入以下表达载体中，该表达载体可选自DNA转基因、质粒、转座子、跳跃基因、病毒载体及它们的组合。这样获得的载体通过以下高效的基因传递方法被导入细胞或有机体中，所述的基因传递方法选自化学/脂质体转染法、电穿孔法、转座子介导的DNA重组法、跳跃基因插入法、病毒感染法、微注射法、基因枪穿透法以及以上方法的组合。所述载体进一步至少包含病毒、Pol-Ⅱ或Pol-Ⅲ的启动子，或它们的组合以表达SpRNAi-RGFP构建体。再者，上述载体可包含科扎克(Kozak)共有(consensus)翻译起始位点以增加在真核细胞中的翻译效率、SpRNAi-RGFP构建体下游的多重SV40的多腺苷酸化作用信号以加工重组基因转录物的’端、pUC复制起始子以用于原核细胞中的增殖、至少两个限制酶切位点以用于SpRNAi-RGFP构建体掺入载体、选择性的SV40复制起始子以用于表达SV40 T抗原的哺乳细胞中的复制、及选择性SV40的早期启动子以用于在能复制的原核细胞中表达抗生素的抗性基因。抗生素抗药性基因的表达可用来筛选是否顺利转染或感染克隆的选择性标记。上述抗生素抗性基因可对抗选自以下的抗生素：青霉素G、氨苄青霉素、新霉素、巴龙霉素(paromycin)、卡那霉素、链霉素、红霉素、斯派克霉素(spectromycin)、磷霉素、四环素、利福平、两性霉素B、健他霉素(gentamycin)、氯霉素、头孢霉素、泰乐菌素(tylosin)以及它们的组合。
这样获得的SpRNAi-RGFP载体已经在(Tg(actin-GAL4：UAS-gfp))株的斑马鱼体内测试过，证实可抑制绿色萤光蛋白基因表达。如实施例3及6与图3C所示，脂质体转染在SpRNAi-RGFP质粒的抗绿色萤光蛋白(anti-EGFP)的前体微核糖核酸插入片段(第四泳道)显示出很显著的绿色萤光蛋白的基因沉默效应(大于80％的蛋白被敲低)，然而在由左到右的泳道所示的其它插入片段的实验组中并无任何沉默效应被检测到：1、空白载体对照组(Ctl组)；2、针对爱滋病病毒蛋白p-24(HIV-p24)的前体微核糖核酸(pre-miRNA)组(模拟组)。3、无发夹环结构的反义绿色萤光蛋白插入片段(anti)组以及5、与抗绿色萤光蛋白的前体微核糖核酸(anti-EGFP pre-miRNA)完全互补的反转前体微核糖核酸序列组(miR*组)。对于非靶基因，如标记红色萤光蛋白及管家肌动蛋白，并没有发现这种沉默效应，这表示这种内含子的微核糖核酸介导的核糖核酸干扰效应(RNAi))具有高度靶专一性。此外，如图3D所示，通过印迹法分析，我们观察到有效用的小的内含子的核糖核酸只从设计的SpRNAi-RGFP基因转录物生成和释放(中间第2列)，在不从不具有内含子的RGFP的天然转录物中(左边第1列)或缺乏功能性5’-剪接位点的缺陷SpRNAi-RGFP构建体中生成和释放。此时剪接的红色萤光蛋白的外显子可被连接起来形成成熟核糖核酸以进行合成具有功能的红色萤光蛋白。
有效的内含子的微核糖核酸(miRNA)设计的最佳化
先前实验建立内含子的微核糖核酸(miRNA)能提供一种在体内沉默靶基因表达的有效手段与方法。我们首先评估了内含子的微核糖核酸介导的基因沉默效应的效率并然后确定了能够诱导最佳基因沉默效果的的内含子的前体微核糖核酸插入片段的最佳结构设计。根据研究，我们得知在细胞内的核糖核酸沉默(RNAi)相关基因沉默效应机制(RISC)对于成熟的微核糖核酸的特定一股具有结构上的偏好。RISC为蛋白-核糖核酸复合体，此复合体经由RNAi机制或转录后基因沉默机制(PTGS)影响靶基因转录物的降解或靶基因转录物的翻译抑制。
在斑马鱼中，我们发现前体微核糖核酸的径环结构定了用于RISC组装的成熟微核糖核酸序列，所述RISC组装不同于公知的siRNA-相关的RISC组装(Lin et.al.(2005)Gene 356：32-38)。siRNA双链体的形成在siRNA-相关的RISC组装中扮演重要的角色。siRNA的两条链的功能并不相同，只有一条链会被优选组装到RISC复合体中。此偏好现象是由于siRNA双链体5’端的碱基对的热动力稳定性所决定。基于这种siRNA模式，miRNA及其互补的miRNA(又称miRNA*)双链体的形成被认为是miRNA-相关RISC组装的关键性的一步。假如此模式是正确的话，则在前体微核糖核酸的径环结构中应当观察不到任何功能偏好。然而，我们发现发现内含子pre-miRNA的径环结构参与了用于RISC组装的成熟miRNA的链的选择。
如实施例1与2所述，我们构建了表达anti-EGFP miRNA的SpRNAi-RGFP载体以及miRNA-径环-miRNA*[1]以及miRNA*-径环-miRNA[2]这两个不同的前体微核糖核酸，它们通过DNA合成器合成后，分别插入预先准备好的重组SpRNAi-RGFP载体中。这两组的前体微核糖核酸构建体包含相同的双链径环区域，该径环区域针对于EGFP基因第280到第302的核苷酸序列。因为SpRNAi-RGFP构建体的内含子插入片段在其5’端及3’端分别与PvuI及MluI限制酶切位点侧翼连接。初级插入片段能轻易地去除并被许多具有粘性末端的其它抗不同基因的插入片段(例如，anti-EGFP，mir-302前体微核糖核酸)取代。通过允许针对于不同基因转录物的SpRNAi的插入片段中的改变，此内含子的微核糖核酸表达系统能提供在体内的发育微核糖核酸遗传应用的重要工具。
为了确定设计的前体微核糖核酸结构上的偏好性，我们先通过mirVana微核糖核酸分离管过滤柱(Ambion，Austin，TX)分离斑马鱼小RNA后，再通过乳胶珠将与靶EGFP互补的所有具有潜力的微核糖核酸序列沉淀下来。一条全长微核糖核酸，miR-EGFP(280-302)，在5’-miRNA-径环-miRNA*-3’[2]构建体的转染中被证实具有活性，如图4A及图4B(灰色阴影序列)所示。因为此成熟微核糖核酸只有在转染5’-miRNA-径环-miRNA*-3’[2]的斑马鱼中被检测有效，因此推测miRNA-相关的RISC倾向于优选与5’-miRNA-径环-miRNA*-3’[2]构建体反应，而不是优选与[1]pre-miRNA构建体反应。如图4C所示，利用Tg(actin-GAL4：UAS-gfp)株斑马鱼进行实验以展现视觉上靶基因沉默与miRNA表达的关系，所述斑马鱼通过位于斑马鱼中几乎所有细胞中的通用的β肌动蛋白启动子驱动组成型表达绿色萤光蛋白(EGFP)。所述斑马鱼转染抗EGFP SpRNAi-RGFP基因载体并共表达红色萤光蛋白(RGFP)，该红色萤光蛋白可作为微核糖核酸在感染细胞中生成的阳性标记的指示剂。在用FuGene阳离子脂质体试剂(FuGene cationic liposomal reagent)(Roche，In)包封的SpRNAi-RGFP载体进入斑马鱼胚胎后，发现所有测试载体在转染24小时内完全进入斑马鱼中，提供了除了骨胳及鱼鳞部分以外其它所有系统的载体传递。
该红色萤光蛋白标记在所有被转染载体的斑马鱼中都能检测到，然而靶绿色萤光蛋白(EGFP)的沉默效应只在被转染5’-miRNA-径环-miRNA*-3’[2]的前体微核糖核酸的斑马鱼中被观察到。如图4D所示，蛋白质印迹分析法定量地确认基因沉默的结果，在[2]构建体所转染的斑马鱼有大于85％的基因被抑制。然而在肠道(GI)中的基因抑制效应低于其它组织中的，此现象可能与肠道中较高RNase活性有关。因为相同的5’端的热稳定性被施于EGFP pre-miRNA径环，因此推测此前体微核糖核酸的径环结构是与用于具有功能的RISC组装的熟微核糖核酸的链选择有关。而岱塞尔(Dicer)在径环结构的切割位点已知可决定成熟微核糖核酸的链选择，因而前体微核糖核酸的径环结构可能扮演确定辨识特殊切割位点的角色。因此基于不同天然微核糖核酸的天然径环结构的多样性，本发明使用一组改良的pre-mir-302环(如5’-GCTAAGCCAGGC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTAGC-3’(SEQ.ID.NO.2))这些环被测试提供了用于本发明的最佳的RISC装配效果。
SpRNAi-RGFP介导的Mir-302在人类原代表皮细胞(hpESC)、人类前列腺癌细胞PC3(PC3)与人类原发性黑色素瘤细胞Colo(Colo)细胞的转染作用
基于上述研究，我们设计和测试了具有人工连接的mir-302a-mir-302b-mir-302c-mir-302d的前体微核糖核酸子簇插入片段或重新设计的mir-302前体微核糖核酸插入片段(如发夹样序列，其包含5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.9))的最佳SpRNAi-RGFP构建体在hpESC、PC3及Colo细胞中转染沉默与发育及分化相关的基因。mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d的成熟序列分别为5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA-3’(SEQ.ID.NO.10)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3’(SEQ.ID.NO.11)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3’(SEQ.ID.NO.12)及5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.13)。这些mir-302的同源物的前十七个核苷酸具有高度保守的5’端区域(100％同源)，这十七个核苷酸与5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)的序列相同。在这些mir-302同源序列中，胸腺嘧啶(T)能用来取代尿嘧啶(U)。
