人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点RNA及用途

摘要

本发明公开了一种人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点RNA及用途，具体提供了人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点RNA(RNA interference，RNAi)，干扰靶点的短发夹RNA(short-hairpin RNA，shRNA)、shRNA编码的小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)、编码shRNA的正义链DNA及反义链DNA、编码shRNA的重组质粒，以及它们在制备治疗黑色素瘤疾病药物中的用途。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，涉及属于人源lncRNA的一种新型lncRNA、其RNA干扰(RNA interference，RNAi)靶点序列和短发夹RNA(short-hairpin RNA，shRNA)序列、shRNA编码的小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)、编码shRNA的正义及反义链DNA、编码shRNA的真核重组质粒、以及在制备诊断黑色素瘤疾病试剂及制备治疗黑色素瘤疾病药物中的用途。

背景技术

人体中编码蛋白质的基因大约有2-3万个，仅占人类基因组的2％，其余98％不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾，通常被称为“垃圾DNA”(junk DNA)。但目前的研究表明，这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA、miRNA、piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt)和长ncRNA(long ncRNA，lncRNA，≥200nt)。目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对lncRNA的研究还处于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子，lncRNA不能被翻译成蛋白质，他们通常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能，如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等，越来越多的证据表明lncRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现lncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，起肿瘤抑制基因作用的lncRNA表达下降或者缺失会导致肿瘤的发生，已经发现lncRNA与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关。这些研究结果都表明lncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用，肿瘤相关lncRNA的发现可能会对肿瘤的诊断及基因治疗产生重大的影响。通过大范围分析肿瘤和正常组织的lncRNA，可以鉴定与肿瘤特异相关的lncRNA，使其成为潜在的病理诊断标记。通过引入针对具有癌基因特性的lncRNA的shRNA可以有效地表达特异性的siRNA并抑制lncRNA作用的发挥，比其他的治疗手段的毒副作用会更低。相反，通过病毒载体或质粒载体过表达具有肿瘤抑制基因作用的lncRNA，进而抑制其调控的特定靶基因的表达，也可以达到抑制肿瘤生长的效果。因此，发现肿瘤特异性表达的lncRNA对基于lncRNA的肿瘤诊断和治疗具有十分重要的意义。

发明内容

恶性黑色素瘤是一种产生黑色素的高度恶性肿瘤。恶性黑色素瘤多发于欧美白种人，发病率占全部恶性肿瘤的1％-3％，但呈明显上升趋势，针对恶性黑色素瘤的诊断和治疗的生物分子的发现具有重要的应用价值。本发明的目的是提供一种人黑色素瘤细胞相关相关的长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)-lncRNA-HN3、其RNA干扰(RNA interference，RNAi)靶点RNA和短发夹RNA(short-hairpin RNA，shRNA)、shRNA编码的小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)、编码shRNA的正义及反义链DNA及转录shRNA的重组质粒；本发明的再一目的是提供所述人黑色素瘤细胞相关的lncRNA及shRNA、siRNA和转录shRNA的重组质粒的用途。

本发明以人恶性黑色素瘤细胞yusac为材料进行与PSF蛋白结合的lncRNA分子的筛选、克隆及分析。采用分子生物学常规技术，从yusac细胞分离获得总RNA，逆转录得到总cDNA并构建yusac细胞的总cDNA文库；通过原核表达及亲和纯化得到带组氨酸标签的His-PSF融合蛋白；用T7RNA聚合酶将cDNA文库中的cDNA插入片段体外转录为RNA混合体；通过组氨酸标签将His-PSF融合蛋白固定于钴离子亲和层析柱上，并将RNA混合体反复过柱，使能够与PSF蛋白结合的RNA吸附于树脂上；将RNA从树脂上洗脱后，经逆转录构建cDNA子文库，文库中富集了编码与PSF蛋白结合的RNA的克隆。挑选文库中的克隆测序，获得基因片段的核酸序列。经过序列分析，我们共得到了数十条RNA分子。经Blast比对及生物信息学分析，发现一条长236nt的lncRNA序列，其编码序列位于HN基因的3’端转录非编码区(Untranslated Regions，UTR)，命名为lncRNA-HN3。此lncRNA序列通过RT-PCR及测序的方法获得证实，并构建了这条lncRNA的质粒表达载体。针对获得的lncRNA序列，找到了RNAi的靶点序列，构建了表达shRNA序列的质粒载体，当其被导入哺乳动物细胞后可转录产生shRNA，shRNA分子在细胞内通过酶加工后形成成熟的并发挥RNAi功能的siRNA。最后，对此lncRNA序列及对应的shRNA序列对人黑色素瘤细胞的恶性生长的影响进行了分析。

