具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物

摘要

本发明涉及具有基础时效特征的新型胰岛素类似物，其特征在于添加和/或取代带负电荷和带正电荷的氨基酸残基，酰胺化B链的C末端羧基和胰岛素A链的位置8为组氨酸。本发明还涉及其生产和用途。

说明书

本发明涉及具有基础时效特征的新型胰岛素类似物、其制备及用途。

糖尿病发病率近些年逐年增高，几近流行的程度。该病能严重缩短预期寿命。糖尿病患者必须频繁补充外源胰岛素。优化胰岛素治疗是合情理的。现在可获得具有特定药理性质的不同胰岛素。实际上，根据作用持续时间，不同胰岛素可区分为短效胰岛素、速效胰岛素、长效胰岛素和混合型胰岛素。长效胰岛素也称为慢效胰岛素(slow insulin)、贮库型胰岛素(depot insulin)或基础胰岛素(basal insulin)。在许多这些胰岛素产品中的活性成分是所谓的胰岛素类似物，其通过取代、删除和/或添加一个或更多个氨基酸而从人胰岛素制得。术语“胰岛素类似物”和“胰岛素”在此处具有相同的意思。

强化的胰岛素治疗策略试图通过针对稳定控制血糖水平而降低健康风险，该稳定控制血糖水平通过早期施予基础胰岛素而实现。现有的一个基础胰岛素例子是药物(活性成分：甘精胰岛素＝Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人胰岛素)。开发新型的改良型基础胰岛素的一般目标是将低血糖事件降至最低。关于这一点，理想的基础胰岛素是在每一位患者中可靠地作用至少24小时的胰岛素。理想的胰岛素效力应延迟开始且时效特征应尽可能平缓，以使短暂的低血糖症风险明显降到最低并甚至可在未提前进食的情况下施予胰岛素。当胰岛素效力以相同水平持续尽可能长时间时基础胰岛素供应良好，即身体得到了恒定量的胰岛素供应。因此低血糖事件风险得以降低并将患者特异的差异和日期特异的差异降至最低。因此，理想基础胰岛素的药物动力学谱的特征是作用延迟开始且作用延迟，即作用长效且均一。

然而，尽管已经获得了治疗上的优点，截至目前公开的慢效胰岛素均未显示出理想基础胰岛素的药物动力学性质。目标胰岛素的时效特征应尽量平缓且长效，以使患者的低血糖事件风险和日期依赖的差异风险进一步降低并使作用时间进一步延长，以便在某些环境下不必再每日施予胰岛素。这可简化糖尿病患者的治疗，特别是均不再能自己注射胰岛素的老年糖尿病患者和需要照料的糖尿病患者，因此也将具有重大的经济利益。此外，这样的基础胰岛素也有利于早期II型糖尿病。临床医师报道，许多人对注射存在恐惧感从而不能及时开始进行胰岛素治疗。结果不能很好的控制血糖，导致后期的胰岛素后遗症。基础胰岛素减少了注射给与的胰岛素剂量数，使胰岛素治疗更为患者所接受。

Kohn等(peptides 28(2007)935-948)描述了如何能通过制备胰岛素类似物优化胰岛素药效动力学的做法，与人胰岛素的等电点(pI＝5.6)相比，通过在B链末端或A链和B链的N末端添加赖氨酸或精氨酸，所述胰岛素类似物的等电点向碱性方向移动，因此降低了在生理条件下的溶解度并使时效特征得以延长。关于这一点，Kohn等人文中的化合物18(Arg(A0)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人胰岛素(实验测定的pI＝7.3；计算的pI＝7.58)被描述为上下文中理想的最佳化合物。因此，Kohn等把设计新型胰岛素类似物的主要目标理解为将带正电荷的氨基酸添加到人胰岛素的氨基酸序列，以将等电点从pI＝5.6增加到中性范围。

然而，现在惊奇地发现，用胰岛素类似物获得了所描述的目标基础时效特征，所述胰岛素类似物的特征为：

·B链末端由如赖氨酰胺或精氨酰胺(argininamide)的酰胺化碱性氨基酸残基组成，即，在B链末端的酰胺化碱性氨基酸残基上，末端氨基酸的羧基以其酰胺化形式存在，及

·A8氨基酸位置被组氨酸残基所占据，及

·A21氨基酸位置被甘氨酸残基、丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基所占据，及

·包含A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3和B4的组中不超过一个的氨基酸残基对应于Asp或Glu。

令人惊奇地，恰好是该所述的胰岛素类似物具有接近理想的目标时效特征优点，即延迟的平缓作用开始和更长的作用持续时间。因此，低血糖事件风险被明显降低。该延迟是如此显著以至于可以令人惊奇地在大鼠实验模型中检测到该效力。如图2中所示，作为对比，不能在大鼠中明确地观察到甘精胰岛素的延迟作用。图1显示了本发明的化合物YKL202和YKL203的低血糖作用。大鼠实验中获得的结果在犬类实验中得到了确认。再一次观察到该化合物的作用持续时间明显长于甘精胰岛素的作用持续时间。因此，提供了可以以明显低的频率施予的新型基础胰岛素。除了这些所述的药物动力学优点，与甘精胰岛素相比，本发明的胰岛素类似物具有更好的药理学性质。此外，请求保护的胰岛素也具有理化优点。

现在惊奇地发现，通式I的胰岛素类似物具有目标药理学特征，即作用延迟开始、效力更持久且均一：

其中

A-1对应于Lys、Arg或氨基；

A0对应于Lys、Arg或化学键；

A1对应于Arg或Gly；

A5对应于Asp、Glu或Gln；

A15对应于Asp、Glu或Gln；

A18对应于Asp、Glu或Asn；

A21对应于Ala、Ser、Thr或Gly；

B-1对应于Asp、Glu或氨基；

B0对应于Asp、Glu或化学键；

B1对应于Asp、Glu、Phe或化学键；

B3对应于Asp、Glu或Asn；

B4对应于Asp、Glu或Gln；

B29对应于Arg、Lys或选自包含Phe、Ala、Thr、Ser、Val、Leu、Glu或Asp的组的氨基酸，或化学键；

B30对应于Thr或化学键；

B31对应于Arg、Lys或化学键；

B32对应于Arg-酰胺或Lys-酰胺。

其中，包含A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3和B4的组中不超过一种的氨基酸残基对应于Asp或Glu。因此，本发明涉及这些胰岛素类似物。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物，其中包含A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3和B4的组的一种氨基酸残基对应于Asp或Glu。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物，其中，优选地，A-1对应于Arg，A0对应于Arg、A5对应于Glu、A15对应于Glu、A18对应于Asp、A8对应于His、A21对应于Gly、B0对应于Glu、B3对应于Asp、B4对应于Glu、B30对应于Arg或B30对应于Lys。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物选自：

