双-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1,4-单酯-4-)--β-环糊精及制备方法和用途

摘要

本发明涉及双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-环糊精及制备和作为手性选择剂在高效液相色谱(HPLC)中的应用，本发明具有如下效果：1、用马来酸酐双取代β-环糊精A、D环的6位碳上羟基氢后，再用间硝基苯磺酰基加成到顺丁烯的双键上，且间硝基苯磺酰基加成在丁二酸的3位碳上而形成的。其分子式为：C

说明书

技术领域

本发明涉及一种手性选择剂——双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-环糊精及制备方法和用途。

背景技术

手性药物分离纯化是新药研发的热点之一，受到广泛关注。HPLC拆分是制备手性药物单一对映体的一种有效手段，在众多的手性固定相中，β-环糊精(CD)及其衍生物受到众多科研工作者的青睐。手性药物(chiraldrug)是指药物的分子结构中存在手性因素，药物的药理作用是通过与体内的大分子之间严格的手性识别和匹配而实现的。构成蛋白质的氨基酸都是L-氨基酸，而组成多糖和核酸的单糖都是D-单糖，药物的外消旋体引入体内后，其对映体分子均由体内具有手性的蛋白质、酶和受体以两个不同的分子来处理。由于人体的手性特征，在许多情况下，手性药物的一对对映体在生物体内的药理活性、代谢过程、代谢速率及毒性等存在显著的差异，在吸收、分布和排泄等方面也存在差异，而且对映体之间还可能会发生相互转化。

对手性药物对映体进行有效的分离纯化，更有效地保证用药安全，提高社会医疗水平，成为科研工作者一项重要的工作。如β-受体阻断药物普萘洛尔的两个对映体的体外活性相差98倍；L-多巴(L-dopa)是治疗帕金森病的药物，真正有治疗活性的化合物是L-多巴胺(L-dopamine)，必须服用对映体纯的左旋体多巴，才能在人体内被专一性酶催化转化为L-多巴胺而起效。如果服用消旋体的话，右旋体会聚积在体内，不会被体内的酶代谢，从而可能对人体的健康造成危害。在当今常用的1327个化学合成药物中，手性药物528个，其中以单一对映体上市的只有61个，大部分仍以外消旋体形式销售。这种情况，无疑给用药安全造成了潜在的威胁，也给研发单一对映体新药提出了更迫切的要求。临床服用单一对映体的手性药物可以减少药物使用剂量，降低病人代谢负担，提高剂量的幅度并拓宽用途，对药物动力学能有更好的控制。在剂量设定时幅度更宽，反应较小；在剂量选择时更有信心。对制药企业而言，生产单一对映体手性药物可以节省资源，降低新药上市进行临床药理学和药物代谢动力学研究的成本，减少废料排放，降低对环境的污染。

得到光学纯的对映体不容易，获得单一对映体的手性化合物有三种方法：手性源合成法、不对称合成法、外消旋体拆分法。外消旋体拆分法是在手性选择剂(手性助剂)的作用下将外消旋体化合物拆分为纯对映体化合物的方法，又分为化学拆分法、酶或微生物法、色谱拆分法。其中色谱拆分法显示出优越性，采用色谱法分离纯化手性药物雷诺嗪，单一对映体制备纯度达到98％以上；奥美拉唑拆分结果为S-奥美拉唑纯度最高达到98.71％，R-奥美拉唑纯度最高为95.47％。液相色谱就包含在外消旋体拆分法中。液相色谱被认为是测定对映体纯度和分离制备光学纯单一对映体的最好方法。它适应范围广，操作条件温和，不会发生分离物构型变化或生物活性被破坏等现象，同时能得到高光学纯的两种对映异构体。

Cramer等人首先发现了β-环糊精(CD)对光学异构体有较好的识别作用。β-CD衍生化后，可以在结合位点附近构筑立体几何关系，形成特殊的手性位点；进行三维空间修饰，扩大结合空腔或者提供有特定几何形状的空间，以与客体分子有适应的匹配；而且还可引入其它能起手性识别的作用位点。β-CD类手性固定相在手性分离分析中得到了广泛的应用，改进对映体分离的主要作用是：(1)分别结合被分离溶质的一对对映体，形成不同结构和性质的包结物；(2)β-CD的羟基，主要是C-2，C-3位仲羟基，或CD修饰基团与被分离对映体以氢键形成不同结构、性质的复合体；(3)空腔内紧密适度的填充、短程范德华作用力稳定形成的包结物。天然β-CD经过衍生化能提高分离效能，适用于多种色谱分离模式，受到很多科研工作者的青睐。如Xin Wang等用七(6-叠氮基-6-脱氧-2，3-2-O-苯氨基甲酰)β-CD键合手性固定相填充半制备柱用高效液相色谱法分离了β-阻断药物普萘洛尔，并在此基础上用模拟移动床色谱法批量分离制备了普萘洛尔对映体；XinWang等以全苯氨甲酰化β-CD键合硅胶为固定相，用高效液相色谱分离了纳多洛尔四个对映体中的三个，并完全分离了四个对映体中最具活性的(RSR)-纳多洛尔，在此基础上采用五区模拟移动床色谱法在纳多洛尔对映体中分离得到了高纯度的目标对映体(RSR)-纳多洛尔。用此类手性选择剂制备手性药物有显著的分离纯化效果，但种类还不够多，还需继续研发适用面更广泛的、选择性更高的此类手性选择剂来制备更多的单一对映异构体的手性药物。

发明内容

本发明的目的在于提供手性选择剂——双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-环糊精及制备方法和用途，作为手性选择剂其含间硝基苯磺酰基(NO₂C₆H₅SO₂)和丁二酸酯(OOCCHCHCOOH)二种功能基团的β-环糊精衍生物，这种手性选择剂可直接涂渍或键合在硅胶珠上或石英管壁上制备成手性固定相。