本发明所提供的lncRNA序列克隆自人恶性黑色素瘤细胞yusac，定量PCR检测结果表明此lncRNA在恶性黑色素瘤组织中高表达，而在癌旁组织中低表达。构建lncRNA-HN3的质粒表达载体，并转染人黑色素瘤细胞yusac，结果表明lncRNA-HN3在黑色素瘤细胞中的过表达能明显刺激黑色素瘤细胞的恶性生长。构建lncRNA-HN3的shRNA质粒表达载体，并转染人黑色素瘤细胞yusac，结果表明在黑色素瘤细胞中表达lncRNA-HN3对应的shRNA能明显降解细胞内源性lncRNA-HN3并抑制黑色素瘤细胞的恶性生长。基于上述工作本发明得以完成。

具体地说，本发明所提供了一种人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA(lncRNA-HN3)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，或与序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，或为序列表中SEQ IDNO：1所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。

基于上述人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA，本发明提供的lncRNA-HN3的RNA干扰(RNAi)靶点，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，或与序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列90％以上同源性，或为序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的序列核苷酸。

基于上述lncRNA-HN3RNA干扰(RNAi)靶点，本发明提供的RNAi的短发夹RNA(shRNA)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，或与序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列90％以上同源性，或为序列表中SEQ IDNO：3所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的序列核苷酸。

本发明提供的人黑色素瘤细胞相关的的长非编码RNA的RNA干扰靶点的小分子干扰RNA(siRNA)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，或与序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列90％以上同源性，或为序列表中SEQ ID NO：4所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的序列核苷酸。

对于上述短发夹RNA(shRNA)的编码正义链DNA和反义链DNA，所述正义链DNA其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，或与序列表中SEQIDNO：5所示的核苷酸序列90％以上同源性，或为序列表中SEQ ID NO：5所示核苷酸序列经硫代修饰得到的序列核苷酸；所述反义链DNA其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，或与序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列90％以上同源性，或为序列表中SEQ ID NO：6所示核苷酸序列经硫代修饰得到的序列核苷酸。

本发明所述转录短发夹RNA的真核重组质粒，由编码人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段与真核表达载体构建而成。

本发明所提供的人源lncRNA-lncRNA-HN3的编码DNA序列定位于人线粒体基因组2710-2945位核苷酸。

本发明提供的lncRNA序列，lncRNA的RNAi靶点序列，lncRNA的RNAi靶点的shRNA序列，RNAi靶点shRNA编码的siRNA序列，及编码shRNA的DNA序列既可通过生物学方法获得，又可通过化学合成方法获得，若通过化学合成方法制备，只要将其核苷酸序列提供给有关专业公司，委托其合成即可。为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行硫代修饰或甲氧基修饰等。

本发明提供的人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA(lncRNA-HN3)，包括与其90％以上同源的核苷酸序列，或经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列，可用于制备诊断黑色素瘤疾病的试剂，并且，其RNAi靶点、RNAi靶点shRNA序列及其表达载体、RNAi靶点shRNA编码的siRNA可用于制备治疗黑色素瘤疾病的药物。例如以其单独或混合形式为有效组分配制成非肠道给药制剂，依据给药模式、受者年龄、体重、疾病程度等以适量剂量给药；也可以采用基因治疗的方法，以质粒或腺病毒为表达载体，使其在癌变部位高效表达。

附图说明

图1是定量PCR检测本发明所述lncRNA-HN3在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中表达的结果图。

图2是对单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1进行软琼脂集落生长检测的结果图。

图3是将单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1注入裸鼠后的实验结果图，图中，1-1和1-2为第1只裸鼠的移植瘤，2-1、2-2为第2只裸鼠的移植瘤，3-1、3-2为为第3只裸鼠的移植瘤。