Arg(A-1)，Arg(A0)，Glu(A5)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，Glu(A5)，His(A8)，Gly(A21)，Lys(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，Glu(A15)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，Glu(A15)，His(A8)，Gly(A21)，Lys(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，Asp(A18)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，Asp(A18)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B0)，Arg(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B0)，Lys(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Asp(B3)，Arg(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Asp(B3)，Lys(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B4)，Arg(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B4)，Lys(B30)-NH₂人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Lys(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，Glu(A5)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，Glu(A5)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Lys(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，Asp(A18)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，Asp(A18)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Lys(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，Glu(A15)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，Glu(A15)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Lys(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Asp(B3)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Asp(B3)，Arg(B31)，Lys(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B4)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B4)，Arg(B31)，Lys(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B0)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B0)，Arg(B31)，Lys(B32)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Lys(B30)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Lys(B30)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，Arg(A1)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂-人胰岛素，

Arg(A0)，Arg(A1)，His(A8)，Gly(A21)，Lys(B30)-NH₂-人胰岛素，

His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH₂-人胰岛素。

在提及的胰岛素类似物命名中说明的术语“人胰岛素”指人胰岛素A链和B链的氨基酸序列，在给定名称的胰岛素类似物中指明人胰岛素的所有衍生物(添加、取代、删除)。

本发明进一步涉及制备如上所述的胰岛素类似物的方法，其中重组制备胰岛素类似物前体，该前体酶法加工为双链胰岛素，在存在具有胰蛋白酶活性的酶的情况下与精氨酰胺偶联，分离胰岛素类似物。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物在制备用于治疗糖尿病，特别是I型或II型糖尿病的药物中的用途。

本发明进一步涉及包含如上所述的胰岛素类似物和/或其生理上可接受的盐的药物。

本发明进一步涉及包含如上所述的胰岛素类似物的药物，其用于治疗软骨再生。

本发明进一步涉及包含如上所述的胰岛素类似物的药物，其治疗性用于协助β细胞再生。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是包含溶解的胰岛素类似物的水性溶液形式。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是粉末形式，特别是结晶形式和/或非结晶形式。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是悬浮液形式。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂额外包含化学伴侣分子。

本发明进一步涉及编码如上所述的胰岛素类似物前体的DNA。

本发明进一步涉及编码如上所述的胰岛素类似物A链的DNA。

本发明进一步涉及编码如上所述的胰岛素类似物B链的DNA。

本发明进一步涉及包含如上所述的DNA的载体。

本发明进一步涉及包含如上所述的DNA或如上所述的载体的宿主生物。

本发明进一步涉及前胰岛素原类似物，其中C肽在其N末端带有精氨酸残基，其C末端特征为Arg Arg、Arg Lys或Lys Arg Arg。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其额外包含胰高血糖素样肽1(GLP1)或其类似物或衍生物，或胰高血糖素样肽的抑制剂-3或4或其类似物或衍生物，优选胰高血糖素样肽的抑制剂-4。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其中胰高血糖素样肽的抑制剂-4的类似物选自：

H-desPro³⁶-胰高血糖素样肽的抑制剂-4-Lys₆-NH₂，

H-des(Pro^36，37)-胰高血糖素样肽的抑制剂-4-Lys₄-NH₂或

H-des(Pro^36，37)-胰高血糖素样肽的抑制剂-4-Lys₅-NH₂，

或其药学上可耐受的盐。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其中胰高血糖素样肽的抑制剂-4的类似物选自：

desPro³⁶[Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)，

desPro³⁶[IsoAsp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)，

desPro³⁶[Met(O)¹⁴，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)，

desPro³⁶[Met(O)¹⁴，IsoAsp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)，

desPro³⁶[Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-2(1-39)，

desPro³⁶[Trp(O₂)²⁵，IsoAsp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-2(1-39)，

desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)或

desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O₂)²⁵，IsoAsp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)，

或其药学上可耐受的盐。

本发明进一步涉及如前面段落中所述制剂，其中肽-Lys₆-NH₂被连到胰高血糖素样肽的抑制剂-4类似物的C末端。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其中胰高血糖素样肽的抑制剂-4类似物选自：

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-Lys₆-NH₂des Asp²⁸Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

H-Asn-(Glu)₅des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-Lys₆-NH₂，

H-des Asp²⁸Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Met(O)¹⁴，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-Lys₆-NH₂，

des Met(O)¹⁴ Asp²⁸Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-Lys₆-NH₂，

H-Asn-(Glu)₅des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Met(O)¹⁴，Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-Lys₆-NH₂，

des Asp²⁸Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Trp(O₂)²⁵]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH₂，

des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-(Lys)₆-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴，Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂

或其药学上可耐受的盐。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其额外包含Arg³⁴，Lys²⁶(N^ε(γ谷氨酰基(N^α-十六酰基)))GLP-1(7-37)[利拉糖肽]或其药学上可耐受的盐。

关于这一点本领域技术人员清楚，本发明的胰岛素可以是施予后具有有益效应的药物制剂产品。就这一点而言，水性溶液是起点。相应地，其他组分必须是易混的。将病毒性动物污染风险降至最低，因为该制品不应含有任何动物源组分。进一步有利的是加入防腐剂以阻止微生物污染。可通过加入等张剂消除该制剂对施予位点组织细胞生理的可能的不良影响。加入鱼精蛋白可具有稳定效应，所以可通过向制剂中加入鱼精蛋白获得基本不含盐的胰岛素制品。加入酚组分可稳定使用的胰岛素类似物的结构，因此额外带来除其它之外的对作用开始的延迟作用。也可向制剂中加入稳定本发明的慢效胰岛素空间结构的物质并使热稳定性更高。这样的化学分子伴侣可例如是短的合成肽，其也可包含氨基酸类似物或包括例如胰岛素C肽来源的肽序列。

