一种组织工程化的人工视神经导管及其制备方法

摘要

本发明属生物医学工程领域，涉及一种组织工程化的人工视神经导管及其制备方法。本发明包括PLGA细丝编织的中空导管、PGA细丝和转基因雪旺细胞悬液，所述的导管表面涂布壳聚糖聚合体。其中PLGA中空导管构成人工视神经的外部支架；PGA细丝填充在其内构成人工视神经的内部支架。本发明能有效促进损伤视神经轴突的再生，具有持久提供神经营养支持和对再生神经轴突起到引导作用等优点，所述导管的组织相容性和安全性均较好，转染的基因和导管的规格可根据需要调整，能用于视神经再生的实验研究，有望在临床上用于促进损伤视神经的再生修复。

说明书

技术领域

本发明属生物医学工程领域，具体涉及一种组织工程化的人工视神经导管及其制备方法。

背景技术

视神经疾病是眼科临床中常见的一大类疾病，由于损伤后的视神经修复能力很差，常常造成不可逆的后果，导致严重的视力减退和丧失。临床治疗手段有限，治疗效果较差，是目前临床上的一大难题。随着神经科学和材料学的发展，各种组织工程化的人工神经移植物被应用于促进外周神经和中枢神经再生的研究中，用于促进视神经损伤修复或再生的组织工程化导管即人工视神经的研究得到了越来越多的关注。

所谓人工视神经，是将能促进神经再生的种子细胞辅以神经营养因子填充到支架材料上，构成的一个立体管道状结构.人工视神经并非解剖意义的神经组织，其主要作用是为视神经再生提供一个良好的环境，从而在动物实验或临床研究中促进视神经的再生或损伤的修复。

研究显示，损伤后的外周神经之所以能够再生，雪旺细胞起了主要的作用.雪旺细胞是外周神经的胶质细胞，据研究报道，周围神经损伤后，雪旺细胞功能通过以下几个方面的作用来促进神经的再生：分泌多种神经营养因子，包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等；产生促突起生长因子(NPF)；释放轴突诱导因子等，以上物质均具有营养和保护受损神经元、促进轴突再生和出芽等作用。其次，雪旺细胞可以作为再生轴突的机械性导管样引导物，支持和引导轴突再生。此外，雪旺细胞还可以抑制胶质瘢痕形成，协助形成神经内膜，清除细胞碎片，促进轴突髓鞘化，是理想的种子细胞。

聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)是目前临床上最常用的生物可降解缝线的材料，有可靠的组织相容性和生物安全性，其物理特性根据聚乳酸和聚乙醇酸的比例变化而变化，PLGA(PLG/PLA：90/10)在体内2个月左右可自行降解，以其细丝编织而成的中空导管弹性和硬度适宜，既满足眼眶手术特殊解剖位置的操作需求，又为视神经轴突的生长维持一定的空间，是理想的人工视神经支架材料。

现有技术公开的有关人工视神经的研究，多为将营养因子直接填充到可吸收材料细丝编织的中空导管中，但由于营养因子的半衰期一般较短，尤其是目前唯一证实的具有促进视神经再生的睫状神经营养因子CNTF，其半衰期很短，在眼内持续时间有限，直接的蛋白填充不能为神经轴突再生提供持久的营养支持，这无疑是影响人工神经作用效果的的一大瓶颈。

有研究尝试用病毒转染的方法转染神经营养因子到雪旺细胞，但是病毒转染的生物安全性问题也限制了其临床的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织工程化的人工视神经导管。尤其涉及一种安全可降解的，能持续、有效地为神经再生轴突提供营养支持的人工视神经。

本发明提供的组织工程化的人工视神经，经动物实验结果证实，可以成功移植到SD大鼠损伤视神经断端，改变抑制轴突再生的微环境，同时转染了CNTF基因的雪旺细胞能持续分泌包括CNTF在内的多种神经营养因子，为损伤视神经的再生轴突提供有效的营养支持，促进轴突再生。本发明人工视神经导管采用的是生物可降解材料，具有良好的组织相容性，移植后异物反应小，其在体内可逐渐自行降解，避免了二次手术的损伤性操作，安全性好。

本发明组织工程化的人工视神经包括：PLGA细丝编织的中空导管(1)、填充在导管中的PGA细丝(2)、填充在导管中的转基因雪旺细胞(3)。

所述的PLGA细丝编织成的中空导管作为人工视神经的外部支架，导管内径为0.8mm-6mm，外径为1mm-6.5mm，长为11-50mm，可根据不同移植对象的需要，制备不同尺寸的导管，如用于大鼠的视神经移植可选用内径为0.8mm，外径为1mm，长为11mm(短导管)/23mm(长导管)的人工视神经。