在这些实验中，mir-302a-mir-302b-mir-302c-mir-302d的前体微核糖核酸簇被转染到hpESC及PC3细胞中，而重新设计的mir-302同源序列(SEQ.ID.NO.9)则被转染到Colo细胞中。在mir-302转染后，所有的细胞株的型态(下部图面))发生改变，从纺锤状或变形虫状改变成较圆的外型，显示这些细胞可能丧失细胞迁移的能力且其细胞复制速率很低，此时如同干细胞复制速率(图5A至图5C)。流式细胞仪(上部图面)分析的细胞DNA含量(Y轴)对应不同细胞周期(X轴)所显示有丝分裂的细胞数量减少超过67％，证实这些mir-302转染细胞的细胞增殖速率变慢，而上述细胞数量是由每一个细胞周期的DNA含量所决定。第一峰(左)与第二峰(右)分别显示为静止期G0/G1与有丝分裂M期的细胞数量与整体细胞数量的比值。在mir-302转染后，hpESC细胞中有丝分裂的细胞数量从36.1％降低至10.9％；PC3细胞中有丝分裂的细胞数量从38.4％降低至12.6％；Colo细胞中有丝分裂的细胞数量从36.5％降低至11.5％。然而，当转染空的SpRNAi-RGFP载体或含有mir-gfp前体微核糖核酸插入片段的载体时，细胞形态或细胞增殖皆无明显改变。上述mir-gfp前体微核糖核酸是设计为靶向萤火虫的绿色萤光蛋白基因的，该基因与人类或小鼠的基因序列并无任何同源。基于上述发现，mir-302同源物的基因转表达能将人类初胚细胞及癌化细胞转型为更类似胚胎干细胞的型态及复制速率的细胞，如同在先前报道的iPS细胞中所发现的改变(Okita et al.，(2007)Nature 448：313-317；Wernig et al.，(2007)Nature 448：318-324)。
胚样体形成、胚胎干细胞标记表达、基因组DNA去甲基化及具有转基因mir-302表达的Colo(Colo+mir-302)及PC3(PC3+mir-302)细胞中细胞迁移减低的评估
为了进一步证实mir-302转染的细胞的类胚胎干细胞性质，本发明评估了胚样体形成、胚胎干细胞标记基因表达、基因组去甲基化及细胞迁移的降低。mir-302转染的细胞有着很高的细胞培养汇合率(＞80％-90％)并倾向于形成胚样体的紧密的细胞群落，如同由原生人类胚胎干细胞所衍生的胚样体(如图6A)。然而，如果缺乏荷尔蒙或生长因子的适当导引，这些胚样体样的小体在再次培养时将相互分散并分化成类神经元原始细胞(如右下图)。为了证实胚胎干细胞及胚样体细胞的遗传特性，进一步评估这些胚胎干细胞的标记表达。如图6B所示，mir-302转染的Colo细胞(Colo+mir-302)显著表现出所有类的胚胎干细胞标准的标记，如Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4及Sox2等，然而在对照的Colo细胞中或转染空SpRNAi-RGFP载体的Colo细胞(colo+载体)中、转染表达mir-gfp微核糖核酸的载体的Colo细胞(Colo+mir-gfp)或转染表达天然mir-434-5p微核糖核酸的载体的Colo细胞(Colo+mir-434-5p)等细胞中没有检测到上述胚胎干细胞的标记。mir-434-5p的序列并不与mir-302s同源。因为Colo细胞是已分化的人类黑色素瘤细胞株，因此结果显示SpRNAi-RGFP介导的mir-302转染能使Colo细胞重新编程为类胚胎干细胞的状态，该状态与胚胎干细胞的状态相似。
Oct3/4(或称为Oct-3或Oct-4)是POU转录因子的一种，其主要在全能胚胎干细胞及生殖细胞中高度表达(Scholer et al.，(1989)EMBO J.8：2543-2550；Rosner et al.，(1990)Nature 345：686-692)。Oct3/4的严格表达对于维持干细胞自我更新及多潜能性是必需的。Oct3/4的下调导致胚胎干细胞分化进入不同的发育过程。SSEA蛋白包含SSEA-1、3及4，它们最初是由单株抗体所辨识，此单克隆抗体能辨识在初期着床阶段的鼠科胚胎细胞的表面及畸形癌细胞表面的乳系糖脂和球系糖脂，但不能辨识上述细胞分化后的衍生细胞(Solter et al.，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：5565-5569)。未分化的初期胚胎干(ES)细胞、人类胚胎癌细胞(hEC)及胚胎干细胞皆表达SSEA-3及SSEA-4，但不表达SSEA-1(Thomson et al.，(1998)Science 282：1145-1147)。在卵子生成过程中SSEA-3及SSEA-4被合成，并主要存在于卵子、受精卵及早期分裂的胚胎细胞的细胞膜表面(Shevinsky et al.，(1982)Cell 30：697-705)。Sox2在维持多潜能性上扮演核心转录分子的角色，但此功能并非专一于胚胎干细胞中(Boyer et al.，(2005)Cell 122：947-956)。因此，基于现有的对于胚胎干细胞标记的知识，经mir-302转染的Colo细胞具有这些胚胎干细胞标记的所有特性及相关功能。
此外，多潜能干细胞具有另一独特特征是表观遗传(epigenetic)修饰改变，尤其是基因组去甲基化(Hochedlinger et al.，(2006)Nature 441：1061-1067)。为了重新编程已经分化的体细胞为胚胎干细胞阶段，许多胚胎基因需要被重新激化以抑制与发育及分化相关信号或基因。DNA甲基化对于调控上述基因的表达或不表达扮演重要的角色。因为上游启动子区域的甲基化通常干扰众多对于基因表达所必需的转录机器的组装，去甲基化过程必须存在以重新活化胚胎基因，如Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4及Sox2。为了评估Colo+mir-302细胞及Colo细胞的甲基化程度，首先分离细胞的基因组(DNA分离试剂盒，Roche，IN)；并用切割位点为CCGG的限制酶HpaⅡ将分离的基因组消化，HpaⅡ对于CpG甲基化具有敏感性，并只切割没有甲基化的CCGG位点，但不能切割具有甲基化的CCGG位点。如图6C所示，对照Colo细胞的消化后的基因组片段远远大于类胚胎干细胞(Colo+mir-302)的，这暗示转染mir-302的Colo细胞中确实存在高程度的去甲基化。Colo细胞及Colo+mir-302细胞的基因组的原始尺寸大小几乎相同。
图6D进一步显示了与转染mir-302的hpESC、PC3及Colo细胞相比，对照的hpESC、PC3及Colo细胞中的Oct3/4基因启动子区域甲基化模式发生改变。为了证实这些区域的甲基化，本实验利用酸式亚硫酸盐(bisulfite)(CpGenome DNA modification kit，Chemicon，CA)处理分离的基因组DNA，酸式亚硫酸盐可将所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，然后利用两条正向引物5’-GTTGTTTTGT TTTGGTTTTG GATAT-3’及5’-ATTGTTTTGT TTTGGTTTTG GATTTA-3’以及一条反向引物5’-GTAGAAGTGC CTCTGCCTTC C-3’进行聚合酶链式反应(PCR))(厂模板PCR延伸试剂盒Roche，IN)分离Oct3/4的5’端上游启动子区域。细胞基因组(100ng)先与引物(共150pmole)及1xPCR缓冲液混合，加热至94℃至保持四分钟后立即放置冰上冷却。而后，进行25个PCR循环，其条件如下：92℃1分钟；55℃1分钟；以及70℃5分钟。而后，通过PCR纯化试剂盒(Qiagen，CA)收集PCR反应产物，此PCR产物用等量的切割ACGT序列的多重限制酶混合物消化(每一种酶各5单位(5U))，所述限制酶包含AclI(AACGTT)、BmgBI(CACGTC)、PmlI(CACGTG)、SnaBI(TACGTA)及HpyCH4IV(ACGT)。因为在此区域中无甲基化的ACGT位点被酸式亚硫酸盐转化为AUGT位点，而AUGT位点不能被上述限制酶混合物切割。如图6D所示，结果表明在对照的hpESC、PC3及Colo细胞中的至少四个甲基化的ACGT位点，在转染mir-302的hpESC、PC3及Colo细胞中被重新编程成去甲基化的ACGT处。Oct3/4基因启动子区域的mir-302介导的去甲基化还可能是导致mir-302转染细胞(如Colo+mir-302)中Oct3/4基因表达的再度活化的原因。
除此之外，细胞迁移的减少通常在mir-302所转染的癌化细胞(如PC3和Colo细胞系)中被观察到。假设胚胎干细胞倾向于停留于一处并原位形成胚样体，这可能可以解释为何PC3及Colo细胞在mir-302转染的后会丧失迁移能力。如图6E所示，当将PC3细胞置于PC3+mir-302细胞旁时，我们能清楚观察到癌化的PC3细胞沿着PC3+mir-302细胞的一侧快速迁移约30秒。黑色箭头指示PC3细胞移动的方向。此实验结果暗示mir-302转染在癌细胞中的潜在治疗应用，这不仅可以使癌细胞重新编程为有用的干细胞而且可降低癌细胞转移的机会。更有优势的是，因为mir-302转染的癌细胞仍然与病人的免疫系统兼容，这样获得的类胚胎干细胞的多潜能细胞能被用来移植治疗而无任何免疫排斥的风险。
利用miRNA微矩阵分析辨识转基因mir-302表达
为了确定在转染细胞中转mir-302基因的表达，我们进行了miRNA微矩阵分析。在约70％的汇合率，使用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)按照厂商建议从每株细胞系中分离小核糖核酸。所分离的小核糖核酸经纯化并定量后使用1％甲醛-琼脂糖凝胶电泳法及光谱仪分析(spectrophotometer measurement)(Bio-Rad，Hercules，CA)以及送至LC Sciences(San Diego，CA)以进行miRNA微矩阵分析。在Cy3及Cy5的强度图片中，当信号的强度由第1级增加至第65535级，其相对应的色彩由蓝转绿到黄至红。在Cy5/Cy3的图片比率来看，当Cy3的强度高于Cy5的强度时，颜色为绿色，当Cy3的强度与Cy5的强度相同时，颜色为黄色，以及当Cy5的强度较Cy3的强度高时，颜色为红色。如图7A所示，Cy3是指没经任何处理的细胞(如Colo)，而Cy5为转染mir-302的细胞(如Colo+mir-302)。在Cy5/Cy3的图片比率(最右)，在SpRNAi-RGFP介导的mir-302转染后，全部天然的mir-302家族成员(白圈)都高度表达。因为mir-302家族成员及重新设计的mir-302试剂有约91％的同源性，这显示重新设计的mir-302试剂能当成mir-302成员，并代替天然的mir-302的功能。图7B显示在Colo+mir-302细胞中不同的表达量的miRNA的条列。