可将本发明的胰岛素装入纳米颗粒以开发贮库型胰岛素。也可能是所谓的缓释制剂，其中本发明的慢效胰岛素可逆地结合到多聚体载体。

本发明的胰岛素可与下述药物平行施予：速效胰岛素如诺或在研的胰岛素衍生物或具有适当时效特征的制剂或吸入型胰岛素，或在研的经鼻或经口给药的胰岛素。本领域技术人员清楚，在这一点上也可将进行适当配制的速效胰岛素和本发明的慢效胰岛素的混合物用于该目的。本发明的胰岛素类似物能进一步用于药物制品中，所述制品包含具有可与GLP-1(胰高血糖素样肽1)或胰高血糖素样肽的抑制剂-4或胰高血糖素样肽的抑制剂-3相比的活性的肽。这样的肽的例子是GLP-1(7-37)、依泽那太(exenatide)()或在专利申请WO 2006/058620、WO 2001/04156、WO 2004/005342和WO 98/08871中公开了制备方法的肽。在这一点上特别有利的制剂是那些包含这些肽的贮库型剂型的制剂。在II型糖尿病初发期特别有利的治疗类型是那些提供平行施予本发明的药物的类型，其增加了胰岛素效力，如二甲双胍。如与增加胰腺胰岛素分泌的磺脲类药物的联用一样，也可能采用与增加肠降血糖素水平的二肽基肽酶-4抑制剂的联合治疗。当通过施予分化因子启动来源于适当干细胞的β细胞再生时，使用本发明的慢效胰岛素特别有利。通过治疗糖尿病的例子提及了所有这些应用，本发明同样涉及这些应用。因此，本发明进一步涉及本发明的胰岛素与其他活性成分联合用于治疗糖尿病，特别是I型或II型糖尿病的用途。

本发明也进一步涉及本发明的胰岛素在涉及骨骼例如软骨再生的再生过程中的用途。该用途中的重点在于控制利用胰岛素的促有丝分裂潜能，同时没有诱发强代谢反应。

本发明进一步涉及包含本发明的类似物的药物，其特别表现为水性溶液制剂或粉末。

该药物是优选用于注射目的的溶液或悬浮液的药物制品；其特征在于包含至少一种本发明的胰岛素类似物，和/或至少一种其生理上可耐受的盐，该胰岛素类似物和/或盐为溶解、非结晶和/或结晶形式，优选溶解形式。

该制品的pH优选介于约2.5至8.5，特别是介于4.0至8.5，包含合适的张度剂、合适的防腐剂，及，在适当的情况下，合适的灭菌缓冲水溶液，也优选特定锌离子浓度的灭菌缓冲水溶液。除了活性成分外的其他全部制品成分构成了制品的载体。合适的张度剂的例子如甘油、葡萄糖、甘露醇、NaCl、钙化合物或镁化合物如CaCl₂等。张度剂和/或防腐剂的选择可影响本发明胰岛素或其生理上可耐受的盐在弱酸性pH值条件下的溶解度。

合适防腐剂的例子是酚、间-甲酚、苯甲醇和/或对-羟基苯甲酸酯。

能特别用于调节pH使之介于约4.0～8.5的缓冲物质的例子是醋酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠等。此外，生理上可接受的稀酸(一般为HCl)或稀碱(一般为NaOH)也适于调节pH。

如果制品含有锌，优选1μg/ml～2mg/ml，特别是1μg/ml～200μg锌/ml的浓度。令人惊奇的是，加入锌可令人满意地影响本发明胰岛素类似物的作用特征。这允许生产总作用持续时间、作用开始速度和效力曲线特征不同的制品，因此能个体化稳定患者。

为了改变本发明制品的活性成分特征，也可混合未修饰的胰岛素，优选牛胰岛素、猪胰岛素或人胰岛素，特别是人胰岛素，或其胰岛素类似物和衍生物。同样可能混合一种或更多种胰高血糖素样肽的抑制剂-4衍生物或肽，其特征在于其活性可与GLP-1(胰高血糖素样肽1)相比。本发明同样涉及这样的药物(制品)。

优选的活性成分浓度为约1-1500，更优选约5-1000，特别是约40-400国际单位/ml的那些。

本发明的胰岛素类似物利用生物技术最初制备为尚未包括酰胺的前体。技术人员熟知大量制备胰岛素的技术。用于此目的的宿主细胞系统是通过发酵用于培养的细菌、酵母和更高等的植物或植物细胞。假如费用方面的考虑允许，也可使用以动物细胞作为宿主系统的表达系统。然而，其先决条件是确保不含动物病毒。因此，清楚的是，利用范例描述的表达系统仅代表了开发用于重组制备蛋白质的宿主/载体系统的一小部分。例如，基于酵母或植物系统的生物技术未在本申请中描述，所述酵母或植物系统如藓类、藻类或更高等植物如烟草、豌豆、红花、大麦、玉米或油菜(oilseed rape)。然而，本发明同样包括允许在合适的生物技术表达系统中制备目标肽的宿主/载体系统和编码DNA序列。因此，宿主生物可具体选自植物界，选自包含裂殖菌纲、细菌或蓝藻的第一门裂殖植物门的生物，第二门藻类植物V纲绿藻纲的生物，第二门藻类植物VII纲红藻纲的生物，第三门真菌植物门的生物，第五门苔藓植物门的生物和第七门种子植物门的生物。

欧洲专利申请EP-A 1 222 207公开了编码包括修饰的C肽的前胰岛素原的质粒pINT358d。现在可借助聚合酶链式反应(PCR)特定地修饰编码胰岛素原的序列，从而能表达可作为本发明胰岛素前体的前胰岛素原。相应的融合蛋白不必在细胞内制备。技术人员清楚，也可利用随后分泌至周质和/或培养基上清的细菌表达系统制备这样的蛋白质。欧洲专利申请EP-A 1 364 029利用实施例公开了这一点。本发明同样涉及可产生本发明的类似物的胰岛素原前体。

原则上，可将如此制备的胰岛素原转变成胰岛素类似物前体，其在位置A0包括赖氨酸或精氨酸并在B链C末端携带赖氨酸或精氨酸。另外可能的是，如果尚未存在赖氨酸或精氨酸，可利用半合成的方法将带正电荷的氨基酸加到A链的N末端。

假如本发明的胰岛素原在细菌胞内表达后为包涵体或可溶形式，在进行加工和生化修饰前必须利用体外折叠技术将这些前体折叠为正确构象。在这一点上，公开的融合蛋白在用尿素或盐酸胍变性后可直接折叠，本发明同样涉及折叠中间体。

使用生化方法浓缩单个中间体，尤其是采用了已出版的及事实上为教科书主题的原理的分离方法。技术人员清楚，这样的原理可以因此组合并产生先前并未以此结果公开的方法。因此，本发明同样涉及可纯化本发明的类似物的方法。

