抗人心肌肌钙蛋白I特异性单克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明涉及一种抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株B10A6其保藏号为：CGMCCNO 3951。以及由抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株CGMCC3951分泌的单克隆抗体，其所述的单克隆抗体免疫球蛋白类别及亚类分别为IgG和IgG3且与人心肌肌钙蛋白I特异性结合；其效价为1∶16000，亲和常数为：1.08×10-9mol/L。本发明研制的单克隆抗体应用临床诊断后，将极大的推动了心肌肌钙蛋白I诊断试剂盒完全国产化的研究进程，提高心血管疾病临床诊断和预后的正确率减轻患者的痛苦和降低死亡率，具有显著的经济效益和社会效益。

说明书

技术领域

本发明涉及以抗体为特征的体外实验用的生物制品，更具体的说，是一种抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)特异性高的单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

急性心肌梗死(AMI)的早期诊断和及时治疗是降低死亡率的关键。心肌组织特异性标志物的测定是AMI诊断、监测病程与评价预后的主要指标。传统使用的早期标志物为肌红蛋白(Mb)、乳酸脱氢酶(LDH)同工酶、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)等，临床实践证实这些心肌损伤标志物大都存在特异性不强、升高时间较晚和持续时间相对短等缺陷。近年来，心肌肌钙蛋白I(cTnI)以其高度的灵敏性和组织器官特异性及较长的诊断窗口期，在AMI和其他心脏疾病的诊断中显示出其特殊的优越性，并愈来愈多的受到临床医生和临床化学家的关注和青睐。国际临床化学联盟(IFCC)的心肌标志物标准化委员会(CSCM)的美国临床生化学院(NACB)最近建议在临床工作中将心肌肌钙蛋白I作为急性心肌梗死诊断的“金标准”。

目前，我国临床上使用的cTnI诊断试剂盒多为进口产品、或进口原料国内组装。这些进口产品价格昂贵，限制了这一特异、灵敏的生化标志物在国内的广泛推广和应用。研制出具有自主知识产权、完全国产化的cTnI诊断试剂盒是当前急需。我们围绕cTnI检测试剂盒的国产化进行了深入的研究和探索。在研究中发现有两个问题严重制约着cTnI诊断试剂盒的国产化进程：(1)首先是试剂盒的重要组成成分cTnI抗原的来源问题，传统的方法是从猝死者心肌组织中采用生化方法提取，但目前人心肌组织的来源及其困难，且质量也难以保证，致使其产率极低，抗原活性也不理想。(2)试剂盒的关键试剂抗体特异性：多克隆抗体结合位点多，特异性、均质性相对弱，制备出用于心血管疾病临床诊断的高亲和力、高特异性的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体是解决问题的关键。

随着分子生物学和基因重组技术的飞速发展，有关体外表达重组人心肌肌钙蛋白I(，rhcTnI)的文献在国内外均有报道。但大部分研究工作还处在实验室的阶段，至目前为止尚未见商品化的重组人心肌肌钙蛋白I问世。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株B10A6其保藏号为：CGMCC NO 3951。

本发明的另一个目的是提供一种由抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株CGMCC3951分泌的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供一种抗cTnI单克隆抗体的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株B10A6其保藏号为：CGMCC NO 3951。

抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株B10A6，该杂交瘤细胞株于2010年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保臧号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO 3951。

本发明所述的抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株，该细胞株，能分泌抗人心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。

本发明提供了由抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株CGMCC3951分泌的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体免疫球蛋白类别及亚类分别为IgG和IgG3且与人心肌肌钙蛋白I特异结合；其效价为1∶16000，亲和常数：1.08×10^-9mol/L。

本发明所述抗人心肌肌钙蛋白I特异性单克隆抗体的DNA基因序列为679bp，如图3所示。其所编码的氨基酸序列如图11所示。该cTnI抗体-免疫球蛋白IgG分子量约为150kD，由两条分子量约为50kD的重链和两条分子量为25kD的轻链组成(如图9)。

本发明采用RT-PCR方法从人心肌组织总RNA中克隆出全长的人心肌肌钙蛋白I基因，将其插入到pMD19-T克隆载体中，经酶切和测序对目的基因分析，再插入到pET-21a(+)表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，对诱导表达的目的蛋白行SDS-PAGE和采用锐普心梗仪检测重组蛋白的抗原性并准确定量。从已构建的重组人cTnI的基因工程菌表达蛋白中分离纯化cTnI作为抗原免疫Balb/c小鼠，取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞，采用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTnI的McAb阳性克隆，并利用体内诱生法大规模制备McAb，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体，鉴定抗体的性质。