为实现本发明的目的，一方面，本发明提供了一种β-环糊精类的手性选择剂，该手性选择剂是通过控制反应条件用马来酸酐双取代β-环糊精A、D环上的6位碳上羟基氢后，再用间硝基苯磺酰基加成到顺丁烯的双键上，且间硝基苯磺酰基加成在丁二酸的3位碳上而形成的。其分子式为：C₆₂H₈₄O₄₉N₂S₂。最终得到取代度一致的新型β-CD衍生物：双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-CD(简称：β-CD-M₂)。用紫外、红外、质谱、核磁、XPS等手段进行表征，对该衍生物结构进行了确认。双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-环糊精的结构为：

另一方面，本发明还提供了制备上述β-环糊精类手性选择剂的合成方法，双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-环糊精的制备方法，β-环糊精简称为β-CD，其特征在于按以下步骤进行：(1)、先用1mol硝基苯与1-10mol氯磺酸80-150℃加热反应得到间硝基苯磺酰氯；(2)、再用2-30mol顺丁烯二酸酐和1mol β-CD，60-120℃加热反应得到双(6-氧-丁烯二酸单酯)-β-CD，简称β-CD-A₂；(3)、然后用1molβ-CD-A₂和2-30mol间硝基苯磺酰氯50-120℃加热反应得到双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-CD，简称β-CD-M₂；反应式如下：

本发明制得的β-环糊精结构的化合物，可通过直接涂渍或键合在硅胶珠等载体上或石英管壁上，制备成手性固定相，也可以作为手性添加剂加入流动相中进行手性物质分离、纯化和提供新的定性定量方法。本发明的手性选择剂适合于高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、高效毛细管电泳(HPCE)等仪器作为手性固定相。所制得的固定相手性识别能力强，稳定性好，可制成分析型和制备型手性柱材料对手性物质进行分离、分析或纯化制备单一对映体。

与现有技术相比，本发明具有如下效果：1、用制备型手性HPLC柱可建立从药物的消旋体中得到纯化的D(+)-替卡西林和L(-)-替卡西林和α-苯乙醇、1-苯丙醇两个单一对映体纯品。2、用分析型手性HPLC柱可建立分离测定替卡西林、α-苯乙醇、苯丙醇单一对映体含量的新方法，经中科院武汉科技查新咨询检索中心出具查新报告显示，未见文献报道。

本发明所用的仪器与试剂分别为：

PE labmda Bio35紫外可见分光光度计(美国)

Nicolet NEXUS-470傅立叶变换红外光谱仪(美国)

Varian prostar 210高效液相色谱(美国)

LABCONCO FreeZone冻干机(美国)

API3200液相色谱串联质谱仪(美国)

Tecnai G2 20S-TWIN透射电子显微镜(捷克)

JSM-6700F扫描电子显微镜(日本)

VG Multilab 2000光电子能谱仪(美国)

AVANCEIII核磁共振波谱仪(BRUKER)

β-CD    国药集团化学试剂有限公司

马来酸酐 国药集团化学试剂有限公司

硝基苯   国药集团化学试剂有限公司

苯磺酸   上海金山亭新化工试剂厂

双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-环糊精的表征：

1、紫外扫描图谱

配制3×10^-6mol·L^-1硝基苯乙醇溶液(乙醇为参比)、3×10^-6mol·L^-1间硝基苯磺酰氯乙醇溶液(乙醇为参比)、3×10^-5mol·L^-1β-CD水溶液(水为参比)、3×10^-5mol·L^-1β-CD-A₂水溶液(水为参比)、3×10^-5mol·L^-1β-CD-M₂水溶液(水为参比)进行紫外扫描，因为硝基苯、间硝基苯磺酰氯不溶于水，β-CD衍生物不溶于乙醇，分别选择不同溶液作为溶剂和参比进行扫描。得到结果如图1所示。硝基苯在260nm处的吸收明显比间硝基苯磺酰氯强；β-CD无明显紫外吸收，β-CD-A₂在200nm到260nm之间有比较明显的紫外吸收，表明顺丁烯二酸酐的双键已经连接到了β-CD上；β-CD-M₂紫外扫描图中，在259nm处出现了比较明显的苯环特征吸收，不同于β-CD-A₂的紫外吸收峰，表明带苯环的基团已经键合到了β-CD-A₂上，生成了不同于β-CD-A₂的产物。

2、红外扫描图谱

对比图3与图2，在图3的β-CD-A₂红外扫描图上明显看到比图2的β-CD红外扫描图多出1726cm^-1的C＝O(s，1726cm^-1)峰；在图4间硝基苯磺酰氯红外扫描图上可见3096cm^-1(w，C-H)，1534cm^-1、1352cm^-1(w，NO₂)，1603cm^-1、755cm^-1(w，苯环)；对比图5与图3，在图5的β-CD-M₂红外扫描图上比图3的β-CD-A₂红外扫描图多出了1533cm^-1、1351cm^-1(w，NO₂)，1611cm^-1、734cm^-1(w，苯环)的峰，表明间硝基苯磺酰氯已经键合到了β-CD-A₂上。

3、X-射线光电子能谱

分别扫描β-CD、顺丁烯二酸酐、β-CD-A₂、β-CD-M₂的X-射线光电子能谱，得到结果如下图所示，各化合物全谱见图6a、图6b、图6c、图6d，各化合物图谱见图7a、图7b、图8a、图8b、图9a、图9b、图10a、图10b、图10c、图10d。