本发明进一步涉及制备本发明的胰岛素类似物的方法，其中利用重组方法制备胰岛素类似物前体并利用酶法将其转变为双链的胰岛素前体，其在涉及A链氨基酸1的N末端携带有精氨酸或赖氨酸，在B链的C末端带有赖氨酸或精氨酸，其在存在具有胰蛋白酶活性的酶时用精氨酰胺或赖氨酰胺(lysinamide)转变成酰胺并因此转变成本发明的慢效胰岛素，然后利用生化纯化方法以高纯度制得本发明的胰岛素类似物。

蛋白质“类似物”指通过用其他氨基酸残基取代相应的或相同的天然蛋白质的至少一个天然氨基酸残基和/或添加和/或删除相应的或相同的天然蛋白质的至少一个氨基酸残基而不同的蛋白质。就这一点而言，也可添加非天然氨基酸残基和/或用非天然氨基酸残基取代氨基酸残基。

蛋白质“衍生物”指利用化学修饰起始蛋白质的某些氨基酸残基而获得的蛋白质。化学修饰可例如由向一个或更多个氨基酸添加一个或更多个特定化学基团组成。

附图说明

图1：本发明的胰岛素类似物在大鼠中的降血糖效力

图2：甘精胰岛素在大鼠中的降血糖效力

下述实施例意图说明本发明的概念而非限制本发明。

实施例1：制备编码Gly(A21)-胰岛素和在C/A链交界带有Arg Arg的修饰C肽的衍生载体pINT3580

欧洲专利申请EP-A 1 222 207公开了质粒pINT358d、pINT91d和引物序列Tir。使用这些产品的DNA构建质粒pINT3580。质粒pINT358d的特征还包括编码具有特定性质的修饰C肽的基因序列。合成了三条引物序列：

pint3580_glya21rev      

5′-CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3′(SEQ ID NO：3)

该引物用于在pINT358d编码的胰岛素原序列A链的位置21引入甘氨酸(粗体、加下划线)而不是天冬酰胺。

arg_cjuncf

5′-GTCCCTGCAGCGTCGCGGCATCGTGGAGCAG-3′(SEQ I D NO：4)

该引物与引物arg_cjunc_rev的作用一样，用于在胰岛素A/B链交界处引入精氨酸而不是赖氨酸。

arg_cjunc_rev

5′-CCACGATGCC GCGACGCTGC AGGGACCCCT CCAGCG-3′(SEQ ID NO：5)

在两条引物中，待引入的精氨酸密码子均以粗体表示。按照欧洲专利申请EP-A 1 222 207的方法，分别用引物对Tir/arg_cjunc_rev和arg_cjuncf/pint3580_glya21rev和质粒pINT358d的DNA作为模板进行PCR。组合两个反应产物的等份样品并在第三个PCR中与引物对Tir/pint3580_glya21rev共同使用。按照厂商说明书在一个或相同反应中，在用凝胶电泳分离该反应混合物后纯化该反应产物，用限制酶SalI/NcoI消化该反应产物，利用凝胶电泳分离该反应混合物，分离编码胰岛素原序列的DNA片段。然后，利用DNA连接酶反应将该片段插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。

用连接混合物转化大肠杆菌感受态细胞。将转化混合物涂布在含25mg/l氨苄青霉素的选择平板上。从长出的克隆中分离质粒DNA并用DNA序列分析进行鉴定。正确的质粒称为pINT3580。

实施例2：构建编码His(A8)，Gly(A21)-前胰岛素原的质粒pINT3581

如实施例1中所述，用3个聚合酶链式反应完成该构建。将第三个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入用NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA中。使用了引物Tir和pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3580_Ha8f

5’-AGCAGTGCTGCCACAGCATCTGCTCCCTCTAC-3’(SEQ ID NO：6)

pint3580_Ha8rev

5’-GAG CAGATGCT GTG GCAGCACTG CTCCACGATG-3’(SEQ ID NO：7)

通过加粗每个字母强调了编码A链位置8组氨酸的密码子。按实施例1中所述的方法完成该构建。PCR1和2的模板为质粒pINT3580的DNA。分别用引物对Tir/pint3580_Ha8rev和pint3580_Ha8f/pint3580_glya21rev进行PCR1和PCR2。PCR3使用了引物对Tir/pint3580_glya21rev。该反应的模板为PCR1和PCR2反应产物的混合物。正确的质粒称为pINT3581。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202的前体，该前体的特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-人胰岛素，且其用精氨酰胺进行了酰胺化。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202b的前体，该前体的特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Lys(B32)NH₂-人胰岛素，且其用赖氨酰胺进行了酰胺化。

实施例3：构建编码His(A8)，Glu(A5)，Gly(A21)-前胰岛素原的质粒pINT3582

按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应完成该构建过程。第三个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和pint3580-glya21rev。另外合成了两条引物。

pint3581_Ea5f    

5′GCATCGTGGAGGAGTGCTGCCACAGCATCTG 3′(SEQ ID NO：8)

pint3581_Ea5rev

5’-CTGT GGCAGCACTC CTCCACGATG CCGCGACG-3’(SEQ ID NO：9)

通过加粗每个字母强调了编码A链位置5谷氨酸的密码子。按实施例1所述方法完成该构建过程。模板为质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3582。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-1的前体，该前体的特征为Arg(A0)，Glu(A5)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-人胰岛素，且其用精氨酰胺进行了酰胺化。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-1b的前体，该前体的特征为Arg(A0)，Glu(A5)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Lys(B32)-NH₂-人胰岛素，且其用赖氨酰胺进行了酰胺化。

实施例4：构建编码His(A8)，Asp(A18)，Gly(A21)-前胰岛素原的质粒pINT3583

该构建过程与实施例1不同，仅利用一个聚合酶链式反应完成。该反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir。另外合成了一条引物：

pint3580_Da18rev

5′CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTCCTCCAGCTGGTAGAGGGAG 3′(SEQ ID NO：10)

加粗强调了编码A链位置18天冬氨酸的密码子。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3583。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202的前体，其特征为Arg(A0)，Asp(A18)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-2b的前体，其特征为Arg(A0)，Asp(A18)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Lys(B32)NH₂-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。

实施例5：构建编码His(A8)，Glu(A15)，Gly(A21)-前胰岛素原的质粒pINT3585

该构建过程与实施例1不同，仅利用一个聚合酶链式反应完成。该反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir。另外合成了一条引物：

pint3580_Ea15rev

5′-CAAAGGTCGA CTATTAGCCG CAGTAGTTCTCCAGCTCGTA GAGGGAGCAGATGCTG-3′(SEQ ID NO：11)