图4是本发明所述lncRNA-HN3在对照细胞株yusac-shLUC和稳定低表达细胞株yusac-shHN3中的表达情况图，图中，1泳道为lncRNA-HN3在对照细胞株yusac-shLUC中的表达，2泳道为lncRNA-HN3在稳定细胞株yusac-shHN3中的表达。

图5是对稳定细胞株yusac-shHN3和对照细胞株yusac-shLUC进行软琼脂集落生长检测的结果图。

图6是将稳定细胞株yusac-shHN3和对照细胞株yusac-shLUC注入裸鼠后的实验结果图，图中，1-1和1-2为各实验组中第1只裸鼠的移植瘤，2-1、2-2为各实验组中第2只裸鼠的移植瘤，3-1、3-2为各实验组中第3只裸鼠的移植瘤。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。下属实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，Freshney著的动物细胞培养：基本技术指南第五版(John Wiley&Sons，Inc，2005)中所述的条件及实验步骤，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。

实施例1：lncRNA-HN3的克隆与分析

1、试剂

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；MMLV逆转录酶、DNA聚合酶、pfu酶、Nde I酶、Xho I酶、RNase抑制剂均购自立陶宛Fermentas公司；T7RNA聚合酶购自美国NEB公司；随机引物购自美国Promega公司；TALON金属离子树脂购自美国BD Clontech公司；PCR引物由Invitrogen公司合成。

2、菌株、细胞株和载体

人恶性黑色素瘤细胞yusac购自美国标准菌种收藏所(ATCC)；E.coli BL2菌株购自天津天有利科技有限公司；PCR-blunt-TOPO载体购自美国Invitrogen公司；pET-28a(+)载体购自德国Novagen公司。

3、实验方法

3.1人恶性黑色素瘤细胞yusac总cDNA文库的构建

3.1.1yusac细胞总RNA的提取

1)人恶性黑色素瘤细胞yusac培养至75％汇合度，加入1mL Trizol试剂，用枪头吹打混匀；

2)用5mL 1次性注射器吹打10次进行匀浆，将匀浆样品在室温孵育5min；

3)加0.2mL氯仿，盖紧Ep管盖，用手振荡15s并于室温孵育2-3min；

4)4℃，12,000×g离心15min；

5)将水相层转移到1干净的1.5mLEp管中，加入0.5mL异丙醇及20μg糖原，颠倒混匀，将混匀后的样品于室温孵育10min；

6)4℃，12,000×g离心10min。倒掉上清液，用75％的乙醇1mL洗涤RNA沉淀1-2次，旋涡振荡混合样品后，4℃，7,500×g离心5min；

7)倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀10min，加入50μL无RNA酶的H₂O，并于55℃孵育5min，以使RNA充分溶解，于260nm测定RNA浓度。

3.1.2逆转录(RT)

在500μL EP管中加入以下组分：

yusac细胞RNA 10μL

随机引物(10μmol/L)1μL

H₂O 18μL

混匀后70℃温育5min，迅速置冰浴中，静置3min后加样如下：

RNase抑制剂1μL

dNTP(10mmol/L)1μL

5×逆转录酶缓冲液8μL

MMLV逆转录酶1μL

混匀后42℃温育1h，70℃10min灭活逆转录酶，-20℃保存样品。

3.1.3yusac细胞总cDNA文库的构建

将本实施例3.1.2所得单链cDNA经DNA聚合酶及pfu酶处理得到平末端双链cDNA(操作步骤见DNA聚合酶、pfu酶操作手册)。所得平末端双链cDNA连接到PCR-blunt-TOPO载体上，构建yusac细胞总cDNA文库。

3.2带组氨酸标签His-PSF融合蛋白的原核表达及亲和纯化

3.2.1多聚酶链式反应(PCR)扩增PSF基因的编码序列(Coding Sequence，CDS)

反应体系为：

PCR缓冲液(10×)5μL

MgCl₂(2.5m mol/L)2.5μL

dNTP(2.5m mol/L)1.0μL

上游引物(10μmol/L)0.5μL

下游引物(10μmol/L)0.5μL

pcDNA3.1-PSF(连接位点为EcoR I和EcoRV)0.1μL

Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.1μL

Pfu DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL

ddH₂O 40μL

矿物油30μL

反应参数为：94℃1min(预变性)；94℃30sec(变性)，65℃30sec(复性)，72℃2min(延伸)，所述变性-复性-延伸23个循环；72℃10min(终延伸)。

