一种新的天然对映贝壳杉烷衍生物及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种新的天然对映贝壳杉烷衍生物及其组合物的制备方法和用途。该类衍生物是式(I)所示的化合物、组合物、光学异构体、药用盐、溶剂合物。该类化合物的制备方法包括采用溶剂提取，采用柱层析分离纯化而得。该类化合物及其光学异构体、组合物、药用盐、溶剂合物可用于制备治疗阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的药物。该类化合物是一种新的对映贝壳杉烷衍生物，制备方法简单、易行。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的天然对映贝壳杉烷衍生物及其制备方法和该类化合物在制备治疗阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的药物中的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，是一种以慢性、进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征表现为老年斑、神经元纤维缠结和神经元丢失，严重影响患者的认知、记忆、语言功能、及个人生活能力和情感人格等(NEJM1999，341，1670-1679)。

目前，世界上较为接受的AD病理为“胆碱能缺失学说”。学说认为老年性痴呆症患者大脑内神经递质-乙酸胆碱的缺失是导致AD疾病的关键原因。(Ann Neurol 1990，27，457-464；Ann Neurol 1991，30，572-580)。

乙酰胆碱的缺失导致AD患者认知功能下降，记忆能力丧失。胆碱酯酶(ChE)是生物神经传导中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。胆碱酯酶依其催化底物的特异性分为乙酰胆碱酯酶(AchE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)。乙酰胆碱酯酶(AchE)会催化乙酰胆碱的裂解反应，导致乙酰胆碱的缺失、神经信号传递失败，目前对老年痴呆的药物治疗主要是通过抑制ChE来提高患者体内的乙酰胆碱水平。医学治疗上多采用乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEI)抑制AchE活性，延缓Ach水解的速度，提高突触间隙Ach的水平，从而发挥对AD的治疗作用(Br Med J1999，318，633-638)。

从自然界寻找具有抑制胆碱酯酶活性的化合物，将为新药的设计提供更多的功能模版，为药物合成研究和药物作用机理研究提供很好的先导化合物。腺梗豨莶(Siegesbeckiapubescens)是菊科豨莶属一年生草本植物，广布于热带和温带地区，该属植物全世界共有五种，我国有三种。《本草述》：有云，豨莶制法，大益气血，四肢不遂，大有功。近代研究也表明腺梗豨莶提取物在治疗神经疾病方面有较好的疗效。(Acta Pharm.Sin1989，24，833-836)。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的天然对映贝壳杉烷衍生物。

本发明的另一个目的是提供该类化合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供该类化合物在制备治疗阿尔兹海默病药物中的用途。

本发明提供了一种式(I)所示的化合物，该类化合物易溶于有机溶剂。同时，它们的组合物、药用盐也是本发明的一部分。

其中，R₁为H、甲基、羧基或CH₂OH；

R₂为甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、异戊酰基、戊酰基、2-甲基丁酰基、苯甲酰基或苯乙酰基。

本发明还提供了该类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)腺梗豨莶地上部位用溶剂提取得浸膏；

(2)将浸膏混悬于水中，用极性从低到高溶剂萃取。得到中等极性的萃取物；

(3)将萃取物与MCI微孔树脂拌样，上样于MCI微孔树脂柱上，乙醇水溶液从低到高洗脱；

(4)洗脱物以石油醚-醋酸乙酯-甲醇为洗脱系统进行硅胶层析，然后进行ODS柱层析和硅胶柱层析，得到该类化合物。

步骤(1)中所述的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、水中的一种或多种。

步骤(2)中所述的洗脱溶剂，低极性溶剂为石油醚、环己烷、甲苯、二氯甲烷中的一种或多种，中极性溶剂为乙醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮中的一种或多种，高极性溶剂为乙醇、甲醇的一种或多种。

根据本领域内技术人员熟知的成熟的筛选酶水平对乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用的化合物的方法，研究人员发现式(I)所示的这类化合物或其药用盐对乙酰胆碱酯酶活性有一定的抑制作用。

因此，本发明涉及的式(I)所示的化合物、药用盐具有制备治疗阿尔兹海默药物的用途，它们可以以其自身的形式施用，也可以和药学上可以接受的载体组成药物组合物而应用。

采用有效剂量的本发明所述的式(I)所示的化合物、药用盐的一种或多种作为活性成分与常规药用载体制备成药物组合物，可以按常规方法制备成口服或注射用途的常规剂型。通常的，载体包括稀释剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂或其他常规添加剂中的一种或多种。

本发明的有益效果：

本发明公开了一种新的天然对映贝壳杉烷衍生物及其制备方法。这些化合物可用于治疗阿尔兹海默病。本发明提供的制备方法简单易行，制备的化合物纯度高。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的说明。

本发明中没有具体描述的提取、分离方法均为本领域普通技术人员熟知的方法，本领域普通技术人员可以根据说明书的提示采用药典规定的方法或其他操作规程限定的方法结合使用仪器的说明书进行操作，即可实现本发明。