加粗强调了编码A链位置15谷氨酸的密码子。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3585。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-3的前体，其特征为Arg(A0)，Glu(A15)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-3b的前体，其特征为Arg(A0)，Glu(A15)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Lys(B32)NH₂-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。

实施例6：构建编码His(A8)，Gly(A21)，Asp(B3)-前胰岛素原的质粒pINT3588

按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应完成了该构建过程。第三个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3581_Db3f

5′-GCACGATTTGTGGACCAGCACCTGTGCGGC-3′(SEQ ID NO：12)

pint3581_Db3rev

5′-CACAGG TGCTGGTCCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3′(SEQ ID NO：13)

通过加粗每一个字母强调了编码胰岛素B链位置3天冬酰胺的密码子。按实施例1所述方法完成了该构建过程。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3588。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-4的前体，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Asp(B3)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-4b的前体，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Asp(B3)，Arg(B31)，Lys(B32)NH₂-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。

实施例7：构建编码His(A8)，Gly(A21)，Glu(B4)前胰岛素原的质粒pINT3593

按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应完成了该构建过程。第三个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3581_Eb4f

5′-ACGATTTGTGAACGAGCACCTGTGCGGCTC-3′(SEQ ID NO：14)

pint3581_Eb4rev

5′-CGCACAGG TGCTCGTTCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3′(SEQ ID NO：15)

加粗强调了编码胰岛素B链位置4谷氨酰胺的密码子。按实施例1所述方法完成了该构建过程。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3593。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-5的前体，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B4)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-5b的前体，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B4)，Arg(B31)，Lys(B32)NH₂-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。

实施例8：构建编码His(A8)，Gly(A21)，Glu(B0)-前胰岛素原的质粒pINT3597

利用2个聚合酶链式反应完成了该构建过程。使用了引物pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3581_Eb0f1

5′-CAACAGGAA ATTCGGCACG AGAGTTTGTG AACCAGCACC TGTG-3’(SEQID NO：16)

pint3581_Eb01f2

5′TATCGACCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCACG AGAG-3’(SEQ ID NO：17)

该实施例中的两条引物有部分重叠。Pint3581_Eb0f2含有NcoI识别序列。用下划线标出了该序列。通过加粗每一个字母强调了编码B链开始部分位置0谷氨酸的密码子。PCR1模板是质粒pINT3581的DNA。

用引物对pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev进行PCR1。PCR2的模板是PCR1的产物。用引物对pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev进行PCR2。PCR2的产物包含完整的前胰岛素原序列。第二个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。正确的质粒称为pINT3597。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-6的前体，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B0)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-6b的前体，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B0)，Arg(B31)，Lys(B32)NH₂-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。

用天冬氨酸密码子替换位置B0的谷氨酸密码子并按照本实施例的方法产生了在位置B0具有天冬氨酸而不是谷氨酸的质粒。

实施例9：构建编码His(A8)，Gly(A21)，Lys(B0)-前胰岛素原的质粒pINT3700

该构建过程是为了在B链前序列和开始部分间的边界引入赖氨酸密码子而不是精氨酸密码子。利用两个聚合酶链式反应完成了该构建过程。使用了引物pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3581_Eb0f1

5′-CAACAGGAA ATTCGGCA AAGTTTGTG AACCAGCACC TGTG-3’(SEQ IDNO：18)

pint3581_Eb01f2

5′TATCGA CCAT GGCAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCAGAG-3′(SEQ IDNO：19)

该实施例中的两条引物部分重叠，且pint3581_Eb0f2含有NcoI识别序列。用下划线标出了该序列。通过加粗每一个字母强调了编码B链开始部分位置0的谷氨酸密码子。PCR1的模板是质粒pINT3581的DNA。用引物对pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev进行PCR1。PCR2的模板是PCR1的产物。用引物对pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev进行PCR2。PCR2的产物包含完整前胰岛素原序列。第二个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。正确的质粒称为pINT3700。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)NH₂-人胰岛素的前体。获得该化合物首先通过利用与胰蛋白酶和赖氨酰内肽酶C的反应制备中间产物Thr(B30)-人胰岛素的Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，随后通过用精氨酰胺酰胺化所述中间产物将其转变为目标化合物YKL202-7，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂-人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-7b的前体，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Lys(B30)NH₂-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。

实施例10：构建编码Gly(A21)Lys(B0)-前胰岛素原的质粒pINT3701

该构建过程用于在B链的前序列和开始部分间的边界引入赖氨酸密码子而不是精氨酸密码子。按照实施例9的构建策略，但使用质粒pINT358d的DNA作为PCR1的模板制备了质粒pINT3701，同原始质粒pINT358d一样，该质粒的特征为C肽和A链间的边界由氨基酸序列Lys-Arg构成。

实施例11：构建编码含有实施例10所述C肽的His(A8)，Gly(A21)，Lys(B0)-前胰岛素原的质粒pINT3702

按照实施例2公开的构建策略但使用质粒pINT3701的DNA作为模板制备质粒pINT3702。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)NH₂-人胰岛素的前体。获得该化合物首先通过仅与赖氨酰内肽酶C的反应制备中间产物Thr(B30)-人胰岛素的Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，随后通过用精氨酰胺酰胺化所述中间产物将其转变为目标化合物YKL202-8，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂-人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-8b的前体，其特征为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Lys(B30)NH₂-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。

实施例12：制备编码His(A8)，Gly(A21)，Lys(B0)-前胰岛素原和在C/A链边界带有三肽Lys-Arg-Arg的修饰C肽的衍生载体pINT3703

将质粒pINT3702的DNA用作模板并使用引物pint3580_glya21rev和Tir。合成了两条引物。

3702_arg_cjuncf

5′-TGC AGAAGCGCAGAGGCATCGTG GAGCAGTGC-3’(SEQ ID NO：20)

与引物arg_cjunc_rev一样，该引物用于在胰岛素A/B链边界引入精氨酸。

3702_cjunc_rev

5′-TCC ACGATGCCTCTGCGCTTCTG CAGGGACCC-3’(SEQ I D NO：21)