引物序列如下：

上游引物(FP)：5’ATATTACCATATGTCTCGGGATCGGTTCCGG-3’(下划线标示Nde I酶切位点)

下游引物(RP)：5’-GGGCTCGAGCTAAAATCGGGGTTTTTTGTT-3’(下划线标示Xho I酶切位点)

3.2.2His-PSF融合蛋白的原核表达载体的构建

将PSF的编码序列通过Nde I和Xho I酶切位点克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点区，得到重组质粒pET-28a(+)-PSF(载体多克隆位点区末端自带组氨酸His标签)。

3.2.3His-PSF融合蛋白的原核表达

1)将本实施例3.2.2所得重组质粒pET-28a(+)-PSF转化到E.coli BL21菌株中；

2)接种转化了重组质粒pET-28a(+)-PSF的E.coli BL21单菌落于LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃震荡培养；

3)检测菌液OD₆₀₀至0.6-0.7时加入1.0mmol/L IPTG，并将温度调至25℃，诱导培养过夜。

3.2.4His-PSF融合蛋白的亲和纯化

1)离心收集菌体，菌体经PBS缓冲液(140mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，

5mmol/LNa₂HPO₄，1.8mmol/LKH₂PO₄及5mmol/LEDTA，pH7.2)洗涤后重新悬浮于20mL PBS(含0.5mol/L NaCl，1mmol/L PMSF及1mmol/L DTT)；

2)冰浴超声破壁，13,000×g离心30min收集上清；

3)沉淀以相同步骤重复处理一次，合并两次上清收集液，得到蛋白粗提液；

4)将TALON金属离子亲和树脂(BD Clontech)用平衡-洗涤缓冲液(250mmol/LNa₃PO₄，1.5mol/LNaCl，pH7.0)预平衡；

5)加适量蛋白粗提液于预平衡后的TALON金属离子亲和树脂，轻柔摇晃1.5hrs；

6)加入平衡-洗涤缓冲液(含有10mmol/L咪唑)洗涤树脂两次；

7)用平衡-洗涤缓冲液(含有250mmol/L咪唑)洗脱树脂上结合的His-PSF重组蛋白；

8)洗脱得到的重组蛋白用50倍体积的透析缓冲液(20mM Hepes，20％glycerol，100mM KCl，0.2mM EDTA，0.2mM PMSF，0.5mM DTT，pH7.9)在4℃透析过夜，中途更换透析缓冲液一次；

9)得到的透析产物用液氮速冻，1hrs后长期冻存于-80℃；

3.3PSF蛋白结合RNA的筛选及编码PSF结合RNA的cDNA子文库的构建

利用组氨酸标签将原核重组质粒表达的His-PSF融合蛋白结合于TALON金属离子树脂上，用T7RNA聚合酶将yusac细胞总cDNA文库中的cDNA插入片段体外转录为RNA混合体，RNA混合体通过5次反复过柱，使能够与His-PSF蛋白结合的RNA吸附于树脂上；将RNA从树脂上洗脱，逆转录合成cDNA，将cDNA连接到PCR-blunt-TOPO载体(Invitrogen)上构建cDNA子文库，文库中富集了编码与His-PSF蛋白结合的RNA的克隆，挑取阳性克隆克隆测序。

3.4所获克隆序列的分析

克隆测序获得序列对人基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST分析，并找到它们在人染色体上的精确定位(http://genome.ucsc.edu/)。挑选出≥200bp且位于基因组非蛋白质编码区的序列。其中获得一条236nt的lncRNA序列，其序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，定位于线粒体基因组的2710-2945位核苷酸，由HN基因的3’UTR编码，命名为lncRNA-HN3。

3.5lncRNA-HN3的RT-PCR鉴定

使用Trizol试剂从人恶性黑色素瘤组织提取总RNA(方法同本实施例3.1.1)，按照常规RT-PCR方法检测lncRNA-HN3在人恶性黑色素瘤组织中的表达。

3.5.1RT(方法同本实施例3.1.2)获得黑色素瘤组织cDNA

3.5.2PCR

反应体系为：

PCR缓冲液(10×)2.5μL

dNTP(2.5mmol/L)1.0μL

上游引物(10μmol/L)1.0μL

下游引物(10μmol/L)1.0μL

黑色素瘤组织cDNA 0.3μL

DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL

ddH₂O 19μL

反应参数均为：94℃3min(预变性)；94℃30sec(变性)，64℃30sec(复性)，72℃60sec(延伸)，所述变性-复性-延伸30次循环。

引物序列如下：

5’-cacagcaagacgagaagaccc-3’