为增加导管的组织相容性并中和其降解时形成的酸性微环境，本发明在导管(1)表面涂布生物可降解的壳聚糖聚合体(4)。

。本发明中所述的导管(1)表面涂布2层壳聚糖聚合体。

所述的导管内填充生物可降解的PGA细丝作为人工视神经的内部支架。该PGA细丝取材于常用4-0手术缝线，每根细丝直径10μm，细丝长度与导管长度一致。

本发明将体外培养的转基因雪旺细胞悬液与等体积的基质胶混合，取8-200ul填充PGA细丝的PLGA导管，制成完整的人工视神经。

为延长神经营养因子的作用时间，本发明用电穿孔的方法，采用适合的电穿孔参数，在体外将CNTF质粒转染到雪旺细胞，再将其填充、培养到导管中，这种转基因雪旺细胞能够持久而有效的分泌包括CNTF，从而长期促进再生神经轴突的生长。

本发明的另一目的是提供上述人工视神经的制备方法。

本发明采用聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)细丝编织成中空导管，作为人工视神经的外部支架，表面涂布壳聚糖聚合物，其内填充生物可降解材料聚乳酸细丝作为人工视神经的内部支架。利用电穿孔技术在体外将CNTF质粒转染到体外培养的雪旺细胞中，再将这种转基因雪旺细胞填充、培养到中空导管内，制成人工视神经。

本发明方法包括如下步骤，以1.1cm长度的大鼠视神经导管为例：

(1)构建CNTF质粒。按本领域常规方法，通过PCR法从pNUT-hCNTF-DT质粒中分离出CNTF外显子片段，引物为：P1：5’-ATG GCT TTC ACA GAG CAT TC-3’，P2：5’-TTG TTC AGG CCC TGA TGC TTC ACA TAG GAT TCC GTA AGA GCA GTC A-3’，P3：5’-TGA CTG CTC TTA CGG AAT CCT ATG TGA AGC ATC AGG GCC TGA ACA A-3’和P4：5’-CTA CAT TTT CTT GTT GTT AGC AA-3’。然后将其两段外显子连接成CNTFcDNF，并将该cDNA片段插入pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO质粒的TOPO酶位点(Invitrogen)，构建pcDNA3.1/NT-GFP-CNTF质粒，将该质粒转化入大肠杆菌中，按Endofree Plasmid Purification Maxi试剂盒说明书扩增抽提质粒，保存备用。

(2)通过电穿孔的方法将CNTF质粒转染到体外培养的雪旺细胞

在6孔板中加入DMEM/10％FBS培养液，将雪旺细胞以5×10⁶密度接种其中，待细胞融合度达到90％时，吸出培养液，PBS液洗3遍，然后每孔加入100mlD-Hank’s溶液，其中含有12.5μg CNTF质粒，静置10分钟后，加入900mlD-Hank’s溶液，然后将Petri Pulser^TM PP35-2P电极插入孔板，使部分电极浸入液面，放于细胞表面，连接电穿孔仪(ECM-830，BTX)进行电击，电击参数为电压192v，时间20ms，间隔500ms，脉冲5次的方波。电击完毕，静止5分钟，吸净D-Hank’s液，再加入DMEM/FBS细胞培养液置37度培养箱培养。

(3)制备PLGA导管

将PLGA细丝根据需要编织成内径0.8mm、外径1.0mm的中空导管，导管表面涂布壳聚糖聚合物，环氧乙烷熏蒸灭菌。显微镜下将手术用4-0PGA可吸收缝线拆成PGA细丝，取80根PGA细丝(细丝直径为10μm)均匀填充到PLGA中空导管中，作为人工视神经的内部支架。将该导管放入75％酒精消毒半小时后，PBS冲洗3遍，在超净台中自然风干后填充细胞。

(4)将转基因雪旺细胞填充到PLGA导管中

电穿孔24小时后，用胰酶消化转基因雪旺细胞并制成1-2×107cells/mL细胞密度的单细胞悬液，然后加入等体积的Matrigel(BD)增强细胞的粘附性并提供细胞生存的营养环境。取8μl上述转基因雪旺细胞悬液注入填充了PGA细丝的1.1cm PLGA导管中，然后将该导管放入雪旺细胞生长的六孔板中培养24小时，然后移植。