两个引物中待引入的精氨酸密码子均是黑体。按照欧洲专利申请EP A1 222 207中所述的方法进行了PCR，引物对分别为Tir/3702_cjunc_rev和3702_arg_cjuncf/pint3580_glya21rev，模板为质粒pINT3702的DNA。组合两个反应产物的等份样品并在第三个PCR中与引物对Tir/pint3580_glya21rev共同使用。按照厂商说明书在一个或同一个反应中用凝胶电泳分离该反应混合物后纯化该反应产物，用限制酶SalI/NcoI消化该反应产物，利用凝胶电泳分离该反应混合物，分离编码胰岛素原序列的DNA片段。然后，利用DNA连接酶反应将该片段插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。

用连接混合物转化大肠杆菌感受态细胞。将转化混合物涂布在含25mg/l氨苄青霉素的选择平板上。从长出的克隆中分离质粒DNA并用DNA序列分析进行鉴定。正确的质粒称为pINT3702。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)NH₂-人胰岛素的前体。通过利用与赖氨酰内肽酶C的反应开始制备中间产物Thr(B30)-人胰岛素的Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，随后通过用精氨酰胺酰胺化所述中间产物将其转变为目标化合物而获得该化合物。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Lys(B30)NH₂-人胰岛素的前体，且其用赖氨酰胺酰胺化。

技术人员清楚，按照实施例3-8的方法可将天冬氨酸或谷氨酸引入A链或B链的恰当位置。这些胰岛素原是下述化合物的前体

  YKL202-10a  Arg(A-1)，Arg(A0)，Glu(A5)，His(A8)，Gly(A21)，  Arg(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-10b  Arg(A-1)，Arg(A0)，Glu(A5)，His(A8)，Gly(A21)，  Lys(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-11a  Arg(A-1)，Arg(A0)，Glu(A15)，His(A8)，Gly(A21)，  Arg(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-11b  Arg(A-1)，Arg(A0)，Glu(A15)，His(A8)，Gly(A21)，  Lys(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-12a  Arg(A-1)，Arg(A0)，Asp(A18)，His(A8)，Gly(A21)，  Arg(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-12b  Arg(A-1)，Arg(A0)，Asp(A18)，His(A8)，Gly(A21)，  Arg(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-13a  Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B0)，  Arg(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-13b  Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B0)，  Lys(B30)-NH₂-人胰岛素

  YKL202-14a  Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Asp(B3)，  Arg(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-14b  Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Asp(B3)，  Lys(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-15a  Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B4)，  Arg(B30)-NH₂-人胰岛素  YKL202-15b  Arg(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Glu(B4)，  Lys(B30)-NH₂-人胰岛素

实施例13：制备编码His(A8)，Gly(A21)，Lys(B0)-前胰岛素原的衍生载体pINT3704

该实施例公开了编码His(A8)，Gly(A21)，Lys(B0)-前胰岛素原和在C/A链边界带有三肽Lys-Arg-Arg的修饰C肽的衍生载体pINT3704的制备方法，其中人胰岛素位置A21的甘氨酸被删除。

按照实施例12中公开的合成策略并将引物3702_arg_cjuncf和3702_arg_cjuncfrev替换为引物370_ΔGa1f和3703_ΔGa1rev并使用质粒pINT3703的DNA作为模板产生了质粒pINT3704，其中在A链位置1的甘氨酸在编码的前胰岛素原中被删除，该序列剩余部分对应于pINT3703编码的序列部分。

3703_ΔGa1f

5’-TGC AGAAGCGCAGAATCGTG GAGCAGTGCTGC-3’(SEQ ID NO：22)

3703_ΔGa1rev

5′-TGCTCC ACGATTCTGCGCTTCTG CAGGGACCC-3′(SEQ ID NO：23)

该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg(A0)，Arg(A1)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-NH₂-人胰岛素的前体。通过利用与赖氨酰内肽酶C的反应开始制备中间产物Arg(A0)，Arg(A1)，His(A8)，Gly(A21)，des Thr(B30)-人胰岛素，随后通过用精氨酰胺酰胺化所述中间产物将其转变为目标化合物而获得该化合物。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg(A0)，Arg(A1)，His(A8)，Gly(A21)，Lys(B30)-NH₂-人胰岛素的前体，且其用赖氨酰胺酰胺化。

技术人员清楚，可按照实施例12的方法将带负电荷的氨基酸引入前胰岛素原序列。也可利用类似于实施例13的方法从质粒pINT3702制备编码胰岛素原序列的质粒，该质粒制备在A链位置1带有充当N末端氨基酸的精氨酸的胰岛素衍生物。

实施例14：表达胰岛素原衍生物

按照欧洲专利申请EP A 1 222 207实施例1的方法进行该表达。

实施例15：折叠胰岛素原衍生物

基本按照EP-A 0 668 282公开的方法进行该折叠。

实施例16：用胰蛋白酶加工实施例2-8的胰岛素原

酶法加工经折叠的前胰岛素原以给出B链末端C末端的特征为赖氨酸或精氨酸的双链Arg(A0)-胰岛素前体。按照例如WO91/03550实施例4中公开的方法酶法加工经折叠的前胰岛素原前体。使用WO 2007/031187A1中公开的胰蛋白酶变体证明在此实施例中具有特别有利的效果。

实施例17：用内切蛋白酶(endoproteinase)Lys-C加工实施例9-13的胰岛素原

水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)来源的内切蛋白酶Lys-C可从市场购得(Merck/Calbiochem)。用具有轻微改变的Jekel，P.A.等[Anal.Biochem.134，347354，(1983)]描述的方法进行该反应。将pH设为9.5，反应温度为30℃。

在一锅法(one-pot)反应中除去前序列并切除以Thr(B30)开始的C肽，因此B链的C末端变为赖氨酸，其是酶催化的偶联反应的反应位点。

实施例18：通过双链前体与精氨酰胺或赖氨酰胺偶联制备Arg-NH₂胰岛素或Lys-NH₂胰岛素化合物

不考虑其它酸性氨基酸的定位，可进行下述标准反应：在0.95ml精氨酰胺溶液(446g/L)中溶解100mg Arg(A0)，Gly(A21)，Arg(B31)-胰岛素类似物，加入0.13ml M醋酸钠缓冲液(pH 5.8)和2ml DMF。将反应混合物冷却至12℃并通过加入0.094ml胰蛋白酶(0.075mg，Roche Diagnostics)而起始反应。8小时后通过加入TFA使pH降至2.5而终止反应，进行HPLC分析。形成了＞60％的Arg(A0)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-胰岛素类似物。加入胰蛋白酶抑制剂溶液，然后以与US 5,656,722所述方法相似的方法纯化酰胺化的类似物。

