法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-07-18
授权
授权
2011-03-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20091029
实质审查的生效
2011-02-09
公开
公开
技术领域
本发明属于检测技术领域,涉及一种基因芯片(或称为DNA微阵列)及其检测试剂和试剂盒,尤其涉及一种妊娠期糖尿病易患人群SNP检测和分型的基因芯片及其检测试剂和检测分型试剂盒。
背景技术
妊娠期糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus GDM)是指妊娠期间发生的或首次发现的糖尿病,其发生率世界各国报道为1%~14%。我国GDM的发生率已由1996年的2%增加到2003年的4.6%。现有证据表明:中国女性是患GDM的最危险人群之一。GDM的主要并发症为巨大儿、羊水过多、妊娠期高血压疾病、感染、早产、酮症酸中毒等。且常由于难产而致新生儿头颅血肿、帽状腱膜下血肿、臂丛神经损伤、锁骨骨折等。GDM不但会造成孕妇一系列代谢紊乱,也会造成胎儿、新生儿生长发育异常,甚至在儿童期、青春期以后出现更远期的影响,其中最多见的是糖代谢异常问题。糖尿病母亲所生婴儿出生后极易发生低血糖、器官发育不成熟现象、脏器功能低于实际孕龄、常有脑发育不成熟现象。某些GDM患者的孩子虽然智能发育在正常范围,却存在一些心理行为问题,如自述各种不适的感觉,学习困难,不同程度的焦虑、抑郁等。由外GDM患者产后随访转变为2型糖尿病的发生率为60%~70%,母亲糖尿病带来的短期和长期影响以及不断上升的GDM患病率,使之成为在不远的将来困扰中国人健康的严重问题之一。
在孕期甚至更早期及时加以干预,不仅可以降低甚至消除GDM对母儿的不良影响,可能成为本世纪最重要的医疗预防措施之一。GDM是多基因遗传性疾病,遗传学上称之复杂病(complex disease),它具有下列特点:参与发病的基因不止1个,每个基因的作用程度不同,起主要作用者称为主效基因,作用较小者为次要基因,不同基因之间存在交互作用;各个致病易感基因作用于代谢的不同环节。目前国内外的研究表明下列几种基因可能与2型糖尿病相关,亦有可能与GDM有关:(1)蛋白激酶Cξ亚型基因,用单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)方法发现其rs36045(A/G)与2型糖尿病相关;应用连锁不平衡分析了位于rs36045上、下游共15个SNP的单倍型与2型糖尿病的相关性,结果发现有5个SNP组成的C-G-T-A-G单倍型在病例组显著增多,进一步证实了该基因可能为所研究人群的易感基因;(2)ALDHIAI-E3/56基因, 在糖尿病和非糖尿病人群中,用高频SNP筛查基因型,发现该基因存在非常显著性。该基因可能参与中国汉人2型糖尿病的易感性;(3)编码脂肪细胞分化相关蛋白的基因(ADFP)基因,该基因对脂肪组织的分化和功能非常重要,特别是与脂肪、胰岛素抵抗的形成有关。该基因突变有可能参与胰岛素抵抗和2型糖尿病形成;(4)CAPN10基因,其产物是calpain-10蛋白,它可能与细胞内钙离子介导的信号传导有关。该基因的单核苷酸多态性位点与2型糖尿病发病有关。统计学数据分析,该基因的SNP43与组织胰岛素敏感性及糖负荷过程中胰岛素水平相关,该基因可能为中国人2型糖尿病的相关基因;(5)IL-6基因启动子C-174G的多态性位点与2型糖尿病的发生有很大关联。CC型与GC型相比,IL-6的转录水平更高,使得血清中IL-6水平增高,而IL-6又可以降低体内一些保护因子,如脂联素、瘦素等,从而使得个体更容易发生糖尿病。