附图说明：

图1为1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增的目的基因；其中1.DNA Maker；2.上样量为5μl目的基因产物，3.上样量为10μl目的基因产物；

图2为克隆载体的菌落PCR和双酶切鉴定图；其中1-4分别克隆的双酶切鉴定；1′-4′分别克隆的菌落PCR鉴定；

图3为目的基因测序序列；

图4为克隆载体中目的基因测序结果图；

图5为目的基因序列BLAST同源序列比对结果；

图6表达载体双酶切鉴定图；其中1.低分子量蛋白质标准；2.BL21(DE3)空白菌株；3.未经IPTG诱导的pET-21a(+)/BL21(DE3)菌株；4.经IPTG诱导的pET-21a(+)/BL21(DE3)菌株；5.抗性LB平板第0次传代；6.抗性LB平板第10次传代；7.抗性LB平板第20次传代；8.抗性LB平板第30次传代；9.普通LB平板第15次传代；

图7表达产物SDS-PAGE分析及基因工程菌稳定性评估图；

图8锐普心梗仪检测rhcTnI；

图9纯化的单克隆抗体SDS-PAGE结果图；

图10Western blot检测cTnI McAb特异性图。其中1，2，4cTnI蛋白；3.低分子量蛋白质标准。

图11重组cTnI的氨基酸序列

具体实施方式：

为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合实例对本发明做进一步的说明。其中DH5α克隆菌株购买于北京宝赛生物技术有限公司；BL21(DE3)感受态菌株购买于索莱宝科技有限公司；SP2/0骨髓瘤细胞购买于北京鼎国生物公司。

实施例1

步骤：

1、PCR引物的设计：

按NCBI网站Gene Bank数据库提供的人心肌肌钙蛋白I基因序列进行引物设计，在上下游引物的5′端分别插入NdeI和BamHI内切酶位点，并对上游引物的第2位和第4位密码子的第3个简并碱基定点突变，运用Primer Premier5.0和DNAMAN软件对引物进行分析。

2、RT-PCR扩增目的基因：

设定退火温度为56.0℃，扩增产物12g/L琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的基因片断。

3、pMD19-T/rhcTnI克隆质粒的构建及鉴定：

将切胶回收的目的基因片断与pMD19-T载体(大连TAKARA公司产品)接并转化DH5α克隆菌株(北京宝赛生物技术公司)，蓝白斑筛选，挑取阳性克隆扩增培养后提取质粒酶切鉴定，对目的基因进行测序，酶切回收目的基因片断。

4、pET-21a(+)/rhcTnI表达质粒的构建：

用T4DNA连接酶将NdeI和BamHI内切酶充分酶切并切胶回收的pET-21a(+)大片断和回收的目的基因片段，按摩尔比1∶3的比例16℃连接24小时，转化DH5α感受态菌株，挑取阳性克隆酶切鉴定。

5、pET-21a(+)/rhcTnI表达质粒转化BL21(DE3)表达菌株并进行诱导表达：

将读码框正确的阳性克隆扩大培养，提取质粒后转化BL21(DE3)感受态菌株，挑取阳性克隆37℃、250r/min条件下培养10h，无菌条件下按1∶50比例转接入新鲜氨苄抗性的LB培养基继续扩大培养，待吸光度A＝0.6～1.0时，无菌条件下加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，继续培养6h。

6、表达产物分析与鉴定：

取1ml菌液离心弃上清后直接行SDS-PAGE；剩余菌液5g、4℃、离心10min，收集菌体；用pH8.0的Tris-Cl洗涤2次，液氮速冻，37℃恒温水浴助融，共8次；12 000r/min、4℃、离心25min，分别取上清和沉淀行SDS-PAGE，观察可溶性目的蛋白和包涵体的比例。

7、目的蛋白抗原性检测：

包涵体经变性溶解、复性后，将样品用cTnI诊断试剂盒自带的样品稀释液1∶100 000稀释后，采用心肌肌钙蛋白I化学发光试剂盒(加拿大瑞帮生物医学有限公司)在锐普心梗仪上检测目的蛋白抗原性并进行准确定量。