5’-cgctgttatccctagggtaac-3’

RT-PCR扩增获得的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

实施例2：定量PCR检测lncRNA-HN3在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中的表达

1、试剂、菌株、细胞株和载体

采用常规的试剂、菌株、细胞株和载体，均与实施例1相同。

QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒购自德国Qiagen公司。

2、实验方法

2.1.1合成的总cDNA

以人黑色素瘤组织及对应癌旁组织为材料，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总RNA(方法同实施例1中的3.1.1)。将黑色素瘤组织总RNA和对应癌旁组织总RNA各取1μg，用随机引物进行逆转录反应(方法同实施例1中的3.1.2)获黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总cDNA，合成的黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总cDNA即为定量PCR反应的模板。

2.1.2用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR反应

以本实施例2.1.1所得黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总cDNA为PCR反应的模板，设计特异于lncRNA-HN3序列的引物(引物序列为5’-gcaagacgagaagaccctatg-3’和5’-agtagttcgctttgactggtga-3’)，用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR反应。

2.1.3实验结果

黑色素瘤组织及癌旁组织lncRNA-HN3的表达情况见图1，图1中1，3，5，7为对应的黑色素瘤癌旁组织；2，4，6，8为黑色素瘤组织。从图1可以看出，lncRNA-HN3在黑色素瘤组织中高表达而在癌旁组织中低表达。实验结果表明，lncRNA-HN3在黑色素瘤组织和癌旁组织中的表达水平存在明显差异，因而lncRNA-HN3在黑色素瘤的发生发展过程中具有重要的生物学功能。

实施例3：lncRNA-HN3的过量表达促进黑色素瘤细胞的恶性生长特性

1、试剂、菌株、细胞株和载体

采用常规的试剂、菌株、细胞株和载体，与实施例1相同。

pcDNA-3.1真核表达载体、lipofectamine 2000转染试剂、G418抗生素均购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibico公司；硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium，NBT)购自美国Sigma公司。

Perfection 4990平板式扫描仪购自日本Epson公司。

BALB/c裸鼠，SPF(Specific Pathogen-free，无特定病原体)级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

2、实验方法

2.1稳定高表达lncRNA-HN3的单克隆细胞株的构建

2.1.1构建lncRNA-HN3的真核重组质粒pcDNA-lncRNA-HN3

将原本克隆于PCR-blunt-TOPO载体上的编码lncRNA-HN3的DNA序列(由实施例1的3.3和3.4获得)重新连接到真核表达载体pcDNA-3.1的Nhe I和Apa I酶切位点，构建lncRNA-HN3的真核重组质粒pcDNA-lncRNA-HN3。

2.1.2构建单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3

用含10％胎牛血清的DMEM培养基将人黑色素瘤细胞yusac培养于5％CO₂的37℃培养箱中。转染前一天于6孔板中接入1×10⁶个细胞/孔，用lipofectamine2000进行转染，每孔转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-HN3 3μg。细胞转染24小时后用浓度为700mg/L的G418连续筛选1-2周，得到稳定转染的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3。同时以空载体pcDNA-3.1稳定转染yusac细胞(见lipofectamine 2000说明书)，得到对照细胞株yusac-pcDNA3.1。

2.1.3单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-HN3的表达量检测

以常规半定量RT-PCR检测各单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-HN3的表达量，挑选得到lncRNA-HN3表达量最高的稳定黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3。并以转入空真核表达载体pcDNA-3.1的黑色素瘤细胞株yusac-pcDNA3.1作为对照。

50μL半定量PCR反应体系，其组分为：

PCR缓冲液(10×)5μL

MgCl₂(25mM)5μL

dNTP(2.5mmol/L)1.0μL

上游引物(10μmol/L)0.5μL

下游引物(10μmol/L)0.5μL

模板(yusac-lncRNA-HN3或yusac-pcDNA3.1的cDNA)2μL

DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL

ddH₂O 35.6μL

所有PCR的反应参数为：94℃3min(预变性)；94℃30ec(变性)，64℃30s ec(复性)，72℃60sec(延伸)，所述变性-复性-延伸×n cycles。循环次数根据PCR反应的起跳点确定，一般情况下，每次具体的PCR反应较起跳点多1-2个循环。