基于上述这些基因可能与GDM发生有关,而国内外尚未涉及用基因芯片探针来预测糖尿病高危人群的研究。本专利设计了检测GDM易感人群的基因芯片系统,确立SNP模式和GDM对应关系。通过基因芯片可迅速便捷的对普通人群进行筛查,可在孕早期甚至孕前检查就预测出GDM的高危人群,从而通过饮食控制和运动疗法尽早干预,减轻甚至消除GDM对母儿的近远期影响。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种用于检测GDM易感人群的基因芯片、检测方法以及测试剂和试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种用于GDM易感人群检测与分型的基因芯片,包括固相载体和固定在其上的寡和谷氨酸探针,其中该芯片上的寡核苷酸探针是针对GDM易感SNP位点检测的DNA片段。
上述SNP位点包括:rs1799884、rs2144908、rs1800629、rs361525、rs266729、rs17300539、rs1801278、rs4994和rs12255372。它们的序列具有Seq IDNo.1-No.9所示的核苷酸序列的DNA片段。
一种包含上述基因芯片的检测试剂,该检测试剂还包含用于扩增各GDM相关SNPs的PCR引物,这些PCR引物具有Seq ID No.82-No.90的核苷酸序列。
一种用于GDM易感人群检测与分型的试剂盒,至少包括基因芯片,PCR扩增引物,阴性对照和阳性对照样本。该试剂盒还包括杂交盒,杂交液。
本发明对不同GDM易感相关SNP位点设计特异性探针进行检测,通过基因芯片杂交结果进行判读,预测检测样本疾病易感性。
本发明的有益效果是:本发明用于检测GDM易感人群的基因芯片、检测试 剂和试剂盒构建了筛查GDM各相关基因多态性高危人群的基因芯片检测系统,可快速、准确检测临床样本中的GDM各相关SNPs,通量大、灵敏度高,对于GDM的临床诊断和高危人群早期筛查、早期预防干预有重要的意义,可广泛用于临床高效筛查GDM高危人群。
附图说明
图1为基因芯片的一般制作流程图;图2为PCR扩增流程图。
具体实施方式
以玻璃基质为载体的DNA芯片技术采用的是微量点样DNA微阵列技术,其基本原理如下:DNA探针为含有特定DNA序列的寡核苷酸片段,其末端带有氨基标记。经化学修饰处理的玻璃基质基片带有活化醛基基团,可以与DNA探针附带的修饰氨基共价结合,利用这种方法可将DNA探针按一定的排列规律固定在基片表面。其主要优点是简便易行,能根据使用者的要求简便的制出符合目的的芯片。在此基础上结合PCR技术对微量待测样品进行大量快速扩增,扩增后含有荧光标记物的待测样品与芯片上的探针进行特异性杂交和扫描,此后对杂交信号强弱和有无进行分析,即可判断样品中靶基因的数量和性质,基因芯片的制作流程如图1所示。
本发明的基因芯片包括一基底和固定于该基底上的探针,固定于基片上的探针为可与GDM各相关基因SNP多态性核酸杂交的特异型探针。
本发明的GDM各相关基因SNP多态性核酸选取如下:
表1:GDM各相关基因SNP多态性核酸基因序列表;
GDM各相关基因多态性的特异性探针序列如下:
表2.根据SNP位点和侧翼序列设计SNP检测探针(Seq ID No.10-No.81针对每个SNP位点,正反2条DNA链共设计8条探针):
在上述序列中,针对每一个GDM相关的SNP设计了正、反两条序列。
在上述设计的GDM各相关SNPs的基础上,本领域技术人员可以通过本领域常规方法进行探针合成,并进行5’端Poly(T)和氨基修饰。
在本发明的一个实施方案中,芯片制备通过芯片点样仪进行,将探针溶解在点样液中,根据设定的点样程序进行点样,点样后的基因芯片经过水合和硼氢化钠还原后即可应用于检测。
用于检测样本中GDM各相关性SNPs的检测试剂至少包括一对用于扩增样本中各SNPs的PCR引物以及上述本发明的基因芯片。本发明的PCR引物根据GDM各相关SNPs的特点,利用其各自特异的侧翼序列设计引物,通过9次PCR反应可广谱扩增特异性SNP序列。在本发明的一个较佳实施方案中,设计了如SEQ IDNO.82-90引物序列如下:
表3.根据SNP位点两端的更远侧序列设计的用于PCR扩增的上下游引物(Seq ID No.82-No.90):
引物合成过程中对没对引物之一的5’端预先进行荧光标记,