基于如图7A所示的结果，我们也发现mir-302表达量的增加能增加天然mir-302s的表达以及一些其它微核糖核酸，例如mir-92、mir-93、mir-200c、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373、mir-374以及全部的mir-520家族成员。使用miR库::序列程序(miRBase::Sequence program)(http://microrna.sanger.ac.uk/)对它们的靶基因的分析表明mir-302s与这些miRNAs共同具有超过400种的靶基因，这暗示这些微核糖核酸可能对于维持干细胞的多潜能及再生性扮演重要的角色。这些保守的靶基因包括但不限于RAB/RAS相关的癌基因成员、ECT相关的癌基因、多形性腺瘤((pleiomorphic adenoma)基因、E2F转录因子、细胞周期蛋白D结合Myb样转录因子、HMG-框转录因子、Sp3转录因子、类CP2蛋白转录因子、NFkB活化蛋白基因、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、MAPK相关激酶、SNF相关激酶、肌球蛋白轻链激酶、TNF-α诱导蛋白基因、DAZ-相关蛋白基因、LIM相关同源异型盒(homeobox)基因、DEAD/H盒蛋白基因、叉头(forkhead box)蛋白基因、BMP调控子、Rho/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子、IGF受体、内皮素受体、左右决定因子(left-right determination factors)、细胞周期蛋白、p53诱导核蛋白基因、RB样1(RB-like1)、RB接合蛋白基因、Max接合蛋白基因、c-MIR细胞免疫辨识调节子(c-MIR cellular modulator of immune recognition)、Bcl2-样细胞凋亡促进子(Bcl2-like apoptosis facilitator)、原钙粘蛋白(protocadherins)、整合素β4/β8、抑制子、锚蛋白(ankyrins)、SENP1、NUFIP2、FGF9/19、SMAD2、CXCR4、EIF2C、PCAF、MECP2、组蛋白乙酰转移酶MYST3、细胞核蛋白RNP H3(nuclear RNP H3)以及许多核受体及因子。这些所有基因都与胚胎发育和/或癌化生成相关。
利用基因微矩阵分析辨识胚胎干细胞标志表达
在胚胎干细胞标计与转mir-302基因的共同表达相关性被证实后，我们利用基因微矩阵分析来筛选在细胞内转染mir-302前后以及在mir-302转染的细胞及其它人类胚胎干细胞之间的基因组范围内的基因表达谱的改变。Affymetrix基因芯片(GeneChip U133A&B arrays，Santa Clara，CA)被用来评估在Colo细胞和Colo+mir-302细胞之间以及Colo+mir-302细胞与其它人类胚胎干细胞(如HuEC8及H9)之间超过32668个人类基因表达模式的变化。每个测试细胞株的总核糖核酸使用RNeasy旋转柱(spin column)(Qiagen，Valencia，CA)分离。为了清楚地鉴定背景中不同的靶，我们使用相同Colo+mir302样本重复微矩阵测试并选出两百个基因，这些基因稍微存在在测试的一侧以便进一步比较。如图8A所示，在Colo+mir-302的重复两次的测试中，这些选择的基因(白点)的表达量的改变全都小于一倍，这表明这些背景值的噪声是相当小的。基于这些预先选择的基因的分散模式，其变化的阈值为一倍，我们能计算出两组比较基因转录文库的相关系数。给出的CC比率显示在比较的样品中32668个人类基因表达模式具有相似的比例。根据该CC比率，如图8A所示的结果证实Colo+mir-302细胞的基因表达模式与hES HuEC8及H9细胞之间具有88％及86％的高相似性，然而只有53％的低相关系数比率存在于Colo与Colo+mir-302细胞之间。这表明SpRNAi-RGFP介导的mir-302转染改变高达15354个细胞基因的表达模式，这些基因可能与癌化Colo细胞重新编程成类胚胎干细胞Colo+mir-302细胞相关。
在Colo与Colo+mir-302细胞之间一些主要表达不同的基因列表显示于图8B中。与H9及HuEC8细胞一样，Colo+mir-302细胞高水平表达许多胚胎干细胞及生殖细胞的细胞标计，如SSEA-3，SSEA-4，Utf1，Oct4，Sox2，Pulimio-2及Nanog)。然而，Klf4并不表达于Colo+mir-302细胞中，这显示与iPS细胞有些许不同(如图6B所示)。此外，在mir-302转染后，许多癌症特异性标计、发育信号及细胞增殖因子被显著地下调，这与观察到的未分化的圆形细胞的型态及如图5所示的较慢的细胞复制速度相一致。综上所述，这些发现表明使用新发明的mir-302转染的方法能遗传地重新编程和转化已分化的Colo细胞株成具有高度类胚胎干细胞Colo+mir-302细胞株，与多潜能的H9及HuEC8干细胞的那些相似。
利用各种荷尔蒙及生长因子导引细胞分化
就定义上来说，多潜能干细胞能分化成许多细胞型态，这些形态与从胚胎外胚层、中胚层及内胚层衍生的组织细胞相似。举例来说，在无饲养层细胞的条件下在体外使用荷尔蒙及生长因子进行处理，本发明已经可成功的导引Colo+mir-302细胞分化成三种不同细胞形态，如图9A到9C所示。首先，在无饲养层细胞的条件下，用天然的雄激素与双氢罩固酮(DHT 50ng/ml)处理Colo+mir-302细胞六小时后，移植上述细胞(约105个细胞)到六周大雌性免疫缺陷(immunocompromised)的SCID米黄色小鼠的子宫中，一周后在移植处生成精原细胞样细胞的孢囊(图9A中间)。其次，运用转化生长因子β1(TGF-β1 100ng/ml)处理Colo+mir-302细胞12小时后，移植处理后的细胞到六周大雌性免疫缺陷(immunocompromised)的SCID米黄色小鼠的子宫中，这些细胞分化成成纤维细胞样的细胞并开始分泌胶原蛋白，在一周内，这些细胞占据了子宫大部分的区域(图9B)。最后，用骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4(BMP4 100ng/ml))处理Colo+mir-302细胞12小时后，再用异种皮移植(xenograft)方式将处理后的细胞移植到六周大免疫缺陷的SCID米黄色小鼠的肝脏中，上述细胞会分化成类软骨细胞，其周围有些许钙化沉淀(图9C)。无胸腺小鼠(thymic nude mice)的使用提供了一种体内模仿移殖治疗的环境。这些发现提供了有力的证据，实验证实本发明的mir-302的转染方法可成功地产生新颖的类胚胎干细胞的细胞系，这些细胞株可在无饲养层细胞的体外环境中经导引生成不同组织细胞形态。因此，本发明不仅能够重新编程和转化已经分化的体细胞成为类胚胎干细胞的多潜能细胞，而且可在无饲养层细胞的培养环境下维持干细胞的多潜能及自我复制的特性。
因此，本发明通过利用内含子的mir-302表达载体提供一种新颖的有效的干细胞生成方法，具体来说，由原代体细胞及癌细胞所衍生的生成方法。因为内含子的微核糖核酸介导的基因沉默路径与许多细胞内的调控机制协调反应，这些机制包含基因转录成分、核糖核酸剪接(RNA splicing)、外来体消化及无义介导降解加工体系。在所有三种当前已知的RNAi路径中，内含子的微核糖核酸的基因沉默效应被认为最有效、最专一、最安全。基于全部的优势，本发明的内含子的mir-302试剂的使用提供一种简单、有效及安全的基因操纵方法，该方法不仅可将体细胞重新编程为类胚胎干细胞的多潜能细胞，也可在无饲养层细胞的培养条件下维持胚胎干细胞的多潜能特性，因此可避免在先前的iPS方法中所使用的通过令人厌烦的反转录病毒将四种巨大转录因子基因插入单一细胞。
A.定义
为了有助于理解本发明，一些术语定义如下：
核苷酸：是指去氧核糖核酸(DNA)或核糖核(RNA)单体单元，这些分子包含戊糖、磷酸根及含氮杂环碱基。此碱基通过糖苷键的碳(戊糖的1’碳)与糖部分联接，并且碱基与糖的组合形成核苷。含有至少一个磷酸根与所述戊糖的3’端与5’端的位置连接的核苷为核苷酸。
寡核苷酸：意指包含两个以上的DNA或RNA的分子，优选包括超过三个所述分子，而通常超过十个所述分子。而其精确的尺寸是取决于许多因素，这些又取决于所述寡核苷酸的最佳功能或用途。寡核苷酸可以通过包括化学合成、DNA复制、反转录及或它们的组合的多种方式形成。
核酸：意指核苷酸的聚合体，可为单链或双链。
核苷酸相似物：意指在结构与A、T、C、G或U不同，但其相似性足以在核苷酸分子中取代正常核苷酸的嘌呤或嘧啶核苷酸。
核酸组合物：意指多核苷酸，如DNA或RNA，其以单链或双链分子结构存在。
基因：意指其核苷酸序列编码RNA和/或多肽(蛋白质)的核酸。基因可为RNA或DNA。
碱基对(bp)：意指在双链DNA分子中A与T或C与G的配对。在RNA中，U取代T与A配对。一般来说配对是以氢键实现。
前体信使核糖核酸(pre-mRNA)：意指在真核细胞中通过Pol-Ⅱ型RNA聚合酶以称为转录的细胞机制所产生的基因的初级核糖核苷酸转录物。前体信使核糖核酸序列包含5’端非翻译区域(、3’端非翻译区域、外显子及内含子。
内含子：意指编码非蛋白阅读框的基因转录序列的一部分或多个部分，如框内(in-frame)内含子、5’端非翻译区域(5’-UTR)及3’端非翻译区域(3’-UTR)。
外显子：意指编码蛋白阅读框的基因转录序列的一部分或多个部分。
信使核糖核酸(mRNA)：意指经由核内剪接体机制除去内含子后所组成的前体信使核糖核酸的外显子，该外显子充当蛋白质编码RNA以用于蛋白质的合成。
互补去氧核糖核酸(cDNA)：意指与mRNA序列互补的单链DNA，此cDNA无任何内含子序列。
正义核酸(sense)：意指其序列顺序和组成与同源的mRNA相同的核酸分子。此正义核酸构型标示为“+”、“s”或“正义”。
反义核酸(antisense)：意指其序列顺序与各自的mRNA分子互补的核酸分子。此反义核酸构型标示为在DNA或RNA之前的“-”、“a”或“反义”，例如“aDNA″或“aRNA”。
5’端：意指在连续核苷酸的5’位置缺乏核苷酸的端点，其中一个核苷酸的5’羟基与相邻核苷酸的3’羟基通过磷酸二酯键连接。其它的基团，例如一个或多个磷酸根可能存在端点。
3’端：意指在连续核苷酸的3’位置缺乏核苷酸的端点，其中一个核苷酸的5’羟基与相邻核苷酸的3’羟基通过磷酸二酯键连接。其它的基团，通常为羟基可能存在端点。
模板：此意指能被核核酸聚合酶复制的核酸分子，根据不同的聚合酶，模板可为单链、双链、部分双链。合成的复制核酸与模版互补，或者与双链或者部分双链模版中的至少一链互补。RNA与DNA都从5’端到3’端的方向合成。核酸双链的两链通常排列成使两条链的5’端位于双链的相反两端(需要的话，使两条链的3’端位于双链的相反两端)。
核酸模板：意指双链DNA分子、双链RNA分子、杂交分子如DNA-RNA或RNA-DNA杂交双链、或单链DNA或单链RNA。