本发明通过动物实验，结果证实该人工视神经移植到损伤视神经断端以后，转基因雪旺细胞会持久而有效的释放各种促进神经轴突再生的营养因子，从而为视神经再生轴突提供强大的营养支持，修复损伤，能较好的促进损伤视神经轴突的再生，且安全性较高。

本发明的人工视神经，可进一步在形态上进行改良，应用于临床，作为一种神经营养治疗方法促进损伤视神经的再生修复。

本发明组织工程化的人工视神经的优点在于：

(1)结构新：现有技术的人工神经均采用生物可降解材料构成的中空导管，PLGA是其中最为常用的材料，但是无论是在该中空导管中填充种子细胞还是直接注射神经营养因子，因导管中央无细胞附着的支架，种子细胞容易往周围的管壁聚集生长，不利于种子细胞更合理地分布，从而影响促轴突再生的效果；本发明在传统的中空导管中均匀填充了生物可降解的PGA细丝，一方面增加了转基因雪旺细胞黏附的面积，使其能均匀分布在导管中，另一方面也对再生的神经轴突起到一个引导作用，使轴突沿细丝的方向生长。

(2)方法新：现有技术的人工神经多为在中空导管中填充可分泌营养因子的种子细胞或直接填充营养因子，或用病毒转染神经营养因子基因来增强种子细胞的再生能力；本发明在选用经典的促神经再生的种子细胞-雪旺细胞的基础上，采用特定电穿孔条件，用电穿孔法将CNTF质粒转染到雪旺细胞中，使其能够持久有效地分泌CNTF，为再生轴突的持续生长提供了保障，能进一步增强其促视神经再生的能力。本发明采用了物理转染方法，转染效率高，对细胞的损伤小，避免了病毒转染的细胞毒性，安全、有效、简便。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为本发明组织工程化的人工视神经结构示意图，

其中，1是PLGA细丝编织的中空导管；2是PGA细丝；3是转基因雪旺细胞悬液；

4是壳聚糖聚合体。

图2为电穿孔后雪旺细胞的转染情况，

其中显示，A，B：电穿孔24h后，超过90％的雪旺细胞显示绿色荧光，表明该转染方法的转染率高；C：转染后的雪旺细胞既显示绿色荧光；D：免疫组化染色显示转染的雪旺细胞表达CNTF。

图3为将转染了CNTF的雪旺细胞行RT-PCR检测雪旺细胞分泌CNTF的情况，

其中，1为CNTF-GFP转染雪旺细胞组，2为GFP转染雪旺细胞组，3为未转染雪旺细胞组，结果证实转染CNTF-GFP的雪旺细胞有大量CNTF的表达，而对照组无，说明雪旺细胞所分泌的CNTF是外源性基因表达的。

图4显示了制备的人工视神经在培养皿中，在其中填充的细丝之间有大量的雪旺细胞粘附。

图5是转基因雪旺细胞填充到PLGA导管中24小时后的人工视神经的扫描电镜照片，其中可见大量健康的雪旺细胞生长在细丝之间。

图6是实施例3中人工视神经一端移植到视神经断端，另一端包埋在皮下。

图7是实施例3中人工视神经移植4周后，可见导管已经部分降解，导管被膜性组织包被。

图8是实施例3中人工视神经冰冻切片行GAP43免疫组化染色的结果，

其中8A：移植的空导管内则未见到相似的再生神经纤维；

8B：填充单纯雪旺细胞的人工视神经导管；

8C，8D：填充转基因雪旺细胞的人工视神经，内有表达GAP43的再生神经轴突。

图9是实施例3中人工视神经移植4周后，在导管末端行DiI逆行标染轴突再生的视神经节细胞(RGC)，其中，

9A显示为移植转基因雪旺细胞导管的视网膜铺片中DiI标染阳性的RGCs，

9B显示为移植单纯雪旺细胞导管的视网膜铺片中DiI标染阳性的RGCs，

9C显示为移植空导管的视网膜铺片上，很少可见DiI标染阳性的RGCs，可见移植转基因雪旺细胞导管后轴突再生的RGCs明显多于移植单纯雪旺细胞导管后轴突再生的RGCs，而单纯空导管移植组几乎看不到轴突再生的RGCs。