2.2软琼脂集落生长检测

在6孔板中用1mL含0.6％琼脂糖、700mg/LG418及10％胎牛血清的DMEM培养基铺设下层琼脂；待下层琼脂凝固后，将本实施例2.1.2构建的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的黑色素瘤细胞株分别以5×10³个细胞/孔的数量接入1mL含0.3％琼脂糖、700mg/LG418及10％胎牛血清的DMEM培养基，混匀后铺设上层琼脂；待上层琼脂凝固后，培养于5％CO₂的37℃培养箱中培养。2周后，加入400μL 1.25g/L的硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium，NBT)染色液，置于5％CO₂的37℃培养箱中孵育过夜，透射扫描仪扫描的图像见图2。

图2表明，与转染空真核表达载体pcDNA-3.1的yusac细胞相比，转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-HN3的yusac细胞稳定过量表达lncRNA-HN3可以显著促进黑色素瘤细胞yusac的集落性生长，增强了yusac细胞的体外恶性生长特性。

2.3裸鼠移植瘤生长检测

实验裸鼠为5周龄裸鼠，分成两组，每组3只，一组用于注射本实施例2.1.2构建的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3，一组用于注射本实施例2.1.2构建的转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照黑色素瘤细胞株yusac-pcDNA3.1。

将单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3和对照黑色素瘤细胞株yusac-pcDNA3.1分别以5×10⁵个细胞/注射点的剂量对裸鼠进行颈部皮下注射(每只裸鼠2个注射点)，待移植瘤长出后，每3天检测一次大小，移植瘤长出后约一个月，将裸鼠脱颈椎处死，取出肿瘤，3只裸鼠移植瘤的照片见图3。

图3表明，与转染空真核表达载体pcDNA-3.1的yusac细胞相比，转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-HN3的yusac细胞稳定过量表达lncRNA-HN3可以显著促进黑色素瘤细胞yusac的体内成瘤性，增强了yusac细胞的体内恶性生长特性。

实施例4：lncRNA-HN3特异性shRNA抑制黑色素瘤细胞的恶性生长特性

1试剂、菌株、细胞株和载体

采用常规的试剂、菌株、细胞株和载体，与实施例1相同。

正义链DNA和反义链DNA模板由美国Invitrogen公司合成；限制性内切酶BamH I和HindIII均购自立陶宛Fermentas公司；真核表达载体pGenesil-1购自武汉赛晶公司。

2、实验方法

2.1lncRNA-HN3特异性RNA干扰载体的构建

将lncRNA-HN3的序列信息提交siRNA互联网设计工具(www.dharmacon.com)，获得可信度最高的RNAi靶点序列(如序列表中SEQ IDNO：2所示)。根据lncRNA-HN3的RNAi靶点序列设计编码特异性shRNA分子的正义链DNA和反义链DNA模板(如序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示)，将所述正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段克隆进RNA干扰载体pGenesil-1，构建lncRNA-HN3干扰重组质粒。将构建好的lncRNA-HN3干扰重组质粒导入哺乳动物细胞后，能在其中转录出shRNA(如序列表中SEQ ID NO：3所示)，shRNA在动物细胞内被动物细胞固有的Dicer酶进一步切割形成具有RNA干扰功能的siRNA(如序列表中SEQ ID NO：4所示)，从而诱导RNA干扰程序的启动。正义链DNA和反义链DNA模板序列如下：

1)编码lncRNA-HN3RNAi靶点shRNA的正义链DNA：

5′-acaagttaccctagggataTTCAAGAGATATCCCTAGGGTAACTTGTTTTTTT-3′

2)编码lncRNA-HN3RNAi靶点shRNA的反义链DNA：

5′-AAAAAAacaagttaccctagggataTCTCTTGAATATCCCTAGGGTAACTTGT-3′

序列中下划线部分为靶基因的RNAi靶点序列及相应互补序列；方框部分为限制性内切酶BamH I和HindIII的识别位点，用于退火后形成的双链DNA片段克隆进RNA干扰载体；中间未标示部分编码shRNA的茎环(loop)。