在使用时,抽提待检测样品的基因组DNA,以每个待检测SNP位点设计上下游引物并进行PCR扩增,在扩增过程中引入荧光标记。荧光标记的核酸靶标分子通过碱基互补配对原则与芯片上的探针杂交,通过芯片扫描获得每个位点的荧光信号。
上述样本处理试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂均可以使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂,这些试剂必要时可以包括在试剂盒中,也可以将其配方列明在试剂盒的说明书中由使用者按照说明书中的指示自行配制。
本发明的试剂盒中还包括相应的阴性对照和/或阳性对照样本。
根据本发明的再一方面,提供一种评估待测样本中GDM各相关SNPs,从而高效筛查GDM高危人群的方法。将来自待检测个体的样本使用本发明的检测试剂检测,通过样本中GDM各相关SNPs的表达情况评估该个体发生GDM甚至今后进展为2型糖尿病的可能性大小。
下面,结合附图,通过对本发明较佳实施方式的描述,详细说明但不限制本发明。
实施例1:GDM各相关SNPs检测芯片的制备
1.生产原材料的厂商、规格
探针序列设计如Seq ID No.10-No.81所示,按照本领域技术人员熟知的方法合成5’端氨基标记探针。
2.芯片制备过程:
(1)将合成的探针溶解于基因芯片点样液中,用SmartArrayTM(CapitalBioCorp.)点样仪点制在一张75×25mm、经过醛基修饰的芯片基片上,干燥后保存。
(2)芯片使用前需经过如下前处理:
1)将芯片置于密闭、100%湿度的湿盒中,37℃过夜处理。
2)将芯片放于0.25%NaBH4溶液中,水平摇床(80rpm)上还原处理5min。
3)在蒸馏水中,水平摇床(80rpm)上清洗5min。
4)重复3)一次。
5)把芯片放置于50ml专门的离心甩干管中,2000rpm离心1min。经如
上处理的芯片即可用于杂交。
实施例2:GDM各相关SNPs检测试剂盒样本检测
临床验证结果表明,本发明的检测系统通量大、灵敏度高,基因芯片技术的引入使得该方法具有与荧光定量PCR相当的灵敏度。具体试剂、检测方法如下:
1.试剂盒组成
其中,PCR Mix1-9含SEQ ID NO.82-90的引物。
2.需配备的仪器及配制的试剂如下:
DNA电泳仪、PCR仪、芯片杂交仪、摇床、0.25%NaBH4溶液。
其他需要的试剂按照以下配方配制:
3、操作步骤
(1)样本收集及保存
GDM易感人群筛查样本主要取外周静脉血样本进行检测。采集的样本在室温放置不超过2小时,4℃保存不超过24小时,-20℃保存不超过3个月。样本应避免反复冻融。
(2)样本处理
将血液样本转移到1.5ml微量离心管中,13000rpm离心10分钟,弃去上清,保留管底的细胞块。
加入50ul裂解液悬浮沉淀,100℃加热10分钟,13000rpm离心10分钟,保留上清待用。
(3)PCR扩增
取PCR反应管,在管壁上做好标记,分别加入已提取的待测样品DNA5μl,反应总体系为25μl。每次实验,必须设置一个阴性对照,即以5μl无菌纯水为模板。
按图2流程进行扩增:
(4)杂交
取同一待检样品的各个PCR扩增产物各2μl混合,经PCR产物纯化试剂盒纯化后,加入杂交液15μl,95℃变性处理3min,冰上放置2min以上后上样于芯片。
(5)芯片清洗
取出芯片,移至装有预热B液的50ml管中,于42℃轻摇洗涤5分钟。
(6)扫描
将芯片放置于扫描仪(LuxScan 10K)中按既定程序扫描。
(7)结果判定
作为对照的杂交点会在PC位置出现绿色荧光信号,提示本次杂交成功;同时其他位点不应该显色,此时结果的判读视为有效。
结果见下表。
膜条上的探针排列顺序
由信号点显现的位置即可断定该患者是否携带GDM各相关SNPs。
机译: 基因芯片,使用基因芯片检测CSFV和BVDV基因的方法以及包含基因芯片的检测试剂盒
机译: 基因芯片,使用基因芯片检测CSFV和BVDV基因的方法以及包含基因芯片的检测试剂盒
机译: TETRANOR-PGDM / PGJM特异性免疫原,抗体,示踪剂,检测试剂盒和制备方法