图10是实施例4中人工视神经一端移植到视神经断端，另一端插入对侧上丘。

图11是实施例4中人工视神经移植8周后已完全吸收，可见人工视神经变成一神经样组织。

图12是实施例4中人工视神经冰冻切片行GAP43免疫组化染色的结果，其中，填充转基因雪旺细胞的人工视神经导管内显示绿色荧光的细丝即为表达GAP43的神经丝。

图13是实施例4中人工视神经移植8周后透射电镜照片，其中可见雪旺细胞(S)大量存活，并且看上去很健康，并可见到很多再生的神经轴突(箭头指)；13A，13B：新生轴突没有髓鞘)；图13C，13D：轴突被雪旺细胞包绕并重新髓鞘化。

具体实施方式：

下面以本发明的实施例为基础详细说明本发明，将更有助于本领域的研究人员理解本发明的内容，但不以任何形式限制本发明的内容。

实施例1制备组织工程化的人工视神经(填充普通雪旺细胞)

将体外培养的雪旺细胞以5×10⁶cell/ml密度接种到6孔板中，加入10％FBS/DMEM培养液，待细胞生长融合度达到90％时，用胰酶消化并进行移植.

将PLGA细丝根据需要编织成的中空导管，导管表面涂布一层壳聚糖聚合物，环氧乙烷熏蒸灭菌。显微镜下将手术用4-0PGA可吸收缝线拆散成PGA细丝，取PGA细丝(细丝直径为10μm)均匀填充到PLGA中空导管中，作为人工视神经的内部支架。然后将该导管放入75％酒精中消毒半小时，然后用PBS冲洗3遍，在超净台中自然风干后填充细胞.

雪旺细胞用胰酶消化并制成1-2×10⁷cells/mL细胞密度的单细胞悬液，然后加入同等体积的Matrigel(BD)增强细胞的粘附性并提供细胞生存的营养环境。取适量上述转基因雪旺细胞悬液轻轻注射到填充了PGA细丝的PLGA导管中，然后将该导管继续放入雪旺细胞生长的六孔板中继续培养24小时，然后移植。

实施例2制备组织工程化的人工视神经(填充转基因雪旺细胞)

将体外培养的雪旺细胞以5×10⁶cell/ml密度接种到6孔板中，加入10％FBS/DMEM培养液，待细胞生长融合度达到90％时，将培养液吸出，用PBS液洗3遍，然后每孔加入100mlD-Hank’s溶液，其中含有12.5μg CNTF质粒，静置110分钟后，加入900mlD-Hank’s溶液，然后将Petri Pulser^TM PP35-2P电极轻轻插入六孔板，使部分电极浸入液面，轻放于细胞表面，连接电穿孔仪(ECM-830，BTX)进行电击，电击参数为电压192v，时间20ms，间隔500ms，脉冲5次的方波。电击完毕后，静止5分钟，然后吸净电转液，重新加入10％FBS/DMEM细胞培养液继续放入在37度培养箱培养。将体外培养的雪旺细胞以5×10⁶cell/ml密度接种到6孔板中，加入DMEM和FBS培养液，待细胞融合度达到90％时，在6孔板中加入CNTF质粒，然后轻轻插入Petri Pulser^TM PP35-2P电极，并将电极连接到BTX公司的ECM-830电穿孔仪，以电压192v，时间20ms，间隔500ms，脉冲5次的方波电击细胞表面。电击以后继续将雪旺细胞培养在上述培养液中。

将PLGA(PLG/PLA：90/10)细丝编织成内径为0.8mm，外径为1mm，长为23mm的中空导管，作为人工视神经的外部支架，导管表面涂布二层壳聚糖聚合物，以增强其组织相容性。显微镜下将手术用4-0缝线拆散为直径为10μm的PGA细丝，取80根细丝填充到上述PLGA中空导管中，作为人工视神经的内部支架。

将前述转染CNTF基因的雪旺细胞用胰酶消化并制成1-2×107cells/mL细胞密度的单细胞悬液，然后加入同等体积的Matrigel(BD)增强细胞的粘附性并提供细胞生存的营养环境。取8μl上述转基因雪旺细胞悬液轻轻注射到填充了PGA细丝的PLGA导管中，然后将该导管继续放入雪旺细胞生长的六孔板中继续培养24小时，然后移植。