保守的：意指如果核苷酸序列与预先选定的序列的精确互补物不是随机杂交，则该核苷酸与预先选定(参照)的序列是保守的。
互补：意指以碱基配对的规律发生关系的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如序列“AGT”是互补于序列“TCA”或“TCU”。互补可以是DNA的两条链之间、DNA与RNA之间、RNA的两条链之间。互补能是部分互补或完全互补。部分互补是只有某些核苷酸碱基根据碱基配对规律能够配对；然而完全互补则是链中的核苷酸碱基全部能配对。而核酸链之间互补的程度显著影响两条链之间杂交的效率和强度。互补对于扩增反应以及取决于核酸之间结合的检测方法尤其重要。互补率是非配对的碱基数量与核酸中一条链的全部碱基数量的比率，因此50％的互补率就是一半的碱基非配对，一半的碱基配对。即使是碱基数量不同的双链也能配对。在此情况下，互补发生于较长的一链中的能够与较短的一链的碱基配对的碱基部分与较短的一链的碱基之间。
同源：意指多核苷酸序列与基因或mRNA的序列具有相似性。如，一核酸序列可能部分或完全与一特定基因或mRNA的序列同源。同源也可以表示相似核苷酸数量与全部核苷酸数量的比率。
互补碱基：意指当DNA或RNA形成双链构型时正常配对的核苷酸。
互补核苷酸序列：意指单链RNA或DNA的核苷酸序列与另一链的互补程度足以使两条链之间通过随后发生的氢键专一地杂交。
杂交：意指足以互补形成复合体的核苷酸序列通过碱基配对所形成双链体。而当引物(或剪接模板)与靶(模板)杂交时，这种复合物(杂交体)的稳定性足以行使DNA聚合酶引发DNA合成所需要的引物功能。在两条互补多核苷酸之间存在专一的(即非随机的)相互作用，这种作用可以被竞争性地抑制。
核糖核酸干扰(RNAi)：意指在真核细胞中可以被小RNA分子(例如，微核糖核酸(miRNA)及小于扰核糖核酸(siRNA))引发的转录后基因沉默机制。这些小RNA分子通常可当成基因沉默效应物，干扰与其完全或部分互补的细胞内基因的表达。
微核糖核酸(miRNA)：意指能与靶基因转录物结合的单链核糖核酸(RNA)，所述靶基因与所述miRNA部分互补。miRNA通常是长约17到27个核苷酸，并能经由miRNA与它的靶mRNA之间的互补直接降解细胞中的其靶mRNA或抑制其靶mRNA的蛋白质翻译。天然的miRNA能在几乎所有真核细胞中发现，它们防御病毒感染，并在动植物生长发育过程中调控基因的表达。
前体微核糖核酸(Pre-miRNA)：意指发夹样单链核糖核酸，此Pre-miRNA包含茎臂和径环结构区域以与细胞内RNaseⅢ内切酶相互作用而产生一个或多个miRNA，该miRNA能沉默一个或多个与其互补的靶基因。Pre-miRNA的径臂能形成完全或部分(不匹配)杂交双链体，此时径环结构与茎臂双链体的一个末端形成圆形或发夹环的结型。
小干扰核糖核酸(siRNA)：意指小双链核糖核酸，其长优选约18到25个碱基配对的核糖核苷酸双链体，其能将与其几乎完整互补的靶基因转录物降解。
小发夹核糖核酸(shRNA)：意指具有一对部分或完全匹配的径臂核苷酸序列的单链核糖核酸，所述径臂核苷酸序列被不匹配的环核苷酸分开形成发夹样结构。许多天然微核糖核酸(miRNA)是自发夹样RNA前体所衍生，此发夹样RNA前体又称为前体微核糖核酸(pre-miRNA)。
载体：意指能够移动并存在于不同遗传环境中的重组核酸分子，如重组DNA(如rDNA)。通常，另一个核酸分子被操作地连接在那。此载体在细胞中能自动复制，在这种情况下，所述载体和被连接的片段被复制。优选的一类载体为附加体(episome)，即能在染色体外自我复制的核酸分子。优选的载体是那些能自动复制和/或表达所携带的核酸的载体。在本文中，能够表达编码一种或多种多肽的基因的载体为成为表达载体。尤其重要的载体能够从由反转录酶形成mRNA克隆cDNA。
顺反子：意指在DNA分子中编码氨基酸残基序列并包括上游和下游DNA表达控制元件的核苷酸序列。
启动子：意指能被聚合酶辨认的(可能是结合)并能引发合成的核酸。本发明中启动子可为已知聚合酶的接合位点、增强子等、通过所需聚合酶能够引发合成的任何序列。
抗体：意指具有预先选定的保守结构域的多肽或蛋白分子，所述结构域编码能够结合预先选定的配体的受体。
B、组合物：
一种用于诱导内含子的核糖核酸介导的基因沉默的重组核糖核酸组合物，该组合物包含：
a)至少一个内含子，其中该内含子与多个外显子侧翼连接并能通过细胞内RNA剪接和/或加工机制从外显子切除；以及
b)多个外显子，其中该外显子能连接成具有所需功能的基因。
上述的重组核酸组合物，进一步包含
a)至少一个限制酶/克隆位点，其中该限制酶/克隆位点用于将所述重组核酸组合物掺入表达载体中，以在哺乳细胞中表达该重组核酸组合物的初级RNA转录物；以及
多个转录及翻译终止位点，其中该转录及翻译终止位点用于制造该重组核酸组合物的RNA转录物的正确尺寸。
上述重组核酸组合物的内含子进一步包含：
a)与至少一个靶基因互补或同源的基因沉默效应物的插入片段；
b)5’-供体剪接位点；
c)3’-受体剪接位点；
d)用于剪接体辨识的分支点模体域；
e)用于供剪接体相互作用的多嘧啶串；和
f)多个可供连接主要组件的接头。
基因沉默效应物的插入片段编码同源于5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)的核苷酸序列。该5’-供体剪接位点是含有或同源于5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或者GU(A/G)AGU模体(例如，5’-GTAAGAGGAT-3’、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)的核苷酸序列；3’-受体剪接位点是含有或同源于GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG模体(例如，5’-GATATCCTGCAG-3’、5’-GGCTGCAG-3’和5’-CCACAG-3’)的序列。此外，分支点序列是位于5’-与3’-剪接位点之间，含有同源于5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)模体(如，5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’)的模体。此外，多嘧啶串是位于分支点与3’-剪接位点之间，其核苷酸序列含有高含量的胸腺嘧啶与胞嘧啶并同源于5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)与5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)。其中，符号“m”与“n”是指大于或等于1的多重复序列；更优选地，m的数值为1-3，而n的数值为7-12。符号“-”是指无任何核苷酸。一些接头核苷酸序列能用来连接所有这些内含子成分。根据37CFR1.822指南中对用于核苷酸和/或氨基酸序列资料的符号和格式的规定，符号W是指腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号K是指鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号S是指胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，符号Y是指胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号R是指腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)以及符号N是指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。对于上述所有剪接体辨识成分中，脱氧胸苷(T)核苷酸是可用尿苷(U)来取代。
C、方法
一种用于在哺乳细胞中诱导内含子mir-302介导的基因沉默的转基因方法，其包含下列步骤：
a建构重组核酸组合物，该重组核酸组合物包含至少一个编码mir-302样基因沉默效应物的内含子，该内含子与外显子侧翼连接，其中该内含子能经切除后与该外显子分离以诱导mir-302介导的基因沉默效应；
b将该重组核酸组合物克隆到表达载体中；以及
c将该表达载体导入多个哺乳细胞中，其中该细胞产生多该重组核酸组合物的初级RNA转录物，其中该细胞将该内含子从从该初级RNA转录物中剪接出来，以对含有与mir-302类似基因沉默效应物同源或互补的序列的基因产生mir-302介导的基因沉默效应。
实施例
以下实施例用于说明本发明的一些优选的实施方式和方面，而不是用于限制本发明的范围。
在以下的实施例公开的内容中，使用以下缩写：M(摩尔的)；mM(毫摩尔)；μm(微摩尔)；mol(摩尔)；pmol(皮摩尔)；gm(克)；mg(豪克)；μg(微克)；ng(纳克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；℃(摄氏度)；cDNA(复制或互补的DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；ds DNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；PBS(磷酸盐缓冲液)；NaCl(氯化钠)；HEPES(N-2-羟乙基呱嗪-N-2-乙硫磺酸)；HBS(HEPES缓冲盐)；SDS(十二烷基磺酸钠)；Tri-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)；和ATCC(美国菌种保藏中心)。
实施例1建构包含SpRNAi的重组基因(SpRNAi-RGFP)