由图6a、图6b、图6c、图6d可见，β-CD中C1s结合能为284.64eV，O1s结合能为530.33eV；顺丁烯二酸酐C1s结合能为284.59eV，O1s出现了结合能为538.4eV和532.25eV的双峰，与氧在顺丁烯二酸酐中有两种键型相符；β-CD-A₂中C1s结合能为284.6eV，O1s结合能为531.17eV；β-CD-M₂中C1s结合能为284.59eV，O1s结合能为530.23eV，N1s结合能为399.82eV，S2p结合能为166.6eV。在β-CD-M₂XPS谱图上明显看到比β-CD-A₂多出N、S的XPS谱带，说明含有N、S元素的基团已经键合到了β-CD-A₂上。

4、核磁图谱

对反应原料β-CD、β-CD-A₂和产物β-CD-M₂采用核磁共振手段进行结构鉴定，包括：¹³C NMR、¹H NMR以及HMBC(¹H检测的异核多键相关试验)、HSQC(¹H检测的异核单量子相干试验)(H的编号与C的编号一致)。

图11为β-CD的¹³C NMR图，可以得到C1：101.83 C2：73.07 C3：72.06 C4：81.12 C5：71.81 C6：60.28。图12为β-CD的¹H NMR图，可知δ4.989为C6羟基(-OH)上的氢，δ2.148、δ3.484-3.591和δ3.771-3.912为C6(-CH₂-)亚甲基上的氢，δ4.680为CD环C1位上的氢，δ3.5-4.0为C2，C3，C4，C5上的氢，图14β-CD-A₂的¹H NMR谱比图2.12β-CD¹H NMR谱δ4.989(-OH上的氢)明显减小，说明β-CD中C6的-OH键在β-CD-A₂中已形成醚键，并有新峰δ6.0-6.5为支链上C14＝C15双键上的氢。

图13为β-CD-A₂的¹³C NMR图，可以得到C1：101.88 C2：73.15 C3：72.05 C4：81.10 C5：71.83 C6：60.19 64.20，-COOH(C16)：169.54，-C＝C-(C14，C15)：131.28，C＝O(C13)：166.26，由以上数据可以看出，-C＝C-、C＝O以及反应产生后的-COOH等基团在图中均有体现，从C6与图11β-CD的C6的比对中可以判断马来酸酐取代反应发生在C6位。

图15C-H直接相关图可进一步看出C6：30.35与δ2.142直接相关，C1与δ4.680上的氢直接相关，δ3.5-4.0的氢与C2，C 3，C4，C5直接相关。δ6.0-6.5的氢与C14，C15直接相关；图16C-H远程相关图可看出双键上氢δ6.0-6.5与C1是远程相关的，与C5也是远程相关的。与C14，C15也是互为远程相关的。

综上所述，原料2(β-CD-A₂)结构为：

图17为β-CD-M₂的¹³C NMR核磁图，因是400兆核磁，仪器灵敏度较低，与β-CD上对应的6个C的化学位移不明显，但苯环Ar(C7-C12)和支链上的C13-C16很明显：C12：134.41，C8：133.10，C10：132.42，C7：130.31，C9，C11：123.97长链C16：166.41；C13：150.16；C14：34.03；C15：40.34；

图18为β-CD-M₂的¹H NMR核磁图，结合二维核磁直接相关图，即HMBC(¹H检测的异核多键相关试验)，图19可以得到：苯环上H有4组峰，与C7直接相关的H为δ8.5，与C9直接相关的H是δ8.3、与C11直接相关的H是δ8.1、与C10直接相关的H是δ7.7。支链羟基(-OH)上的Hδ4.989依然较强，与δ2.5直接相关的是C14：34.03；C15：40.34；

由图20可知：由于环糊精的椅式结构及取代基团的影响，环糊精环上的C1与H5、H4远程相关，C2与H5远程相关。支链也有一些远程相关的点。如C13和H15、OH上的氢；C14与OH上的氢；芳环上C7与H9、H10、H11远程相关，C9与H7、H11远程相关，C10与H7远程相关，C11与H7、H9远程相关，C8与H10、H11远程相关，C12与H10、H9远程相关，C13与H7、H9、H10、H11远程相关。

5、质谱表征

采用半制备HPLC对β-CD-M₂进行分离纯化，冷冻干燥后得到纯化产物，进行质谱表征。半制备HPLC分离色谱条件：固定相：C18半制备柱；流动相：5％-10％乙腈-95％-90％水；流速：2ml·min^-1；柱温：30℃；检测波长：254nm；样品浓度：5×10^-3mol·L^-1水溶液；进样量200μl。质谱实验条件：curtain Gas：10ml·min^-1；IonSpray Voltage：5500V；Ion Source Gas：110ml·min^-1；Declustering Potential：70mv。

由质谱图可以得到如下信息：1699为分子离子峰，是β-CD-M₂(1704)丢失质子后的结果。下面为β-CD-M₂可能的断裂方式，如果按断裂方式(1)两个258(有254.4碎片离子峰)断裂后得到516的碎片，质谱图中有相应的515.1的碎片离子峰；如果按断裂方式(2)质谱图中没有与244或两倍质荷比488相近的碎片，由此可知，带芳环基团的合理断裂方式为(1)，即间硝基苯磺酰基应加成在C14位，而不是C15位。

下面为β-CD-M₂第三种断裂方式：

由β-CD-M₂第三种分裂过程可知，双取代发生在β-CD的1，4环上，1354(图中1354.2)，350(图中为348.2，再丢一个羟基OH为333，图中为333.8，这两峰均很强)，在质谱图中都可以找到依据。若是1，3环取代则应有4个环相连的碎片673(图中无此碎片，也无另一部分1031的碎片)，若是1，2环取代则应有5个环相连的碎片836(图中无此碎片)。

故结构为

本发明制得的β-环糊精衍生物，可通过直接涂渍或键合在硅胶珠等载体上或石英管壁上，制备成手性固定相，也可以作为手性添加剂加入流动相中进行手性物质分离、纯化和提供新的定性定量方法。本发明的手性选择剂适合于高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、高效毛细管电泳(HPCE)等仪器作为手性固定相。所制得的固定相手性识别能力强，稳定性好，可制成分析型和制备型手性柱材料对手性物质进行分离、分析或纯化制备单一对映体。