实施例3动物实验

实验动物：8-10周的SD大鼠(200-250g)16只，购于中科院动物所，按照复旦大学实验动物伦理协会的要求饲养于清洁动物房。

实验方法：全麻下手术分离大鼠左眼视神经，切开视神经鞘膜，在视乳头后0.5mm切断轴突，并切除远侧断端约3mm长的轴突，过程中避免损伤到鞘膜上的血管，将上述11mm长的人工视神经的一端用10-0缝线缝合到视神经近侧端的鞘膜上，另一端用8-0缝线缝合在头皮下(图6)，手术后检查眼底，确认未损伤到视神经鞘膜上的血管而影响视网膜的血供，人工视神经移植后4周，常规处理实验动物，取人工视神经，分别通过Dil逆行标染、免疫组织化学染色、视网膜铺片计数RGC密度观察再生视神经轴突的情况。

以上实验均设空导管移植组(仅移植导管支架，其内未填充转基因雪旺细胞)、雪旺细胞导管移植组(PLGA导管内填充的为普通雪旺细胞)为对照，方法同上。

结果显示：

将人工视神经的冰冻切片(纵行)用再生轴突的标记物GAP43免疫组化染色标记再生的神经轴突，荧光显微镜观察发现，移植空导管组内则未见到GAP43标染的再生神经纤维(图8A)，填充单纯雪旺细胞导管内可见GAP43标染的再生轴突(图8B)，但转基因雪旺细胞的人工视神经导管内则可见更多的标染GAP43的再生轴突(图8C和图8D)。

人工视神经经DiI 3天逆行标染后，制作视网膜铺片，观察DiI标染的轴突再生的RGCs.以视乳头为原点，四个象限分别取离距原点1mm、2mm、3mm共12个区域行共聚焦扫描，计数每平方毫米内DiI标染的RGCs密度，从而反应其再生的效果(图9)。空导管组再生RGCs密度为58±23/mm²，而单纯雪旺细胞的人工视神经组再生RGCs密度为323±65/mm²，填充转基因雪旺细胞的人工视神经的组再生RGCs密度为432±93/mm²，(各组两两T检验P＜0.05)，说明单纯雪旺细胞的人工视神经移植可以达到促进视神经再生的效果，而转基因雪旺细胞的人工视神经可达到更好的促再生效果。

实验结果证实，本发明的组织工程化的人工视神经组织相容性和安全性较好，移植以后未见免疫排斥反应，并且移植4周后可以观察到明显的视神经再生轴突长入其中，说明改变了抑制神经再生的微环境，同时予以持续有效的神经营养因子，可以更好的促进视神经再生的，该人工视神经能够很好的辅助视神经再生的研究。

实施例4动物实验

取17只8-10周的SD大鼠(200-250g)，按照复旦大学实验动物伦理协会的要求饲养于清洁动物房。常规处理分离实验大鼠左眼视神经和视神经鞘膜，在视乳头后0.5mm切断轴突，并切除远侧断端约3mm长的轴突，过程中避免损伤到鞘膜上的血管。然后将上述23mm长的人工视神经的一端用10-0缝线缝合到视神经近侧端的鞘膜上，另一端插入右侧上丘。手术后检查眼底，确认没有损伤到视神经鞘膜上的血管而影响视网膜的血供。人工视神经移植后2个月，按常规方法处理实验动物，取得人工视神经。

同上方法，设空导管移植组(仅移植PLGA导管，其内未填充转基因雪旺细胞)、单纯雪旺细胞导管移植组(PLGA导管内填充的为普通雪旺细胞)为对照。

结果显示：

移植8周后的人工视神经，可见人工视神经管已基本吸收，变成神经样组织(图11)；

将移植8周后的人工视神经的冰冻切片行GAP43免疫组化染色标记再生视神经纤维，荧光显微镜观察可见，填充转基因雪旺细胞的人工视神经导管内有表达GAP43的神经丝(图12)，而移植的空导管内则未见到相似的再生神经纤维。

将移植8周后的转基因雪旺细胞的人工视神经行扫描电镜观察人工视神经内的超细结构，可见人工视神经内仍存活大量健康的雪旺细胞和再生的神经轴突，部分轴突呈无髓鞘状态(图13A，图13B)，但可见部分轴突被雪旺细胞重新髓鞘化(图13C，图13D)，说明雪旺细胞不但可以促进视神经轴突再生，同时还可以使再生轴突重新髓鞘化，有利于新生轴突的功能恢复。

实验结果证实，本发明的组织工程化的人工视神经组织相容性和安全性较好，移植以后未见免疫排斥反应，移植8周后可见明显的视神经再生轴突长入其中，并使再生轴突髓鞘化，说明本人工视神经能长时间为再生神经轴突生长提供营养支持，有明确促再生效果。可进一步研究再生神经丝沿人工视神经与对侧上丘建立联系，最终实现视功能的重建。