用于产生三种不同SpRNAi内含子的合成核酸序列，该序列包含正义、反义或发夹-EGFP插入片段，如下所示：N1-正义，5’-GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GA-3’(SEQ.ID.NO.14)；N1-反义，5’-CGCGTCTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGC GATCGGATCC TCTTAC-3’(SEQ.ID.NO.15)；N2-正义，5’-GTAAGAGGAT CCGATCGCTT GAAGAAGATG GTGCGCTCCT GA-3’(SEQ.ID.NO.16)；N2-反义，5’-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGC GATCGGATCC TCTTAC-3’(SEQ.ID.NO.17)；N3-正义，5’-GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GTTAACTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGA-3’(SEQ.ID.NO.18)；N3-反义，5’-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGT TAACTTGAAG AAGATGGTGC GCTCCTGCGA TCGGATCCTC TTAC-3’(SEQ.ID.NO.19)；N4-正义，5’-CGCGTTACTA ACTGGTACCT CTTCTTTTTT TTTTTGATAT CCTGCAG-3’(SEQ.ID.NO.20)；N4-反义，5’-GTCCTGCAGG ATATCAAAAA AAAAAGAAGA GGTACCAGTT AGTAA-3’(SEQ.ID.NO.21)。从SEQ.ID.NO.14到SEQ.ID.NO.21的所有序列在其5’端是磷酸化。此外，两外显子片段是经由通过DraII限制酶在红色萤光RGFP基因(SEQ.ID.NO.22)的第208个核苷酸处所切割产生，5’-片段进一步通过T4DNA聚合酶作用而生成平端。RGFP是指在紫点海葵(Heteractis crispa)(BD Biosciences，CA)的HcRed1色蛋白的第69位氨基酸(a.a.)处嵌入一额外的天冬氨酸产生的新颖的红移萤光色蛋白基因；具有较少聚集并在570nm波长处发射几乎两倍强度的远红外线萤光。本发明用XhoI及XbaI限制酶切割pHcRed1-N1/1质粒(BD Biosciences，CA)，然后用2％琼脂糖凝胶电泳和提取(gel extraction kit，Qiagen，CA)分别分离全长769碱基对(bp)的RGFP基因片段与3934bp的空质粒。
通过在以下条件下加热每一种正义与反义序列(1∶1)的互补混合物分别使N1-正义与N1-反义杂交、N2-正义与N2-反义杂交、N3-正义与N3-反义杂交及N4-正义与N4-反义杂交，所述条件为：94℃2分钟，然后在1xPCR缓冲液(如50mM Tris-HCl，pH 9.2，在25℃下，16mM(NH4)2SO4、1.75mM MgCl2)中于70℃加热10分钟。接着立刻通过分别逐渐冷却(一小时期间从50℃降到10℃)N1+N4、N2+N4、N3+N4(1∶1)的杂交混合物而实施N1、N2、N3杂交到N4的序列连接(sequential ligation)。之后加入T4DNA连接酶及相对应的1x链接缓冲液，混合物在12℃保持12小时，而获得SpRNAi内含子以插入DraII切割的RGFP外显子的切口处。在RGFP外显子片段被加入反应(1∶1∶1)后，T4DNA连接酶及缓冲液相应地调整以再一次进行连接反应(在12℃下反应12小时)。为了克隆正确大小尺寸的重组SpRNAi接入RGFP基因，10ng的连接的核苷酸序列通过PCR技术及一对RGFP特定引物进行扩增；所述引物为5’-CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA-3’(SEQ.ID.NO.23)与5’-TCTAGAAGTT GGCCTTCTCG GGCAGGT-3’(SEQ.ID.NO.24)；所述PCR条件为：在94℃1分钟、52℃1分钟、68℃2分钟，共进行30个循环。而后，利用2％琼脂糖凝胶分离出得到的PCR的产物，通过凝胶提取试剂盒(Gel Extraction kit)(Qiagen，CA)提取并纯化约900bp大小的核苷酸序列。此约900bp大小的SpRNAi-含有RGFP基因的组合物进一步用测序确认。优选地，在缺乏内含子插入片段的情况下，SpRNAi内含子的正义链的序列为5′-GTAAGTGGTC CGATCGTCGC GACGCGTCAT TACTAACTAT CAATATCTTA ATCCTGTCCC TTTTTTTTCC ACAGTAGGAC CTTCGTGCA-3′(SEQ.ID.NO.25)，而SpRNAi内含子的反义链的序列为5′-TGCACGAAGG TCCTACTGTG GAAAAAAAAG GGACAGGATT AAGATATTGA TAGTTAGTAA TGACGCGTCG CGACGATCGG ACCACTTAC-3′(SEQ.ID.NO.26)。
选择性地，按照上述方法，重组SpRNAi-RGFP转基因通过将SEQ.ID.NO.25及SEQ.ID.NO.26的SpRNAi杂交体插入DraII的限制酶切割的RGFP外显子的限制酶切位点制备。在测试重新设计的mir-302前体miRNA插入片段(编码SEQ.ID.NO.9)的试验中使用的SpRNAi-RGFP转基因建构体是由这种方式形成。
因为重组的SpRNAi-RGFP基因分别在5’端及3’端具有XhoI与XbaI限制酶切位点，因此其能轻易地克隆到对XhoI与XbaI克隆位点的具有粘性末端的载体中。此载体必须为能够表达的有机体或亚有机体(suborganism)，所述有机体或亚有机体选自DNA转基因、质粒、跳跃基因、转座子及病毒载体。此外，因为位于内含子的该插入片段分别在5’端及3’端与PvuI及MluI限制酶切位点侧翼连接，因此本发明能够除去所述内含子插入片段并利用对PvuI及MluI克隆位点具有粘性末端的另一种不同的插入片段取代。该插入序列优选为发夹样的基因沉默效应物，该基因沉默效应物含有与靶基因高度互补的序列，所述靶基因选自萤光蛋白(GFP)基因、萤光素酶基因、β半乳糖苷酶(lac-Z)基因、病毒基因、细菌基因、植物基因、动物及人类基因。这些沉默效应物插入片段与其靶基因序列的互补和/或同源率为约30％到100％的，对发夹shRNA插入片段更优选为35％到49％，对正义-RNA与反义-RNA插入片段更优选为90％到100％。
实施例2将包含SpRNAi的基因克降到表达载体中
因为重组的SpRNAi-RGFP基因分别于5’端及3’端具有XhoI与XbaI的限制酶切位点，因此它能够容易地克隆到对XhoI与XbaI的限制酶切位点具有相应粘性末端的载体中。本发明将SpRNAi-RGFP基因与线性化的3934bp的空的pHcRed-N1/1质粒以1∶16(w/w)混合，将混合物并从65℃降温到15℃超过50分钟，之后加入T4连接酶及其缓冲液，混合物在12℃保持12小时进行连接反应。所形成的SpRNAi-RGFP表达载体能利用E.coli DH5αLB培养基(含有50μg/ml卡那霉素(Sigma Chemical，St.Louis，Mo))进行大量复制增殖。并利用PCR技术及其RGFP特定引物(SEQ.ID.NO.23)及(SEQ.ID.NO.24)于94℃1分钟、68℃2分钟并进行30次循环反应，然后进一步进行测序以确认阳性克隆。为了克隆到病毒载体中，可以采用相同的连接程序，除了使用XhoI/XbaI-线性化的pLNCX2反转录病毒载体(BD)代替以外。因为在SpRNAi内中的插入片段分别在5’端及3’端与PvuI及MluI限制酶切位点连接，因此本发明能去除该插入片段并以重新设计的对PvuI及MluI克隆位点具有粘性末端的mir-302插入片段取代anti-EGFP shRNA插入片段；该重新设计的mir-302插入片段序列包含同源的5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)区域，相似于5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.9)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA-3’(SEQ.ID.NO.10)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3’(SEQ.ID.NO.11)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3’(SEQ.ID.NO.12)或5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.13)。
用来产生许多同SpRNAi内含子的合成核酸序列编码mir-302家族前体微核糖核酸丛簇或重新设计的mir-302插入片段，示例如下：mir-302a-正义，5’-GTCCGATCGT CCCACCACTT AAACGTGGAT GTACTTGCTT TGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGG ATCTCGAGCT C-3’(SEQ.ID.NO.39)；mir-302a-反义，5’-GAGCTCGAGA TCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT CTTTAGTTTC AAAGCAAGTA CATCCACGTT TAAGTGGTGG GACGATCGGA C-3’(SEQ.ID.NO.40)；mir-302b-正义，5’-ATCTCGAGCT CGCTCCCTTC AACTTTAACA TGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAA GTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTAG CGCTA-3’(SEQ.ID.NO.41)；mir-302b-反义，5’-TAGCGCTAGC GACTCCTACT AAAACATGGA AGCACTTACT TTCAAAGTCA CAGAAAGCAC TTCCATGTTA AAGTTGAAGG GAGCGAGCTC GAGAT-3’(SEQ.ID.NO.42)；mir-302c-正义，5’-CGCTAGCGCT ACCTTTGCTT TAACATGGAG GTACCTGCTG TGTGAAACAG AAGTAAGTCG TTCATGTTTC AGTGGAGGCG TCTAGACAT-3’(SEQ.ID.NO.43)；mir-302c-反义，5’-ATGTCTAGAC GCCTCCACTG AAACATGAAC GACTTACTTC TGTTTCACAC AGCAGGTACC TCCATGTTAA AGCAAAGGTA GCGCTAGCG-3’(SEQ.ID.NO.44)；mir-302d-正义，5’-CGTCTAGACA TAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCTAA GCCAGGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.45)；mir-302d-反义，5’-ATGACGCGTC GAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG-3’(SEQ.ID.NO.46)；和miR-302s-正义，5’-GTCCGATCGT CATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCTAA GCCAGGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.27)；mir-302s-反义，5’-ATGACGCGTC GATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCCTG GCTTAGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TGACGATCGG AC-3’(SEQ.ID.NO.28)。