2.1.1正义链DNA和反义链DNA的退火

将编码lncRNA-HN3RNAi靶点shRNA的正义链DNA和反义链DNA片段浓度分别调整为250μM，退火形成互补双链DNA分子(经退火处理后5’及3’端分别带有BamH I/HindIII酶切位点)。退火反应条件如下：

shRNA-S模板(250μM)5μL

shRNA-A模板(250μM)5μL

10×退火缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1MNaCl)1.25μLH₂O 1.25μL

混匀，石蜡油覆盖后离心10sec，95℃温育5min，经1-2小时缓慢降温至室温，此时两条寡核苷酸精确退火为寡核苷酸双链(浓度为100μM)；退火后的双链DNA用灭菌水稀释100倍，浓度为1μM。

2.1.2构建lncRNA-HN3干扰重组质粒

将退火形成的双链DNA片段连接到RNA干扰载体pGenesil-1的BamH I/HindIII酶切位点，构建lncRNA-HN3特异性shRNA的真核重组质粒pGenesil-shHN3。连接反应条件如下：

pGenesil载体(约0.005μM)10μL

双链DNA(1μM)0.5μL

10×连接酶缓冲液2μL

H₂O 5.5μL

连接酶2μL

混匀，离心5sec，16℃连接过夜，70℃10min灭活连接酶，-20℃保存样。

2.1.3构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC

构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC的方法同本实施例2.1.1和2.1.2。将负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC导入哺乳动物细胞后转录出萤火虫荧光素酶基因luciferase特异的shRNA-shLUC，其编码DNA序列的正义及反义链分别为

5′-gtagcgcggtgtattatacttcaagagagtataatacaccgcgctactttttt-3′

5′-aaaaaagtagcgcggtgtattatactctcttgaagtataatacaccgcgctac-3′。

2.2稳定低表达lncRNA-HN3的单克隆细胞株的构建

同实施例3中的2.1.2所述方法将获得的真核重组质粒pGenesil-shHN3稳定转染人黑色素瘤细胞yusac，经G418筛选、半定量RT-PCR检测后，获得lncRNA-HN3表达量最低、RNAi效果最好的稳定细胞株yusac-shHN3。同时，以负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC转染yusac细胞，得到对照细胞株yusac-shLUC。lncRNA-HN3在对照细胞株和稳定低表达细胞株中的表达情况见图4。图中(1)为对照细胞株yusac-shLUC，(2)为稳定细胞株yusac-shHN3。图4表明，稳定细胞株中lncRNA-HN3的表达量较对照细胞株明显降低，说明选用的RNAi靶点序列正确无误，shRNA诱导的RNAi效果明显，稳定低表达lncRNA-HN3的单克隆细胞株构建成功。

2.3软琼脂集落生长检测

同实施例3中的2.2所述方法对稳定细胞株yusac-shHN3进行软琼脂集落生长检测(细胞接种量为1×10⁴个细胞/孔)。结果见图5。由图5可知，转染真核重组质粒pGenesil-shHN3降解yusac细胞内源性lncRNA-HN3后，yusac细胞的集落性生长受到了一定程度的抑制，其体外恶性生长特性减弱，而转染对照重组质粒pGenesil-shLUC对yusac细胞的体外恶性生长特性没有影响。这表明lncRNA-HN3特异性的shRNA对黑色素瘤细胞的生长具有抑制作用，并具有治疗黑色素瘤疾病的用途。

2.4裸鼠移植瘤生长检测

同实施例3中的2.3所述方法对yusac-shHN3细胞株进行裸鼠移植瘤生长检测(细胞注射剂量为2×10⁶个细胞/注射点)。结果见图6。由图6可知，转染真核重组质粒pGenesil-shHN3降解yusac细胞内源性lncRNA-HN3后，yusac细胞的体内成瘤性受到了一定程度的抑制，其体内恶性生长特性减弱，而转染对照真核重组质粒pGenesil-shLUC对yusac细胞的体内恶性生长特性没有影响。这进一步表明lncRNA-HN3特异性的shRNA对黑色素瘤的发生发展具有抑制作用，具有治疗黑色素瘤相关疾病的用途。