与现有技术相比，本发明具有如下效果：1、用制备型手性HPLC柱可建立从药物的消旋体中得到纯化的D(+)-替卡西林和L(-)-替卡西林的新方法；还可得到α-苯乙醇、1-苯丙醇两种物质单一对映体的纯品。2、用分析型手性HPLC柱可建立分离测定替卡西林、α-苯乙醇、1-苯丙醇单一对映体含量的新方法，经中科院武汉科技查新咨询检索中心出具查新报告显示，未见文献报道。

附图说明

图1为紫外扫描图谱，a：β-CD；b：β-CD-A₂；c：间硝基苯磺酰氯；d：硝基苯；e：β-CD-M₂。

图2为β-CD红外扫描图。

图3为β-CD-A₂红外扫描图。

图4为间硝基苯磺酰氯红外扫描图。

图5为β-CD-M₂红外扫描图。

图6a为β-CD的X-射线光电子能谱(全谱，VG Multilab 2000)。

图6b为顺丁烯二酸酐的X-射线光电子能谱(全谱，VG Multilab2000)。

图6c为β-CD-A₂的X-射线光电子能谱(全谱，VG Multilab 2000)。

图6d为β-CD-M₂的X-射线光电子能谱(全谱，VG Multilab 2000)。

图7a为β-CD X-射线光电子能C谱(VG Multilab 2000)。

图7b为β-CD X-射线光电子能O谱(VG Multilab 2000)。

图8a为顺丁烯二酸酐X-射线光电子能C谱(VG Multilab 2000)。

图8b为顺丁烯二酸酐X-射线光电子能O谱(VG Multilab 2000)。

图9a为β-CD-A₂X-射线光电子能C谱(VG Multilab 2000)。

图9b为β-CD-A₂X-射线光电子能O谱(VG Multilab 2000)。

图10a为β-CD-M₂X-射线光电子能C谱(VG Multilab 2000)。

图10b为β-CD-M₂X-射线光电子能O谱(VG Multilab 2000)。

图10c为β-CD-M₂X-射线光电子能N谱(VG Multilab 2000)。

图10d为β-CD-M₂X-射线光电子能S谱(VG Multilab 2000)。

图11为β-CD ¹³C核磁图(AVANCE^IIINMR D₂O 400MH_Z)。

图12为β-CD ¹H核磁图(AVANCE^IIINMR D₂O 400MH_Z)。

图13为β-CD-A₂ ¹³C核磁图(AVANCE^IIINMR D₂O 400MH_Z)。

图14为β-CD-A₂ ¹H核磁图(AVANCE^IIINMR D₂O 400MH_Z)。

图15为β-CD-A₂ HSQC核磁图(AVANCE^IIINMR D₂O 400MH_Z)。

图16为β-CD-A₂ HMBC核磁图(AVANCE^IIINMR D₂O 400MH_Z)。

图17为β-CD-M₂ ¹³C核磁图(AVANCE^IIINMR DMSO 400MH_Z)。

图18为β-CD-M₂ ¹H核磁图(AVANCE^IIINMR D₂O 400MH_Z)。

图19为β-CD-M₂ HSQC核磁图(AVANCE^IIINMR DMSO 400MH_Z)。

图20为β-CD-M₂ HMBC核磁图(AVANCE^IIINMR DMSO 400MH_Z)。

图21为β-CD-M₂质谱图。

图22a为硅珠A固定相透射电镜扫描图。

图22b为β-CD-M₂键合硅珠A固定相透射电镜扫描图。

图22c为硅珠B固定相透射电镜扫描图。

图22d为β-CD-M₂键合硅珠B固定相透射电镜扫描图。

图23a为硅珠A5000倍扫描电镜图。

图23b为硅珠A10000倍扫描电镜图。

图23c为硅珠A50000倍扫描电镜图。

图23d为β-CD-M₂键合硅珠A 5000倍扫描电镜图。

图23e为β-CD-M₂键合硅珠A 10000倍扫描电镜图。

图23f为β-CD-M₂键合硅珠A 50000倍扫描电镜图。

图24a为硅珠B5000倍扫描电镜图。

图24b为硅珠B10000倍扫描电镜图。

图24c为硅珠B50000倍扫描电镜图。

图24d为β-CD-M₂键合硅珠B 5000倍扫描电镜图。

图24e为β-CD-M₂键合硅珠B 10000倍扫描电镜图。

图24f为β-CD-M₂键合硅珠B 50000倍扫描电镜图。

图25a为硅珠A的X-射线光电子能谱(全谱)图。

图25b为硅珠B的X-射线光电子能谱(全谱)图。

图25c为β-CD-M₂键合硅珠A的X-射线光电子能谱(全谱)图。

图25d为β-CD-M₂键合硅珠B的X-射线光电子能谱(全谱)图。

图26a为硅珠A氧谱XPS图谱图。

图26b为硅珠A硅谱XPS图谱图。

图27a为硅珠B氧谱XPS图谱图。

图27b为硅珠B硅谱XPS图谱图。

图28a为β-CD-M₂键合硅珠A碳谱XPS图谱图。

图28b为β-CD-M₂键合硅珠A氧谱XPS图谱图。

图28c为β-CD-M₂键合硅珠A氮谱XPS图谱图。

图28d为β-CD-M₂键合硅珠A硫谱XPS图谱图。

图28e为β-CD-M₂键合硅珠A硅谱XPS图谱图。

图29a为β-CD-M₂键合硅珠B碳谱XPS图谱图。

图29b为β-CD-M₂键合硅珠B氧谱XPS图谱图。

图29c为β-CD-M₂键合硅珠B氮谱XPS图谱图。

图29d为β-CD-M₂键合硅珠B硫谱XPS图谱图。

图29e为β-CD-M₂键合硅珠B硅谱XPS图谱图。