Mir-302家族前体微核糖核酸簇的内含子插入片段可分别经通过杂交mir-302a-正义与mir-302a-反义、mir-302b-正义与mir-302b-反义、mir-302c-正义与mir-302c-反义及mir-302d-正义与mir-302d-反义而形成。接着，mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d的杂交体分别通过PvuI/XhoI，XhoI/NheI，NheI/XbaI及XbaI/MluI等限制酶消化，然后用35微升的高压灭菌的双蒸水(ddH2O)通过凝胶萃取过滤管柱(gel extraction filter column)(Qiagen，CA)收集。接着立刻，将所收集的杂交体通过T4DNA连接酶(Roche，20U)互相接合而形成mir-302家族微核糖核酸插入片段簇，并进一步用于插入到PvuI/MluI线性化的SpRNAi-RGFP表达载体。包含mir-302家族微核糖核酸插入片段簇的重组SpRNAi-RGFP基因被插入具有pVSV-G表面抗原的反转录病毒pLNCX2载体中，所述抗原可用于转基因感染hpESC与PC3细胞。为了形成人工重新设计的mir-302前体微核糖核酸插入片段，本发明杂合SEQ.ID.NO.27与SEQ.ID.NO.28两条合成序列，而后以PvuI/MluI等限制酶切开它们的杂交体，并以T4DNA连接酶(20U)将此杂交体插入并连接到PvuI/MluI线性化的表达SpRNAi-RGFP的pHcRed1载体中。包含所述重新设计的mir-302前体微核糖核酸的SpRNAi-RGFP基因直接用于Colo细胞的转基因DNA重组。成功转染的细胞24小时后通过流式细胞仪和抗RGFP的单克隆抗体Clontech，Palo Alto，CA)被分离并收集，以用于传代培养。
这样获得的mir-302前体微核糖核酸簇及mir-302表达载体可在E.coli DH5αLB培养基(含有50微克/毫升卡那霉素)进行pHcRed1-N1/1质粒载体的增殖或在E.coli DH5αLB培养基(100微克/毫升 氨苄青霉素)进行pLNCX2反转录载体的增殖。增殖的SpRNAi-RGFP表达载体按照厂商的建议通过微量制备(mini-prep)或大量制备质粒提取试剂盒(maxi-prep plasmid extraction kit)(Qiagen，CA)分离及纯化。对于pLNCX2载体而言，本发明还可利用包装细胞株(packaging cell line)GP2-293(Clontech，CA)以供制造具有感染性但却无复制能力的病毒。被感染的GP2-293细胞培养在37℃及5％的二氧化碳1x DMEM培养液中，该培养液添加有碳吸附的10％胎牛血清(FBS)、4mM L-谷氨酰氨、1mM丙酮酸钠、100微克/毫升 硫酸链酶素、50微克/毫升 新霉素(Sigma Chemical，MO)。经GP2-293细胞产生的病毒数量在转染的前测定至少为106cfu/ml。
实施例3体内转基因转染
为了将反转录病毒载体转染入hpESC及PC3细胞中，首先培养具有含抗-EGFP mir-gfp或mir-302家族簇前体微核糖核酸插入片段的SpRNAi-RGFP表达pLNCX2反转录表达载体的pVSV-G共同转染的GP2-293细胞(Clontech，CA)。在37℃、5％的二氧化碳中培养36个小时后，GP2-293细胞的培养液(每10毫升)通过过滤(0.25微米的孔径)并直接分别传送到hpESC及PC3细胞培养液中。因为该培养液中含有很高的设计的反转录病毒载体剂量，因此全部的测试细胞都被所述载体转基因感染，并在24小时内开始表达内含子的插入片段及RGFP。为了转基因传递重新设计的人造mir-302前体微核糖核酸进入Colo细胞中，本发明首先按照厂商的建议将预先准备好的SpRNAi-RGFP转基因(对于每种细胞培养采用10毫升培养基60微克(μg)转基因)，该转基因包含实施例2的预先设计的mir-302前体微核糖核酸插入片段与FuGene试剂(Roche，IN)混合。接着，混合物用于Colo细胞培养24小时。因为转基因也包含转座子样序列，其同源于人类基因组一些不编码的区域，因此阳性转基因转染的细胞通过流式细胞仪及抗RGFP的单克隆抗体(Clontech，CA)选择，以供传代培养。
实施例4RNA印迹分析
RNA(20μg总RNA或2μg聚[A+]RNA)通过1％甲醛-琼脂糖凝胶电泳分离后转移到尼龙膜上(Schleicher&Schuell，Keene，NH)。能互补于与RGFP的5’端外显子与先前设计的前体微核糖核酸插入片段侧翼连接的75bp连接序列(junction sequence)的合成探针采用Prime-ItⅡkit(Stratagene，La Jolla，CA)在[32P]-dATP(＞3000Ci/mM，Amersham International，Arlington Heights，IL)存在下通过随机引物延长标记，并使用10bp阈值(cutoff)的Micro Bio-Spin chromatography columns(Bio-Rad，Hercules，CA)进行纯化。杂交是通过混合50％新制备的去离子甲酰胺(pH 7.0)、5x Denhardt’s溶液、0.5％SDS、4x SSPE和250mg/mL变性鲑鱼精子DNA片段(18小时，42℃))而实施。膜在2x SSC、0.1％SDS(15分钟、25℃)中洗涤两次，然后以0.2x SSC、0.1％SDS(45分钟，37℃)洗涤一次后，进行放射自显影。
实施例5十二烷基磺酸钠聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹分析
为了靶蛋白进行免疫印迹，在除去生长培养液后，将分离的细胞用冰冷的(PBS)漂洗，然后按照厂商建议用添加了蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽、TLCK、TAME及PMSF的CelLytic-M裂解/萃取剂(Sigma，MO)处理。将细胞在室温中在振荡器上孵育15分钟，将细胞刮入微管中，用12000xg的转速离心5分钟将细胞碎片沉淀。将含有蛋白质的细胞裂解液收集并储存在-70℃以待使用。利用SOFmax软件包在E-max微孔板阅读器(microplate reader)(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测定蛋白量。每30μg的细胞裂解液被加入SDS-PAGE样品缓冲液，该缓冲液含有(还原的)或不含有(未还原的)50mM DTT)，并煮沸3分钟，再将样本注入8％聚丙酰胺凝胶，同时将2～3μl蛋白标计(Bio-Rad)注入参照泳道。而SDS-丙酰胺凝胶电泳是依据在分子克隆(Molecular Cloning，3rd ED)中描述的标准程序来实施。蛋白级份通过电印迹转移到硝酸纤维膜，并用Odyssey封闭剂(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NB)在室温作用1～2小时。然后利用一抗在4℃过夜评价蛋白质的表达，所述一抗分别为抗EGFP(1∶5,000；JL-8，BD)、RGFP(1∶10,000；BD)、Oct3/4(1∶500；Santa Crutz)、SSEA-3(1∶500；Santa Crutz)、SSEA-4(1∶500；Santa Crutz)、Sox2(1∶1000；Santa Crutz)或Klf4(1∶200；Santa Crutz))。接着用TBS-T漂洗蛋白带三次，然后在室温下暴露在二抗(结合Alexa Fluor680反应燃料的山羊抗小鼠IgG(1∶2,000；Molecular Probes))中1小时。再用TBS-T漂洗三次后用Li-Cor Odyssey Infrared Imager及Odyssey Softeare v.10(Li-Cor)进行扫描和纪录影像。
实施例6斑马鱼中内含子的核糖核酸介导的基因沉默
在转染过程中将Tg(actin-GAL4：UAS-gfp)株斑马鱼幼鱼养在含有10ml 0.2x无血清RPMI 1640培养液的容器中。通过将60μl FuGene脂质体转染试剂(Roche Biochemicals，Indianapolis，IN)逐渐地溶解到1ml的1x无血清RPMI 1640培养液中准备转染预混合物(pre-mix)。如实施例1与2所述，具有与不具有抗-EGFP前体微核糖核酸插入片段的SpRNAi-RGFP载体(20μg)与上述预混合物溶液混合并置于冰上，30分钟后直接导入容器中的斑马鱼幼鱼。所有三个剂量(共60μg)以12小时间隔给予，在第一次转染60小时后收集样本。
实施例7流式细胞仪分析
细胞经胰蛋白酶作用后、沉淀并通过1ml在PBS中的预冷的70％甲醇在-20℃重悬1小时固定。将细胞沉淀以并1ml PBS洗涤一次。将细胞再一次沉淀并以1ml在PBS中的1mg/ml的碘化丙啶及0.5mg/ml RNase在37℃重悬30分钟。约有15,000个细胞经BD FACSCalibur(San Jose，CA)分析。双联体细胞通过脉冲宽度对脉冲面积作图并对单细胞设定闸门口径而排除。收集的资料通过Flowjo软件包及Watson Pragmatic算法(algorithm)分析。