以类似方法制备相应的赖氨酰胺化合物。然而，该反应的起始材料是在溶液中含有366g/L赖氨酰胺的水性赖氨酰胺储液。

实施例19：半合成制备Lys(A1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-胰岛素酰胺

实施例11中公开的化合物YKL202-8是制备化合物YKL202-11的起始材料，其中YKL202-8对应于结构为Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-胰岛素酰胺的胰岛素衍生物，YKL202-11的结构为Lys(A-1)，Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B30)-胰岛素酰胺。在40ml溶液中溶解200mg该化合物，所述溶液含100mM Na₂HPO₄/CH₃CN(50∶50)混合物且pH值被设为7.7-8.2。通过在二氯甲烷中混合0.3mM Boc-Lys(Boc)-OH、0.4mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.4mM二环己基碳二亚胺(DCC)40分钟制备了其他物质Boc-Lys(BOC)-NHS酯。在旋转真空蒸发器中将反应混合物浓缩至干。然后用5ml甲醇溶解该混合物并加至溶解的起始胰岛素中。在室温下搅拌该反应至少60分钟但至多120分钟。通过加入200μlTFA终止该反应。利用LC-MS质谱鉴定反应产物的质量，以证实存在由三种组分组成的单乙酰化产物。利用HPLC分离所述组分。在该过程中也去除了二乙酰化和三乙酰化副产品。利用质谱分析HPLC分离的级分。将每种均含有单乙酰化产物的3种级分进行氨基酸序列分析，该分析的诠释能鉴定含有目标化合物的HPLC级分，然后利用水解从该级分移除Boc保护基。在再次用HPLC纯化后检测目标产物的生物学性质。

实施例20：制备编码His(A8)，Gly(A21)胰岛素原的质粒pINT358ha8

按照实施例2的制备方法并使用质粒pINT358d的DNA作为PCR1和PCR2的模板制备了质粒pINT358_ha8，该质粒编码His(A8)，Gly(A21)胰岛素原。该质粒编码的胰岛素原是化合物His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-人胰岛素的前体。在该实施例中按照WO91/03550所公开的方法加工前胰岛素原，以获得中间产物His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，然后进行酰胺化。在该实施例中使用了常规胰蛋白酶。

实施例21：配制酰胺化的胰岛素衍生物

为了测试本发明胰岛素衍生物的生物药理学性质和理化性质，按如下方法制备该化合物的溶液：在含有80μg/mL锌(氯化锌形式)的1mM盐酸溶液中将本发明的胰岛素衍生物溶解至240±5μM的靶浓度。为了该目的，首先称出一定量的冷冻干燥材料，该材料的量比基于分子量和目标浓度所需的量高大约30％。然后，利用分析型HPLC测定本浓度，然后用含有80μg/mL锌的5mM盐酸溶液将该溶液制备成获得靶浓度所需要的体积。需要时可将pH重新调整至3.5±0.1。在用HPLC分析以最终确认240±5μM的靶浓度后，利用具有0.2μm滤器配件的注射器将该终溶液转移至灭菌管，该管用隔膜和螺口盖封闭。在短期单个测试本发明的胰岛素衍生物时并未优化制剂，例如关于加入等张剂、防腐剂或缓冲材料等。

实施例22：利用酵母表达制备His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)人胰岛素EP-A 1 364 032公开了利用酵母表达和分泌水蛭素和小胰岛素原(miniproinsulin)的融合蛋白的方法。在这一方面提及的特别有利的酵母宿主生物是酿酒酵母(S.Cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(K.Lactis)、多形汉逊酵母(H.Polymorpha)和巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)。所述专利申请实施例4公开了一种质粒的构建方法，该质粒允许在巴斯德毕赤酵母中制备融合蛋白，且该质粒的DNA充当了制备小胰岛素原的模板，该小胰岛素原A链位置A8、A15、A18和A21的氨基酸序列的特征为组氨酸(A8)、谷氨酸(A15)、天冬氨酸(A18)和甘氨酸(A21)。使用了引物pichia_H_if1。新合成了下述引物并在合成后进行了纯化：

pichia_G21_rev

5′-TTTTTTGGCG CCGAATTCAC TATTAGCCAC AGTAGTTTTC CAGCTGGTA-3′(SEQ ID NO：24)

加粗强调的密码子标出了A21的位置。

pichia_H8_f具有下述序列

5′-GAACAATGTTGTCATAGTATCTGTTCTTTGTACCAGCTGGAAAACTACTG-3′(SEQ ID NO：25)

加粗强调的密码子标出了A8的位置。

pichia-a1-12rev

5′-GAACAGATACTATGACAACATTGTTCAACGATACC-3′(SEQID NO：25)

加粗强调的密码子标出了A8的位置。

在存在嗜热聚合酶和聚合酶缓冲液时将等摩尔量(1μg)的引物pichia_G21_rev和引物pichia_H8f(两条引物部分重叠)在95℃变性，所述缓冲液含有4种脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP5’，然后在56℃孵育10-15分钟。该反应1的体积为25μl。在标准的聚合酶链式反应(反应2)中，将引物pichia_H_if1和pichia-a1-12rev与所述模板DNA平行反应。在另一个聚合酶链式反应中，反应1和2的反应产物作为模板与引物pichia_H_if1/pichia_G21rev反应。利用凝胶电泳纯化该反应的反应产物。与实施例4相似，用限制酶XhoI和SacII消化后，将包含融合产物的DNA片段插入载体pPICZαA。产生了质粒pPIC_ins202。使用可商购的试剂盒表达该质粒编码的融合蛋白。在制备His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)-人胰岛素前体后，按照精氨酸(B31)部分所述方法偶联精氨酰胺(arginine amide)。产生了化合物His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)NH₂-胰岛素(YKL203)，该化合物自身代表了相应于实施例20的新型慢效胰岛素，在大鼠实验中测试了该化合物。相似地，用赖氨酰胺偶联产生了化合物YKL203b，其特征为His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Lys(B32)-NH₂-胰岛素。

然而，该化合物也可作为制备化合物Arg(A0)，His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)Arg(B32)-NH₂-胰岛素(其制备基于Kohn等[Peptides 28(2007)935-948])的中间产物。为了该目标，在40ml溶液中溶解200mg化合物His(A8)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH₂-人胰岛素，所述溶液包含100mM Na₂HPO₄/CH₃CN(50∶50)的混合物且pH被设定为7.7-8.2。