图30为半制备色谱分离制备替卡西林单一对映体HPLC图。

31a为HPLC替卡西林单一对映体收集液纯度验证的(-)前锋图。

图31b为HPLC替卡西林单一对映体收集液纯度验证的(+)后峰图。

图32a为HPLC替卡西林单一对映体收集液纯度验证(乙腈体系)前锋图。

图32b为HPLC替卡西林单一对映体收集液纯度验证(乙腈体系)后锋图。

图33a为替卡西林分离线性的(-)前峰面积-浓度曲线图。

图33b为替卡西林分离线性的(-)前峰峰高-浓度曲线图。

图33c为替卡西林分离线性的(+)后峰面积-浓度曲线图。

图33a为替卡西林分离线性的(+)前峰峰高-浓度曲线图。

图34为α-苯乙醇色谱分离图(流动相为99％正己烷-1％无水乙醇)。

图35为α-苯乙醇色谱分离图(柱温为27℃)。

图36为1-苯丙醇色谱分离图(流动相：99％正己烷-1％甲醇)。

图37为1-苯丙醇色谱分离图(柱温：30℃)。

图38a为流速：1.0mL·min^-1的1-苯丙醇色谱分离图。

图38b为流速：0.05mL·min^-1的1-苯丙醇色谱分离图。

图39为扁桃酸色谱分离图。

具体实施方式

双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-环糊精的制备：β-环糊精简称为β-CD，按以下步骤进行：(1)、先用123.2g硝基苯与350.3g氯磺酸100℃加热反应得到间硝基苯磺酰氯；(2)、再用22.0g顺丁烯二酸酐和17.0g β-CD，80℃加热反应得到双(6-氧-丁烯二酸单酯)-β-CD，简称β-CD-A₂；(3)、然后用1mol β-CD-A₂和20mol间硝基苯磺酰氯60℃加热反应得到双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-CD，简称β-CD-M₂。将制得的β-CD-M₂用于以下的实施例。

实施例一：替卡西林单一对映体的HPLC制备新方法

本实施例涉及从该药物的消旋体中得到纯化的D(+)-替卡西林和L(-)-替卡西林的方法。此药物单一对映体的分离分析测定等工作文献较少，大多研究工作是以消旋体的方式在进行，此实施例具有较大创新性。

替卡西林是一种半合成抗生素，化学名为6-(2-羧基-2-噻吩-3-基乙酰)氨基青霉烷酸，临床使用为双钠盐，C₁₅H₁₄N₂Na₂O₆S₂，分子量428.40，为白色至浅黄色粉末，易溶于水，水溶液pH值为6-8。替卡西林为广谱、高效抗铜绿假单孢菌青霉素，但不耐β-内酰胺酶，口服不吸收，静注或肌注给药。主要用于治疗灼伤感染、脑膜炎、骨髓炎、呼吸道、尿道感染及术后预防等。常与β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸(clavulanic acid)制成复方制剂，商品名“泰门汀”，亦做“特美汀”。其对映体结构如下：(*为手性碳)。

替卡西林结构

Li Yin-Hua等用HPLC测定了血浆和尿中的替卡西林；Watson Ian D等用HPLC分别测定了血浆中的克拉维酸和替卡西林；Rice Patrick D^[43]等用HPLC和旋光检测技术联用的方法测定了替卡西林；Kelly James W^[44]等分别用γ-环糊精和离子交换乙基乙烯基苯/二乙烯基苯共聚物、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)做HPLC固定相对包括替卡西林在内的β-内酰胺类抗生素的异构体，进行了分离研究。Hoogmartens J等用HPLC分离了青霉素的侧链异构体：苯氧乙基青霉素、苯氧丙基青霉素、双氯甲氧青霉素、羧苄西林、替卡西林、安苄西林、阿莫西林、和阿度西林；Hendrickx S等用薄层色谱法分离测定了包括替卡西林在内的18种青霉素；Annesley等用梯度洗脱液相色谱法同时分离测定了血浆中包括替卡西林在内的13种抗生素；Haginaka等利用预柱将待测品和1，2，4-三吡咯和氯化汞进行衍生化反应的方法，用HPLC测定了血浆和尿中的羧苄西林、替卡西林和磺苄西林；Haginaka Jun等用HPLC分离荧光检测测定了人血浆和尿中的克拉维酸；Haginaka Jun等用次氯酸钠柱后降解HPLC法测定了替卡西林；Nakagawa Terumichi等用HPLC分别测定了人血浆和尿中的克拉维酸和替卡西林，进行了药物代谢动力学的研究；Mopper Barry用液相色谱法测定了注射剂型药物中的替卡西林；Tyczkowska等用离子对色谱法测定了犬和马血浆中的替卡西林；Wright Jennifer C.等用LC测定了血浆中的替卡西林和克拉维酸；Horimoto Shingo等用HPLC与溴仿做电离加速溶剂的常压化学电离质谱联用测定了包括替卡西林在内的8种抗生素和13种头孢菌素；Pajchel Genowefa等用胶束电动色谱同时测定了特美汀(替卡西林和克拉维酸组成的复合抗生素)中的替卡西林和克拉维酸；LiChonghua等用液相色谱法同时测定了兔子血浆和组织体液中的替卡西林和克拉维酸；Liang Wenqing等用毛细管胶束电动色谱分离测定了阿莫西林、氨苄西林、替卡西林三种青霉素和克拉维酸、舒巴克坦两种β-内酰胺酶抑制剂；Ashraf-Khorassani M等用多维液相色谱/电子喷雾电离质谱分离测定了三种基质中的阿莫西林、克拉维酸和替卡西林。