实施例八8去氧核糖核酸(DNA)甲基化试验
本发明首先使用DNA分离试剂盒(Roche，IN)分离细胞的基因组。基因组DNA样本可以通过将试验细胞孵育在55℃的10mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA和0.2mg/ml蛋白酶K溶液中3小时，接着用乙醇沉淀而制备。之后将分离的基因组分别在37℃用CCGG切位的限制酶HpaⅡ(10U)作用4小时。将得到的DNA片段通过1％的琼脂糖凝胶电泳所分离。为了确定Oct3/4启动子区域的甲基化位点，本发明进一步用酸式亚硫酸盐(CpGenome DNA修饰试剂盒，Chemicon，CA)处理分离的基因组DNA。接着通过PCR(长模板PCR延长试剂盒，Roche，IN)与两条正向引物5’-GAGGAGTTGA GGGTACTGTG-3’及5’-GAGGAGCTGA GGGCACTGTG-3’与一条相反引物5’-GTAGAAGTGC CTCTGCCTTC C-3’来分离Oct3/45’端上游启动子区域。细胞基因组(100ng)首先与引物(全部150pmole)混合于1x PCR缓冲液，并加热至94℃4分钟，然后立刻用冰冷却。之后进行25个循环的PCR反应，反应条件如下：92℃1分钟；55℃1分钟；以及70℃5分钟。得到的PCR产物通过PCR纯化试剂盒(Qiagen，CA)收集，并以等量的多重ACGT切位的限制酶(每一种5U)的混合物消化，限制酶混合物包含AclI(AACGTT)、BmgBI(CACGTC)、PmlI(CACGTG)、SnaBI(TACGTA)及HpyCH4IV(ACGT)。得到的DNA片段经由3％琼脂糖凝胶电泳分离获得的。
实施例9微核糖核酸微矩阵分析
人类PC3及Colo细胞株从美国菌种保藏中心(ATCC，Rockville，MD)获得，而hpESC细胞通过胰蛋白酶分离发明人的手臂皮肤外植体得到。在70％汇合率时，小核糖核酸使用mirVanaTM miRNA分离试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)按照厂商建议从每株细胞株中分离。小核糖核酸的纯度及品质经由1％甲醛琼脂糖凝胶电泳及光谱分析仪(Bio-Rad，Hercules，CA)来评估，之后送至LC Sciences(San Diego，CA)以进行微核糖核酸微矩阵分析。每一微矩阵芯片杂交标记Cy3或Cy5的单一样本或杂交标定标记的Cy3或Cy5的一对样本。消除背景并标准化(normalization)。对于双样本分析(dual sample assay)，计算p-值，获得差异表达超过3倍的转录物。
实施例10基因微矩阵分析
为了制备用于微矩阵杂交标记的探针，将提取出来的总核糖核酸(2μg)使用Superscript Choice system kit(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)及修饰后的寡(dT)24-T7启动子引物(如5′-GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGAGGCGG-(dT)24-3′(SEQ.ID.NO.50))按照厂商的方案转变成双链cDNA。将双链cDNAs用酚/氯仿提取纯化后，利用乙醇沉淀，用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH2O以浓度为0.5μg/μl重悬沉淀。Phase-Lock Gel(5′引物→3′引物，Inc.，Boulder，CO)用于所有有机体提取物以增加回收率。体外转录在以下条件中进行：T7核糖核酸聚合酶与1μg的cDNA、7.5mM未标记的ATP和GTP、5mM未标记的UTP和CTP及2mM生物素标记的CTP及UTP(生物素-11-CTP、生物素-16-UTP，Enzo Diagnostics)。在37℃反应4小时cRNA利用RNeasy旋转柱(Qiagen，CA)纯化。样品经1％的琼脂糖凝胶分离以检测尺寸大小，接着在40mM Tris-醋酸盐、pH 8.0、100mM KOAc/30mMMgOAc中将μg的cRNA加热到94℃35分钟而使其随机断裂成平均50个碱基的大小。
利用含有总计32668个基因的一组四个寡核苷酸的微矩阵(GeneChip U133A&Barrays，Affymetrix，Santa Clara，CA)进行杂交，杂交反应是于200μl的AFFY缓冲液(Affymetrix)于40℃中16小时连续搅动下完成。在杂交反应完成后，矩阵用200μl的6x SSPE-T缓冲液(1x 0.25M氯化钠/15mM磷酸钠、pH 7.6/1mM EDTA/0.005％Triton)洗涤3次，接着用200μl的6x SSPE-T缓冲液于50℃洗涤一小时。接着用0.5X SSPE-T洗涤矩阵两，并用0.5x SSPE-T于50℃冲洗15分钟。用2μg/ml链霉亲合素-藻红素(Molecular Probes)及1mg/ml乙酰化BSA(Sigma)于6x SSPE-T(pH 7.6)中进行染色，将矩阵用共聚焦扫描仪(Molecular Dynamics)在7.5μm处阅读并以Affymetrix Microarray Suite version 4.0软件进行分析。通过完全配对探针与非配对探针的总平均差将样本标准化。收集信号差异大于两倍的信号。
实施例11细胞分化测试
本发明所有的细胞株皆培养于无酚红的DMEM培养液(10％炭吸附的胎牛血清(10％(FBS))，在70％汇合率时，不同的荷尔蒙及生长因子被分别添加入细胞培养液中，如50ng/ml DHT、100ng/ml TGF-β1及/或100ng/ml BMP4。经过6到12个小时培养，经处理后的细胞在胰蛋白酶作用，以4等份的200μl 1x PBS溶液收集后，立刻植入6周大无胸腺免疫缺陷的SCID米黄色小鼠的颈部皮肤、尾部静脉、子宫及肝脏中。
实施例12统计分析
结果以平均值±SE表示。通过单因素方差分析(one-way ANOVA)进行数据统计分析。当具有统计上显着差异时，Dunnett’s post-hoc test被用来辨认与对照具有显著差异的组。为了在两组处理组之间进行配对比较，使用双侧配对t检验(two-tailed sudent t test)。为了比较超过两组的处理组，ANOVA分析后再post-hoc进行多范围检验(post-hoc multiple range test)。概率值p＜0.05被认定为具有统计上的意义，所有p值是藉由双侧检验确定。
参考文献
1.Thomson et al.，(1998)Science 282：1145-1147.
2.Takahashi and Yamanaka(2006)Cell 126：663-676.
3.Okita et al.，(2007)Nature 448：313-317.
4.Wernig et al.，(2007)Nature 448：318-324.
5.Yu et al.，(2007)Science 318：1917-1920.
6.Meissner et al.，(2006)Nature 439：212-215.
7.Hanna et al.，(2007)Science 318：1920-1923.
8.Suh et al.(2004)Dev.Biol.270：488-498.
9.Tang et al.(2007)Genes Dev.21：644-648.
10 Murchison et al.，(2007)Genes Dev.21：682-693.
11.Ghosh et al.(2000)RNA 6：1325-1334.
12.Lin et al.(2004)Novel RNAi therapy-Intron-derived microRNA drugs.Drug Design Reviews 1：247-255.
13.Lin et al.(2003)A novel RNA splicing-mediated gene silencing mechanism potential for genome evolution.Biochem Biophys Res Commun.310：754-760.
14.Lin et al.(2005)Asymmetry of intronic pre-microRNA structures in functional RISC assembly.Gene 356：32-38.
15.Lin et al.(2006a)Methods Mol Biol.342：295-312.
16.Lin et al.(2006b)Methods Mol Biol.342：321-334.
17.Lin et al.(2008)Frontiers in Bioscience 13：2216-2230.
18.Tang，G.(2005)Trends Biochem Sci.30：106-114.
19.Lee et al.(2003)Nature 425：415-419.
20.Lewin B.(2000)Genes，Seventh Edition，Oxford University press，pp688-690.
21.Scholer et al.，(1989)EMBO J.8：2543-2550.
22.Rosner et al.，(1990)Nature 345：686-692.
23.Solter et al.，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：5565-5569.
24.Shevinsky et al.，(1982)Cell 30：697-705.
25.Boyer et al.，(2005)Cell 122：947-956.
26.Hochedlinger et al.，(2006)Nature 441：1061-1067.
27.Stitzel et al.，(2007)Science 316：407-408.
28.O’Farrell et al.，(2004)Curr.Biol.14：R35-45.
29.U.S.Pat.No.5,843,780，6,200,806，7,029,913，and 7,220,584 to Thomson.
30.U.S.Pat.No.6,090,622，6,245,566，and 6,331,406 to Gearhart.
31.U.S.Pat.No.6,875,607 to Reubinoff.