实施例1：化合物(II)的提取分离

腺梗豨莶地上部分干燥后用95％乙醇加热回流提取，提取液减压回收乙醇，得浸膏，浸膏混悬于蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等量萃取。乙酸乙酯萃取液浓缩后得浸膏，上样于MCI微孔树脂柱上，乙醇水溶液梯度洗脱(0％乙醇-95％乙醇)，得到洗脱物，以石油醚-醋酸乙酯-甲醇为洗脱系统进行硅胶层析，然后进行ODS和硅胶柱柱层析。ODS柱层析以丙酮-水为洗脱系统，硅胶柱层析以氯仿-甲醇为洗脱系统分离得到化合物(II)。

化合物(II)，中文名2-O-(β-D-呋喃芹菜糖基-(1→3)-2-O-异戊酰基-β-D-吡喃葡萄糖)苍术苷，英文名2-O-(β-D-apiofuranosyl-(1→3)-2-O-Isovaleryl-β-D-glucopyranosyl)atractyligenin，分子式C₃₅H₅₄O₁₄，分子量698，淡黄色固体。¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表1。

表1化合物(II)的¹H-NMR和¹³C-NMR数据(300MHz，500/4MHz，CD₃OD)

实施例2：

腺梗豨莶地上部分干燥后用70％乙醇加热回流提取，提取液减压回收乙醇，得浸膏。取浸膏混悬于蒸馏水中，依次用石油醚、氯仿、正丁醇等量萃取。氯仿萃取液浓缩后得浸膏，上样于MCI微孔树脂柱上，乙醇水溶液梯度洗脱(0％乙醇-100％乙醇)，得到洗脱物，以石油醚-醋酸乙酯-甲醇为洗脱系统进行硅胶层析，然后进行ODS和硅胶柱柱层析。ODS柱层析以甲醇-水为洗脱系统，硅胶柱层析以乙酸乙酯-甲醇为洗脱系统分离得到化合物(II)。

实施例3：

腺梗豨莶地上部分干燥后用70％乙醇加热回流提取，提取液减压回收乙醇，得浸膏。取浸膏混悬于蒸馏水中，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等量萃取。乙酸乙酯萃取液浓缩后得浸膏，上样于MCI微孔树脂柱上，乙醇水溶液梯度洗脱(0％乙醇-75％乙醇)，得到洗脱物，以石油醚-醋酸乙酯-甲醇为洗脱系统进行硅胶层析，然后进行ODS和硅胶柱柱层析。ODS柱层析以乙醇-水为洗脱系统，硅胶柱层析以氯仿-丙酮为洗脱系统分离得到化合物(II)。

实施例4：

腺梗豨莶地上部分干燥后用70％乙醇加热回流提取，提取液减压回收乙醇，得浸膏。取浸膏混悬于蒸馏水中，依次用环己烷、氯仿、正丁醇等量萃取。氯仿萃取液浓缩后得浸膏，上样于MCI微孔树脂柱上，乙醇水溶液梯度洗脱(0％乙醇-75％乙醇)，得到洗脱物，以石油醚-醋酸乙酯-甲醇为洗脱系统进行硅胶层析，然后进行ODS和硅胶柱柱层析。ODS柱层析以乙醇-水为洗脱系统，硅胶柱层析以二氯甲烷-甲醇为洗脱系统分离得到化合物(II)。

实施例5：测定化合物(II)对乙酰胆碱酯酶抑制作用

缓冲液(10×PBS，0.1M，pH 7.4)购自invitrogen公司；Triton X-100购自碧云天公司；底物Ach-S-CL(现用现配，每次用PBS配制成0.1M的储液)购自sigma公司；显色剂DTNB(用PBS配制成0.005M的储液)购自sigma公司；96孔透明板；移液枪、枪头购自corning公司；Vistar大鼠购自江苏南京青龙山养殖场。阳性药为Rivastigmine。

大鼠两只，完整取下，全脑冷PBS洗涤全脑直到将黏附的血液清洗干净。在冰袋上将全脑切成碎片，分装到8个5mL EP管中，每管加入2mL 10×PBS(含0.5％Triton)。机搅匀得到悬液，以12000rpm，4℃离心10min，小心吸取各管上清液，混合至另一新的预冷的EP管中。以每管50μL分装上清夜，保存于-20℃备用。

将0.01M储备液的化合物用DMSO稀释成100×浓度的工作液，由高到低分别为1000、250、62.5...依次以四倍倍比进行稀释，一共七个浓度梯度(单位：μM)按照体积比为1∶100的比例用PBS稀释脑匀浆上清液即得到酶工作液。将0.1M储备液的底物用PBS稀释到4mM工作液备用。

取96孔板，每孔加入48μL的PBS、2μL一系列浓度梯度的待筛化合物工作液，其中阳性对照组和阴性对照组直接加入2μL DMSO。每孔加入50μL脑匀浆工作液，用孔板震荡仪混匀，用膜封好各孔，放于37℃孵育48h。每孔加入50μL 0.005M的显色液。每孔加入50μL底物工作液，其中阴性对照组直接加入50μL 10×PBS，孔板震荡仪混匀，37℃静置1h。于Tecan M200酶标仪上测定各孔412nm吸光值。

列公式求得抑制率：

以log[给药浓度]为横坐标，抑制率为纵坐标，在origin6.0中画图，拟合出一条药理学量效关系S形曲线，求出50％抑制率时的药物浓度，即为此化合物抑制AchE活性的IC₅₀值。化合物(II)对乙酰胆碱酯酶有一定抑制活性，其IC₅₀值为9.69μM。RivastigmineIC₅₀值为1.01μM。