本实施例提供了一种制备纯化D(+)-替卡西林和L(-)-替卡西林的新方法，该方法用上述制备的β-CD衍生物：双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-CD(简称：β-CD-M₂)键合两种规格的硅珠构筑两种HPLC固定相，用透射电子显微镜TEM、扫描电子显微镜SEM、X-射线光电子能谱XPS进行表征，证明β-CD-M₂成功键合到了硅珠上。

在同种固定相分析柱上采用四种流动相，在合适的配比下替卡西林均达到基线分离，建立了四种相应对映体的HPLC拆分方法。在β-CD-M₂键合的固定相制备色谱柱中进行替卡西林单一对映体制备，对分段收集液的验证结果表明，得到了替卡西林对映体的单一组分，即D(+)型和L(-)型对映体固体盐。未见文献报道。

1β-CD-M₂键合硅胶高效液相色谱固定相的制备与表征

1.1β-CD-M₂键合硅胶高效液相色谱固定相的制备

双-[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4-单酯-4-)-]-β-环糊精+交联剂

1.2表征

1.2.1硅珠与β-CD-M₂键合相透射电镜扫描结果

分别对规格为：比表面60m²·g^-1，孔容0.36cm³·g^-1，孔径30nm(硅珠A)和比表面380m²·g^-1，孔容0.70cm³·g^-1，孔径10nm(硅珠B)的两种5μm全多孔硅珠和两种硅珠键合β-CD-M₂构筑的固定相进行透射电镜扫描，结果如图22a、图22b、图22c、图22d。

对比图22a、图22c硅珠A和硅珠B的透射电镜扫描图，在透射扫描结果中看不到明显区别；分别对比图22a硅珠A与图22b β-CD-M₂键合硅珠A、图22c硅珠B、图22d(b₂)β-CD-M₂键合硅珠B构筑的高效液相色谱固定相可看到，键合后的硅珠表面明显出现了不同于硅珠的新物质，说明有物质键合到硅珠表面。

1.2.2硅珠与β-CD-M₂键合相扫描电镜结果

规格为比表面60m²·g^-1，孔容0.36cm³·g^-1，孔径30nm(硅珠A)和β-CD-M₂键合硅珠A进行扫描电镜扫描，得到放大5000倍、10000倍、50000倍的扫描结果如图23a、图23b、图23c、图23d、图23e、图23f所示。规格为比表面380m²·g^-1，孔容0.70cm³·g^-1，孔径10nm(硅珠B)和β-CD-M₂键合硅珠B进行扫描电镜扫描，得到放大5000倍、10000倍、50000倍的扫描结果如图24a、图24b、图24c、图24d、图24e、图24f所示。分别进行对照，硅珠A，B键合β-CD-M₂后表面明显出现了比较多的不同于纯硅珠A，B的其它物质，直观地说明了β-CD-M₂键合到了硅珠B上。

1.2.3X-射线光电子能谱

分别扫描硅珠A、硅珠B、β-CD-M₂键合硅珠A、β-CD-M₂键合硅珠B的X-射线光电子能谱，得到结果如图25、图26、图27，由图可知，硅珠A中O1s结合能为531.48eV，Si2p为103.58eV；硅珠B中O1s结合能为531.81eV，Si2p为103.68eV；β-CD-M₂键合硅珠A的XPS图谱显示C1s结合能为284.62eV，O1s结合能为530.65eV，S2p为153.66eV，Si2p为102.91eV；β-CD-M₂键合硅珠B的XPS图谱显示C1s结合能为284.62eV，O1s结合能为543.32eV，N1s峰因强度比较小未标识，结合能为400.85[见图28(c)]，S2p结合能为166.84eV，Si2p为115.8eV。说明β-CD-M₂成功键合到了硅珠A和硅珠B的表面。

对比图28和图29中两种硅胶键合β-CD-M₂固定相的光电子能谱，在β-CD-M₂键合硅珠A中S的峰面积为10734.44，N峰不明显；β-CD-M₂键合硅珠B中S的峰面积为19460.42，N峰面积为798.65。表明硅珠A表面键合β-CD-M₂的键合量少于β-CD-M₂在硅珠B表面的键合量。即β-CD-M₂在孔径大、比表面小的硅珠上β-CD-M₂的键合量明显低于在孔径小、比表面大的硅珠上的键合量。

3.2β-CD-M₂用做HPLC固定相制备替卡西林单一对映体

色谱条件：色谱柱：β-CD-M₂键合硅珠A硅胶柱(Φ4.6mm×250mm)，替卡西林二钠水溶液10mg·mL^-1，柱温23℃，流速1ml·min^-1，检测波长230nm。

3.2.1β-CD-M₂用做HPLC固定相考察替卡西林分离条件

1、甲醇-5mmol·L^-1磷酸盐缓冲液为流动相考察替卡西林分离情况

以甲醇(A)-5mmol·L^-1磷酸二氢钾+5mmol·L^-1磷酸氢二钾(Ph＝7)水溶液(B)为流动相，流动相配比如表所示，流速1ml·min^-1，柱温23℃，检测波长230nm，进样量5μL，得到一系列色谱分离结果。由表1可知，当甲醇比例增至60％上，两对映体达到基线分离。

表1甲醇-5mmol·L^-1磷酸盐缓冲液为流动相分离替卡西林

2、甲醇-三缓冲液(15mmol·L^-1四正丁基溴化铵-3mmol·L^-1磷酸氢二钾-3mmol·L^-1磷酸二氢钾水溶液)为流动相分离替卡西林

以甲醇(A)-15mmol·L^-1四正丁基溴化铵(B)-3mmo l·L^-1磷酸氢二钾(C)-3mmol·L^-1磷酸二氢钾(D)水溶液为流动相，流动相配比如表所示，流速1ml·min^-1，柱温23℃，检测波长230nm，进样量10μL，从表2数据可知，当流动相中甲醇的体积达到88％时，达到基线分离。