通过在二氯甲烷中混合0.3mM Boc-Arg-OH、0.4mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.4mM二环己基碳二亚胺(DCC)40分钟制备了其他材料Boc-Arg-NHS酯。在旋转真空蒸发器中将反应混合物浓缩至干。然后用5ml甲醇溶解该混合物并加至溶解的起始胰岛素中。在室温下搅拌该反应至少60分钟但至多120分钟。通过加入200μl TFA终止该反应。利用LC-MS质谱鉴定反应产物的质量，以证实存在由三种组分组成的单乙酰化产物。利用HPLC分离所述组分。在该过程中也去除了二乙酰化和三乙酰化副产品。利用质谱分析HPLC分离的级分。将每种均含有单乙酰化产物的3种级分进行氨基酸序列分析，该分析的诠释能鉴定含有目标化合物的HPLC级分，然后利用温和水解从该级分移除Boc保护基。在再次用HPLC纯化后检测目标产物的生物学性质。

实施例23：评估新型胰岛素类似物在大鼠中的降血糖效力

在健康、雄性、血糖水平正常的Wistar大鼠中测试了所选新型胰岛素类似物的降血糖效力。雄性大鼠皮下注射剂量为9nmol/kg的胰岛素类似物。临在注射胰岛素类似物前以及在注射后的规律间隔时间(最多至8小时)收集动物血样并测其血糖含量。该实验清楚显示(参见图1)，本发明的胰岛素类似物明显延迟了作用开始并使作用持续时间更长且均一。

实施例24：评估新型胰岛素类似物在犬中的降血糖效力

在健康、雄性、血糖水平正常的比格犬(beagle dog)中测试了所选新型胰岛素类似物的降血糖效力。雄性比格犬皮下注射剂量为6nmol/kg的胰岛素类似物。临在注射胰岛素类似物前以及在注射后的规律间隔时间(最多至48小时)收集动物血样并测其血糖含量。该实验清楚显示，本发明的胰岛素类似物明显延迟了作用的平缓开始(shallow onset)并使作用持续时间更长且均一。

序列表

<110>塞诺菲-安万特德国有限公司

 

<120>具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物

 

<130>DE2008/002

 

<140>102008003566.1-43

<141>2008-01-09

 

<160>26

 

<170>PatentIn版本3.3

 

<210>1

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>A链

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Xaa对应于Lys，Arg或氨基

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa对应于Lys，Arg或化学键

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Xaa对应于Arg或Gly

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Gln

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(17)..(17)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Gln

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(20)..(20)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Asn

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(23)..(23)

<223>Xaa对应于Ala，Ser，Thr或Gly

 

<400>1

 

Xaa Xaa Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

1               5                   10                  15

Xaa Leu Glu Xaa Tyr Cys Xaa

            20

 

<210>2

<211>34

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>B链

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或氨基

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或化学键

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Xaa对应于Asp，Glu，Phe或化学键

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Asn

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Gln

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(31)..(31)

<223>Xaa对应于Arg，Lys或选自包含Phe，Ala，Thr，Ser，Val，Leu，

     Glu或Asp的组的氨基酸或化学键

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(32)..(32)

<223>Xaa对应于Thr或化学键

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(33)..(33)

<223>Xaa对应于Arg，Lys或化学键

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(34)..(34)

<223>Xaa对应于Arg-酰胺或Lys-酰胺

 

<400>2

 

Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala

1               5                   10                  15

Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Xaa

            20                  25                  30

Xaa Xaa

 

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3580_glya21rev

 

<400>3

caaaggtcga ctattagccg cagtagttct ccagctgg                            38

 

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>arg_cjuncf

 

<400>4

gtccctgcag cgtcgcggca tcgtggagca g                                   31

 

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>arg_cjunc_rev

 

<400>5

ccacgatgcc gcgacgctgc agggacccct ccagcg                              36

 

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3580_Ha8f

 

<400>6

agcagtgctg ccacagcatc tgctccctct ac                                  32

 

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3580_Ha8rev

 

<400>7

gagcagatgc tgtggcagca ctgctccacg atg                                 33

 

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Ea5f

 

<400>8

gcatcgtgga ggagtgctgc cacagcatct g                                   31

 

<210>9

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Ea5rev

 

<400>9

ctgtggcagc actcctccac gatgccgcga cg                                  32

<210>10

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3580_Da18rev

 

<400>10

caaaggtcga ctattagccg cagtagtcct ccagctggta gagggag                  47

 

<210>11

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3580_Ea15rev

 

<400>11

caaaggtcga ctattagccg cagtagttct ccagctcgta gagggagcag atgctg        56

 

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Db3f

 

<400>12

gcacgatttg tggaccagca cctgtgcggc                                     30

 

<210>13

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Db3rev

 

<400>13

cacaggtgct ggtccacaaa tcgtgccgaa tttc                                34

 

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Eb4f

 

<400>14

acgatttgtg aacgagcacc tgtgcggctc                                     30

 

<210>15

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Eb4rev

 

<400>15

cgcacaggtg ctcgttcaca aatcgtgccg aatttc                              36

 

<210>16

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Eb0f1

 

<400>16

caacaggaaa ttcggcacga gagtttgtga accagcacct gtg                      43

 

<210>17

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Eb01f2

 

<400>17

tatcgaccat ggcaacaaca tcaacaggaa attcggcacg agag                     44

 

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Eb0f1

 

<400>18

caacaggaaa ttcggcaaag tttgtgaacc agcacctgtg                          40

 

<210>19

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pint3581_Eb01f2

 

<400>19

tatcgaccat ggcaacaaca tcaacaggaa attcggcaga g                        41

 

<210>20

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>3702_arg_cjuncf

 

<400>20

tgcagaagcg cagaggcatc gtggagcagt gc                                  32

<210>21

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>3702_cjunc_rev

 

<400>21

tccacgatgc ctctgcgctt ctgcagggac cc                                  32

 

<210>22

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>3703_ΔGa1f

 

<400>22

tgcagaagcg cagaatcgtg gagcagtgct gc                                  32

 

<210>23

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>3703_ΔGa1rev

 

<400>23

tgctccacga ttctgcgctt ctgcagggac cc                                  32

 

<210>24

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pichia_G21_rev

 

<400>24

ttttttggcg ccgaattcac tattagccac agtagttttc cagctggta                49

 

<210>25

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pichia_H8_f

 

<400>25

gaacaatgtt gtcatagtat ctgttctttg taccagctgg aaaactactg               50

 

<210>26

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>pichia-a1-12rev

 

<400>26

gaacagatac tatgacaaca ttgttcaacg atacc                               35