杂交瘤制备：

8、动物免疫小鼠免疫方案：

动物与细胞珠：

BALB/C小鼠，雄性，六周龄左右，18-20克，由中国医学科学院放射医学研究所动物房提供，SP2/0骨髓瘤细胞购买于北京鼎国生物公司。

动物免疫：

用经过等量弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)充分乳化的cTnI抗原，进行初次免疫，其浓度为80μg/ml，每只0.5ml。间隔2周后加强免疫，弗氏不完全佐剂，乳化，cTnI抗原浓度为40μg/ml，每只0.5ml。融合前3天冲击免疫，用量与加强免疫相同。

9、细胞的融合：

免疫小鼠的脾细胞同长势良好的SP2/0骨髓瘤细胞5∶1的比例混合，在50％PEG4000作用下融合2分钟，加入RPMI1640(GiBco公司产品)完全培养基终止融合，1000转/分，离心5分钟，去上清，加入HAT(GiBcoBRL公司)培养基，混合后至96孔板置37℃、5％CO₂培养箱中培养，一周后更换HT(GiBcoBRL公司)培养基。

10、筛选阳性克隆及克隆化培养：

采用间接ELISA法检测融合细胞的阳性克隆，5μg/ml cTnI包被，100μl/孔，4℃过夜，洗涤液洗3次；1％BSA封闭，120μl/孔，37℃2小时，洗3次；取待检测杂交瘤细胞培养上清加到已包被抗原的板中，100μl/孔，37℃孵育2小时，洗3次；加入1∶500稀释的HRP标记羊抗鼠二抗(Sigma公司产品)，100μl/孔，37℃孵育2小时，洗3次；加OPD(天津市化学试剂二厂)显色，37℃下20分钟，2mol/L H₂SO₄终止反应，50μl/孔；用酶标仪测定492nm吸光度值(A492值)。阳性孔值大于阴性对照孔2倍以上者为阳性。有限稀释法对阳性克隆杂交瘤细胞进行克隆化培养。

11、单克隆抗体的制备、纯化及鉴定：

采用体内诱生法，预先给Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂，一周后注射筛选的能稳定分泌抗cTnI的阳性杂交瘤细胞，细胞数为：5×10⁶个/只；约一周后收集鼠腹水，并离心，3000转/分。采用辛酸-硫酸铵(天津大学科威公司生产)沉淀法纯化抗体，并用SDS-PAGE(Roche进口分装)检测纯度。抗体效价及浓度的测定：采用间接ELISA法测定杂交瘤细胞的培养上清、腹水效价，紫外分光光度计测定抗体浓度。

12、cTnI单克隆抗体性质的鉴定：

12.1单克隆抗体亚型鉴定：

按Sigma公司抗体亚型检测试剂盒说明书中的抗原介导的间接ELISA进行。

12.2Western-blot鉴定抗体特异性：

将cTnI行SDS-PAGE，电泳完毕后，转至PVDF膜(Millipore公司)，5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜，TBST洗涤3次；加入1∶1000稀释的纯化的cTnI McAb，37℃2小时，TBST洗涤3次；HRP标记羊抗鼠二抗(Sigma公司产品)1∶500稀释，37℃1小时，洗涤3次；ECM(北京博士德公司)显色。

12.3抗原竞争ELISA鉴定抗体亲和力：

将浓度为1mg/ml抗原，按1∶10，1∶100，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000梯度稀释，与纯化的cTnI McAb 4℃反应过夜；在已包被cTnI的板中加入梯度稀释的抗原抗体复合液，100μl/孔，37℃孵育2小时；加入适宜稀释度的HRP标记羊抗鼠二抗，37℃孵育2小时；加OPD显色，2mol/L H₂SO₄终止反应，50μl/孔；用酶标仪测定492nm吸光度值(A492值)。

按公式B＝(A₀-A_i)/A₀，B为抗体结合率，A₀和A_i分别是检测抗体和已结合抗原的抗体的A₄₉₂值。以抗原初始浓度i₀对B/(1-B)作图求得斜率即为亲和力常数。