表2甲醇-三缓冲液为流动相分离替卡西林

3、甲醇-50mmol·L^-1磷酸水溶液为流动相分离替卡西林

以甲醇(A)-50mmol·L^-1磷酸水溶液(B)为流动相，流动相配比如表所示，流速1ml·min^-1，柱温23℃，检测波长230nm，进样量10μL，如表3所示。当流动相中甲醇体积比在60％以上时，达到基线分离。

表3甲醇-50mmol·L^-1磷酸水溶液为流动相分离替卡西林

4、乙腈-50mmol·L^-1磷酸二氢钾水溶液为流动相分离替卡西林

以乙腈(A)-50mmol·L^-1磷酸二氢钾水溶液(B)为流动相，流动相配比如表(A-B)所示，流速1ml·min^-1，柱温23℃，检测波长230nm，进样量10μL，由表4数据可知，替卡西林在以上各流动相配比条件下全部达到基线分离，随着流动相中乙腈体积比的增加，峰形变尖锐，峰宽变窄，洗脱强度变大，分离时间明显缩短。

表4乙腈-0.05mol·L^-1磷酸二氢钾水溶液为流动相分离替卡西林

3.2.2用β-CD-M₂半制备HPLC柱制备替卡西林单一对映体

采用甲醇-磷酸水溶液作为流动相可以避免盐析现象的发生；乙腈-磷酸二氢钾水溶液作为流动相，可以选择比较低的有机溶剂浓度。故选择上述两种流动相制备替卡西林单一对映体。

1、70％甲醇-30％50mmol·L^-1磷酸水溶液流动相制备替卡西林单一对映体

综合考虑分离度和分离时间因素，确定比例为70％甲醇-30％50mmol·L^-1磷酸水溶液作为制备色谱流动相。色谱条件：色谱柱：β-CD-M₂键合硅珠A硅胶柱(Φ10mm×150mm)，替卡西林二钠水溶液10mg·mL^-1，柱温23℃，流速2ml·min^-1，检测波长230nm，进样量500μL。制备分离结果见图30。分别收集6.75-9.20min、21.31-28.94min之间的组分，处理后测定其旋光性，21.31-28.94min之间组分旋光性为“+”，可知前锋为(-)替卡西林，后峰为(+)替卡西林。

对收集的替卡西林前锋(6.75-9.20min)、后峰(21.31-28.94min)收集液用HPLC进行验证，得到结果如图31，结果表明，收集到的替卡西林前锋和后峰都是单一峰。

分离后得到的收集液经冷冻干燥后，得到含有磷酸盐的替卡西林单一对映体固体盐，采用HPLC和HPCE进行检测。可知均为单一HPCE电泳峰或液相色谱峰。

2、21％乙腈-79％50mmol·L^-1磷酸二氢钾流动相制备替卡西林单一对映体

综合考虑峰型较好、分离度大、分离时间短等因素，确定比例为21％乙腈-79％50mmol·L^-1磷酸二氢钾水溶液做为制备色谱流动相。色谱条件：色谱柱：β-CD-M₂键合比表面60m²·g^-1、孔容0.36cm³·g^-1、孔径30nm、粒径5μm硅胶柱(Φ10mm×150mm)，替卡西林二钠水溶液10mg·mL^-1，柱温23℃，流速2ml·min^-1，检测波长230nm，进样量500μL。对收集的替卡西林前锋(9.76-11.47min)、后峰(12.60-15.27min)收集液用分析型HPLC进行验证，得到结果如图32所示。结果表明，收集到的替卡西林前锋和后峰都是单一峰(图中倒峰为水峰)。

实施例二手性药物替卡西林单一对映体的含量测定新方法

1、用β-CD-M₂HPLC柱测定替卡西林单一对映体组分线性范围

配制不同浓度的替卡西林二钠溶液(对照品，98％)溶液，C(mg·mL^-1)分别为：0.01、0.05、0.1、0.5、1、3、5、10、30、50，以β-CD-M₂键合硅珠A为固定相，柱型Φ4.6mm×250mm，柱温23℃，70％甲醇-30％50mmol·L^-1磷酸水溶液为流动相，流速1ml·L^-1，检测波长230nm，进样量20μL，在此色谱条件下测定替卡西林的分离线性范围，分别考察峰面积-浓度、峰高-浓度标准曲线，得到结果如图33所示，前峰(-)替卡西林(t_R＝4.72min)峰面积-浓度标准曲线方程为y＝338.00047x，相关系数R＝0.99984，峰高-浓度标准曲线方程为y＝2.73079x，相关系数R＝0.99964；后峰(+)替卡西林(t_R＝11.79min)峰面积-浓度标准曲线方程为y＝6230.70769x，相关系数R＝0.9999，峰高-浓度标准曲线方程为y＝22.63206x，相关系数R＝0.99562。

2、用β-CD-M₂做HPLC固定相测定替卡西林单一对映体组分精密度

在上述色谱条件下测定5mg·mL^-1替卡西林二钠中两组分精密度，进样次数n＝8，分别以峰面积和峰高为考察参数，得到结果如表5所示。

精密度考察结果为(-)替卡西林峰高相对标准偏差为3.85％，(-)替卡西林峰面积相对标准偏差为5.18％；(+)替卡西林峰高相对标准偏差为1.58％，(+)替卡西林峰面积相对标准偏差为1.81％。

表5替卡西林中各组分精密度

还可以将β-CD-M₂作为手性添加剂，采用高效毛细管电泳(HPCE)分离替卡西林，考察了硼砂-硼酸缓冲液pH、手性添加剂浓度、分离电压、缓冲液浓度对分离的影响，得到最佳分离条件；替卡西林二钠浓度在0.01-10mg·mL^-1L范围内有较好的线性分离，以峰高为考察参数(n＝7)，RSD％为2.41-4.27％，以峰面积为考察参数(n＝7)，RSD％为3.00％-5.23％。