应当理解的是本文中所述的实施例和实施方式仅仅用于说明的目的，对于它们的各种修饰和改变对于本领域的技术人员来说是显而易见的，它们属于本发明的宗旨并被包含在所附权利要求限定的范围。本文中所引用的所有出版物和专利文献以其全文的方式引入作为参考。
序列表
(1)一般信息：
(iii)序列数：28
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：12碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型(STRANDEDNESS)：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
GCTAAGCCAG GC 12
(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：12碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
GCCTGGCTTA GC 12
(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
UAAGUGCUUC CAUGUUU 17
(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
GTAAGAGK 8
(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：10碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
GWKSCYRCAG 10
(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
TACTWAY 7
(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
TYTYCTTTTT TTTTTTS 17
(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：19碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
TCTCTCTCTC TCTCNCTAG 19
(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU 23
(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定的：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA 23
(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定的：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG 23
(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定的：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG 23
(2)SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定的：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU 23
(2)SEQ ID NO：14的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：42碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GA 42
(2)SEQ ID NO：15的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：46碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
CGCGTCTTGAAGAAGATGGT GCGCTCCTGC GATCGGATCC TCTTAC 46
(2)SEQ ID NO：16的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：42碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
GTAAGAGGAT CCGATCGCTT GAAGAAGATG GTGCGCTCCT GA 42
(2)SEQ ID NO：17的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：46碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGCGATCGGATCC TCTTAC 46
(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：70碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GTTAACTTGA
AGAAGATGGT GCGCTCCTGA 70
(2)SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：74碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGT TAACTTGAAG AAGATGGTGC
GCTCCTGCGA TCGGATCCTC TTAC 74
(2)SEQ ID NO：20的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：47碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
CGCGTTACTAACTGGTACCT CTTCTTTTTT TTTTTGATAT CCTGCAG 47
(2)SEQ ID NO：21的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：45碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
GTCCTGCAGG ATATCAAAAAAAAAAGAAGA GGTACCAGTTAGTAA 45
(2)SEQ ID NO：22的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：689碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(A)描述：/desc＝“在紫点海葵(Heteractis crispa)的HcRed1色蛋白基因
的第69个氨基酸插入天冬氨酸(Asp)密码子的变异的红色荧光蛋白基因”
(iii)假定的：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
ATGGTGAGCG GCCTGCTGAA GGAGAGTATG CGCATCAAGA TGTACATGGA
GGGCACCGTG AACGGCCACT ACTTCAAGTG CGAGGGCGAG GGCGACGGCA
ACCCCTTCGC CGGCACCCAG AGCATGAGAA TCCACGTGAC CGAGGGCGCC
CCCCTGCCCT TCGCCTTCGA CATCCTGGCC CCCTGCTGCG AGTACGGCAG
CAGGACGACC TTCGTGCACC ACACCGCCGA GATCCCCGAC TTCTTCAAGC
AGAGCTTCCC CGAGGGCTTC ACCTGGGAGA GAACCACCAC CTACGAGGAC
GGCGGCATCC TGACCGCCCA CCAGGACACC AGCCTGGAGG GCAACTGCCT
GATCTACAAG GTGAAGGTGC ACGGCACCAA CTTCCCCGCC GACGGCCCCG
TGATGAAGAA CAAGAGCGGC GGCTGGGAGC CCAGCACCGA GGTGGTGTAC
CCCGAGAACG GCGTGCTGTG CGGCCGGAAC GTGATGGCCC TGAAGGTGGG
CGACCGGCAC CTGATCTGCC ACCACTACAC CAGCTACCGG AGCAAGAAGG
CCGTGCGCGC CCTGACCATG CCCGGCTTCC ACTTCACCGA CATCCGGCTC
CAGATGCTGC GGAAGAAGAA GGACGAGTAC TTCGAGCTGT ACGAGGCCAG
CGTGGCCCGG TACAGCGACC TGCCCGAGAA GGCCAACTG 689
(vi)有机体来源：珊瑚礁
(A)有机体：紫点海葵(Heteractis spp.)
(B)株：海葵(crispa）
(2)SEQ ID NO：23的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA 27
(2)SEQ ID NO：24的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
TCTAGAAGTT GGCCTTCTCG GGCAGGT 27
(2)SEQ ID NO：25的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：89碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
GTAAGTGGTC CGATCGTCGC GACGCGTCAT TACTAACTAT CAATATCTTA
ATCCTGTCCC TTTTTTTTCC ACAGTAGGAC CTTCGTGCA 89
(2)SEQ ID NO：26的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：89碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(iv)反义：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
TGCACGAAGG TCCTACTGTG GAAAAAAAAG GGACAGGATT AAGATATTGA
TAGTTAGTAATGACGCGTCG CGACGATCGG ACCACTTAC 89
(2)SEQ ID NO：27的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：82碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
GTCCGATCGT CATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCTAA GCCAGGCACA
CTAAAACATG GAAGCACTTA TCGACGCGTC AT 82
(2)SEQ ID NO：28的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：82碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝″合成的″
(iii)假定的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
ATGACGCGTC GATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCCTG GCTTAGCACA
CTAAAACATG GAAGCACTTAT GACGATCGG AC 82
权利要求书(按照条约第19条的修改)
0.无义介导降解加工以及它们的组合。
34.按照权利要求1所述的方法，其中该mir-302介导的基因沉默效应是由细胞内转录后基因沉默、翻译抑制、RNA干扰及/或无义介导降解机制导致的。
35.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞表达mir-302微核糖核酸。
36.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞表达胚胎干细胞标记Oct3/4、SSEA-3及SSEA-4。
37.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞培养于无饲养层细胞培养环境中。
38.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞培养于含有10％炭吸附胎牛血清的DMEM的培养环境中。
39.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞能分化为类生殖细胞。
40.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞能分化为类精原细胞。
41.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞能分化为类成纤维细胞。
42.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞能分化为类软骨细胞。
43.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞能分化为类胚样体细胞群。
44.按照权利要求1所述的方法，其中该mir-302-类似基因沉默效应物与mir-93、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373及mir-520家族成员享有一定同源性靶基因。
45.按照权利要求1所述的方法，其中该类干细胞的多潜能细胞通过使用mir-302微核糖核酸作为标记而选择性地分离。
46.一种用于诱导内含子的mir-302介导基因沉默的重组核酸组合物，该组合物包含：
至少一种编码mir-30-类似基因沉默效应物的内含子，该内含子与外显子侧翼连接，其中该内含子能经切除后与该外显子分离以诱导mir-302介导的使哺乳分化细胞重新编程为类胚胎干细胞的多潜能细胞的效应，该外显子能连接形成具有所需功能的基因。
47.按照权利要求46所述的重组核酸组合物，其中该内含子包含：
(a)编码mir-302-类似基因沉默效应物的内含子插入片段；
(b)供体剪接位点及受体剪接位点；
说明或声明(按照条约第19条的修改)
依据第19条的声明
新颖性(第33条第2款)及创造性(第33条第3款)
审查员在国际检索报告引用下列文件(ISR)：
D1：SUH MI-RA ET AL：”Human embryonic stem cells express a unique set of microRNAs”DEVELOPMENTAL BIOLOGY，ACADEMIC PRESS，NEW YORK，NY，US，vol，270，no.2，6 May 2004(2001-05-06)，pages 488-498，XP002404396ISSN：0012-1606
D2：MURCHISON ELIZABETH P ET AL：“Critical roles for Dicer in the female germline”GENES&DEVELOPMENT，vol.21，no.6，March 2007(2007-03)，pages 682-693，XP002502060 ISSN：0890-9369
D3：TANG FUCHOU ET AL：“Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development”GENES&DEVELOPMENT，vol.21，no.6，March 2007(2007-03)，pages 644-648，XP002502061 ISSN：0890-9369
D4：SUE ET AL：“Selective degradation of transcripts during meiotic maturation of mouse oocytes”DEVELOPMENTAL BIOLOGY，ACADEMIC PRESS，NEW YORK，NY，US，vol，302，no.1，17 January 2004(2007-01-17)，pages 104-117，XP005735604 ISSN：0012-1606
D5：LIN SHI-LUNG ET AL：“Gene silencing in vitro and in vivo using intronic microRNAs”METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY HUMANA PRESS INC，999 RIVERVIEW DR，STE 208，TOTOWA，NJ 07512-1165 USA SERIES：METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(ISSN 1064-3745(PRINT))，2006，pages 295-312，XP002502134 ISSN：1-58829-581-8(H)
审查员承认权利要求1-61项具有新颖性和权利要求1-45项具有创造性。然而，审查员认为权利要求46-61与D1至D5相比不具有创造性。
申请人尊敬地呈送修改权利要求第46项，并使修改后的权利要求第46项克服了D1至D5中的教导因而具有创造性。如同于国际检索报告中的书面意见的第二页中，本发明的必要特征在于使成人细胞重新编程为类胚胎干细胞的多潜能细胞。然而，原权利要求46-61并无此特征。因此，申请人递交了修改的权利要求第46，并指明所述组合物使“哺乳细胞重新编程为类胚胎干细胞的多潜能细胞”。因为在D1至D5既没有公开上述特征，也没有中暗示该特征，因此权利要求46和其从属权利要求47-61具有创造性。
工业实用性(第33条第4款)
审查员指出全部的权利要求皆有产业上的可实施目的。
尊敬地请求重新考虑上述权利要求缺乏新颖性或创造性的结论。
机译： 双融合人类胚胎干细胞，制备双融合人类胚胎干细胞的方法，三融合人类胚胎干细胞，制备三融合人类胚胎干细胞的方法以及监测双细胞的方法三重融合人胚胎干细胞
机译： 人类胎盘基质细胞的发育促进人类胚胎干细胞的增殖，人类胚胎干细胞向胚胎体的分化以及人类胚胎干细胞和胚胎干细胞向血细胞的分化
机译： 包含低浓度适用于人类胚胎干细胞的葡萄糖的培养基成分，使用其将人类胚胎干细胞分化为胰岛素生产细胞或细胞群的方法，以及根据细胞或杯子制造胰岛素的细胞