结果：

1、所设计的引物序列为：

上游引物：F GGAATTCCATATGGCCGATGGTAGCAG；27bp，含NdeI酶切位点

下游引物：R CGGGATCCTCAGGGCAGGGGCAGTAG；26bp，含BamHI酶切位点。

2、目的基因的扩增：

琼脂糖凝胶电泳结果表明，在稍低于700bp处有明显的目的基因扩增条带，与预期结果一致(图1)。

3、pMD19-T/rhcTnI克隆质粒酶切鉴定：

提取的阳性克隆的质粒经NdeI和BamHI双酶切鉴定，酶切图谱和预期结果完全一致(图2)。阳性克隆测序结果与NCBI网站Gene bank提供的目的基因序列进行比对分析表明：二者具有100％的同源性，证明克隆载体构建成功。从图2可知所挑取的4个单克隆中，1、2和4泳道单克隆菌落PCR和双酶切鉴定均为阳性，而3泳道单克隆的鉴定结果为假阳性。基因测序验证：克隆载体中目的基因测序结果(见图3)；目的基因序列BLAST同源序列比对结果(见图5)，预测cTnI蛋白质的序列(如图11)。

结果表明：克隆载体中插入的外源基因序列长度为679bp(见图3)，将测序结果通过NCBI网站在线BLAST程序进行BLAST分析插入片段与目的基因的同源性，结果显示，插入片段与目的基因序列具有100％的同源性(图5)。目的基因已正确插入克隆载体中，且整个基因序列完全正确，表明已成功构建克隆载体。

4、pET-21a(+)/rhcTnI表达质粒的鉴定：

提取的表达质粒经NdeI和BamHI双酶切鉴定，酶切图谱和预期的结果完全一致(图6)，由图6可知所挑取的4个单克隆扩增培养后提取质粒进行双酶切鉴定均为阳性，目的条带出现的位置与理论相符，条带清晰，无杂带出现。

5、表达产物分析与鉴定：

SDS-PAGE结果见(图7)。在24000Da左右有明显的蛋白表达条带，与未诱导基因工程菌株和空白菌株对照，可证实为目的蛋白，与预期结果一致，目的蛋白主要以包涵体形式表达。凝胶扫描成像，BandScan软件分析显示目的蛋白表达量可达细菌总蛋白的38％。

6、目的蛋白抗原性检测：

图7表明所表达的目的蛋白抗原性良好，1∶100 000稀释后样品的浓度达到31.73ng/ml。

7、杂交瘤细胞株的建立：

采用间接ELISA法初筛选出的阳性克隆，经过三次有稀释克隆化培养，筛选出阳性率为100％的杂交瘤细胞，编号为：B10A6，并进行特性鉴定。经过辛酸-硫酸铵纯化的cTnI抗体：结果如图9所示。免疫球蛋白IgG分子量约为150kD，由两条分子量约为50kD的重链和两条分子量为25kD的轻链组成，图2所示结果符合这一点。

8、cTnI抗体效价及浓度测定：

cTnI McAb效价，腹水1∶16000，纯化后的效价为：1∶10000。浓度为5.63mg/ml。

9、cTnI单克隆抗体性质的鉴定：

cTnI单克隆抗体特异性经过Western-blot鉴定，结果见图10。结果显示，所制备的cTnI McAb与cTnI蛋白在分子量约24kDa处有一条明显的特异性反应带，与预期结果一致。

10、单克隆抗体亲和力：

经过抗原竞争ELISA实验，cTnI McAb的亲和力为：1.08×10-9mol/L。

11、单克隆抗体类型鉴定：

单克隆抗体免疫球蛋白类别及亚类分别为IgG和IgG3。

结论：

本发明获得了能够分泌抗cTnI的高质量的单克隆抗体的杂交瘤细胞CGMCC NO3951以及由其分泌的单克隆抗体，为建立cTnI的检测方法奠定了基础。

实施例2

心肌肌钙蛋白I初步临床应用效果实验

原理：应用双抗体夹心法测定标本中人心肌肌钙蛋白I水平，用纯化的人心肌肌钙蛋白I抗体包被微孔板条，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入标准品或样品，再与HRP-cTnI抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加TMB显色，呈蓝色，在酸的作用下最终呈黄色，颜色深浅与样品中cTnI含量成正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，确定其含量。

用本发明获得的cTnI的单克隆抗体包被的微孔板条(包被浓度5ug/ml)，取代进口cTnI试剂盒中自代的包被单抗的微孔板条，并与进口原装cTnI试剂盒同时检测40例健康体检者血清和38例AMI患者血清标本(天津总医院提供)，操作步骤按试剂盒说明书要求，将其结果进行比较。

结果：用本方法检测40例健康体检者血清中cTnI，40例为阴性，符合率为100％；同时检测38例AMI患者血清中cTnI，37例为阳性，1例为阴性，符合率为97.4％。

两种方法测定结果比较

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。