采用HPLC以β-CD-M₂手性固定相法分离分析替卡西林影响因素相对比较少，精密度测定RSD％为1.81-5.18；采用HPCE以β-CD-M₂手性添加剂法对替卡西林进行分离分析，精密度测定RSD为2.41％-5.23％。

实施例三硝基苯胺位置异构体的含量测定新方法

在β-CD-M₂键合比表面60m²·g^-1、孔容0.36cm³·g^-1、孔径30nm、粒径5μm硅珠(A柱)；β-CD-M₂键合比表面380m²·g^-1、孔容0.70cm³·g^-1、孔径10nm、粒径5μm硅珠(B柱)上考察硝基苯胺位置异构体的分离情况。A柱正相模式下以正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇为流动相分离硝基苯胺，合适的流动相配比能使硝基苯胺达到基线分离，洗脱顺序为邻-间-对，反相模式下以水-甲醇为流动相分离硝基苯胺，洗脱顺序为间-对-邻；B柱正相模式下以正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇为流动相和反相模式下以水-甲醇为流动相均未能使硝基苯胺达到基线分离，正相模式下洗脱顺序为邻-间-对，反相模式下洗脱顺序为间-邻-对。表明不同的键合基质对硝基苯胺分离影响不同，选择分离效能佳的A柱进行定量分析。

A柱以70％正己烷-30％异丙醇为流动相邻、间、对硝基苯胺的线性范围为：邻硝基苯胺为5×10^-6～1×10^-2mol·L^-1，相关系数R＝0.99994；间硝基苯胺为5×10^-6～2×10^-2mol·L^-1，相关系数R＝0.9999；对硝基苯胺为5×10^-5-8×10^-2mol·L^-1，相关系数R＝0.99981。模拟混合样中邻、间、对硝基苯胺的精密度(n＝8)，以峰高为考察参数，邻硝基苯胺RSD％为1.25％，间硝基苯胺RSD％为0.89％，对硝基苯胺RSD％为1.96％，以峰面积为考察参数，邻硝基苯胺RSD％为1.04％，间硝基苯胺RSD％为1.72％，对硝基苯胺RSD％为4.32％，模拟混合样中邻、间、对硝基苯胺的加标回收率：对硝基苯胺可达96.08％-102.45％。在该色谱条件下邻、间、对硝基苯胺的检测限，邻、间硝基苯胺的检出限为1.38×10^-8g，对硝基苯胺的检出限为1.38×10^-7g。

实施例四涂敷型HPLC柱分离手性化合物α-苯乙醇

利用空的150×4.6mm不锈钢柱，以涂敷型硅胶固定相为填料装填的色谱柱(以下简称柱C)来分离手性物质。(α-苯乙醇)

考察色谱条件对α-苯乙醇的分离情况

1、改变流动相配比

柱温25℃，流速为1ml/min，检测波长254nm，当流动相为100％正己烷时，α-苯乙醇在此条件下不能分离。当加入少量无水乙醇时色谱此时的色谱分离情况有改善，当流动相为99％正己烷-1％无水乙醇，α-苯乙醇(1.0×10^-3M)的进样量为1ul，分离如图34(仪器：岛津LC-14A)：由图34可知在此条件下α-苯乙醇能达到基线分离。

2、改变温度

选择流动相组成为99％正己烷-1％无水乙醇，柱温25℃变化到40℃，α-苯乙醇(1.0×10^-3M)的进样量为1ul。可看出27℃条件下两对映体分离度R最大，如图35所示。

实施例五、键合型HPLC柱的分离手性化合物1-苯丙醇

下面用空的250×4.6mm不锈钢柱，以键合型硅胶固定相为填料装填的色谱柱(以下简称柱D)来分离手性物质。分别考察不同流动相组成、流动相的配比、柱温、流速等因素对1-苯丙醇分离的影响。色谱条件：检测波长225nm，流动相正己烷-甲醇，流速1ml.L^-1，1-苯丙醇浓度为0.1mol.L^-1，进样量为5μl，柱温为23℃。仪器：日立LC-7000。(1-苯丙醇)

1、考察正己烷与甲醇比例对分离情况影响

通过考察流动相配比(100％；99％；98％；97％；96％正己烷)结果可以看出，在99％正己烷-1％甲醇流动相下1-苯丙醇分离度可达2.83。实现了基线分离。如图36。

2、考察柱温对色谱分离情况影响

选择色谱条件为：99％正己烷-1％甲醇流动相，流速为1ml.L^-1，检测波长225nm.柱温分别选择24℃、27℃、30℃、33℃、37℃、40℃。考察柱温对手性物质1-苯丙醇的分离。30℃时流动相对两对应异构体基本达到基线分离，即达99.7％以上(分离度R≈1.5)，故选择在30℃时分离较好。如图37所示。

3、考察流速对色谱分离情况影响

选择在99％正己烷-1％甲醇流动相，检测波长225nm.柱温为23℃，改变不同的流速(2.0、1.5、1.0、0.7、0.4、0.1mL/min)所得结果可知，随着流速的减小，保留时间增加，两对映异构体保留时间差也越大，这样就能更好地制备、获取单一对映体组分创造了条件。以下是流速为1.0和0.05mL/min的色谱图分别如图38所示。

实施例六、键合型HPLC柱构建反相色谱体系分离手性物质扁桃酸

用甲醇-0.3％TEAA作为流动相，在此条件下扁桃酸有了部分分离。仪器：日立LC-7000。(扁桃酸)，柱温26℃，流速0.5ml/min流动相95％甲醇-5％0.3％TEAA pH5.5缓冲液的色谱分离图，如图39所示。