一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法

摘要

本发明涉及一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法，克服耗时长、成本高的缺陷，简化操作步骤，减少人工操作的干预错误，提高效率。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法。

技术背景

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了很多病患的生命。此外，间充质干细胞还用于糖尿病及其并发症、下肢缺血病变、心脑血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究，已经取得的临床试验结果令人鼓舞。

间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞质量高、纯净、数量多。脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。

干细胞库是在约为-196℃液氮中储存干细胞或相关资料的场所。骨髓和外周血干细胞库可分为资料库和实物库。资料库所做的工作是将健康者提供的骨髓或外周血干细胞进行HLA配型和资料登记，待需要时再采集其骨髓。实物库则是在进行细胞配型和资料登记的同时，采集和储存健康提供者可供移植用的干细胞。干细胞库按提供方式又分为公共库和自体库。公共库所储存的干细胞是他人的干细胞，以满足需要移植但自体干细胞没有保存的病人的需求。

现有脐带间充质干细胞库的构建方法，由下述步骤组成：(1)取人脐带进行检测，用缓冲液冲洗去除残留血液，剪碎，获得人脐带组织；(2)加入胶原酶消化；(3)加入缓冲液稀释消化后组织，混匀、离心；(4)弃上清，加入缓冲液重悬沉淀，过筛，收集滤液，离心，重复两次，即得人脐带间充质干细胞；(5)将获得的人脐带间充质干细胞置液氮保存，按ABO/Rh分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脐带间充质干细胞库。

现有脐带间充质干细胞库构建方法有以下不足。一是耗时长。公共库将干细胞制备出后冻存，每份干细胞入库周期长，步骤繁琐。二是成本高。供者脐带捐出后，存在公共库，等待需要的受者使用，在使用前每份脐带都制备出干细胞再冻存，所耗用试剂、材料、人工等较多，不是每一份干细胞都会用上，这就使得公共库的成本增高。

发明内容

为了解决现有技术的不足，克服耗时长、成本高的缺陷，简化操作步骤，减少人工操作的干预错误，提高效率。

本发明采取以下技术方案：

一种脐带间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：

1.取脐带用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液，轻轻冲洗脐带；

2.取6-8cm长脐带，加入2ml含体积比10％胎牛血清的DMEM培养基，在4℃下尽快剪切脐带，大小至0.5-1mm³；

3.收集脐带组织块，在850g条件下4℃离心10min；

4.弃上清，沉淀的组织块用二甲基亚砜与胎牛血清按体积比2∶8的比例混合的冻存液重悬；

5.分装入冻存管中，降温至-196℃，转入液氮保存；

6.按供者ABO/Rh血型和性别进行保存，建立可供检索的细胞信息档案；

7.使用时再进行脐带组织块复苏和原代培养、干细胞传代培养、干细胞冻存操作。

上述脐带组织块复苏、原代培养可采用以下操作：

1.从液氮中取出需要复苏的组织块，立即放入42℃无菌水浴箱中匀速反复摇晃，使其在2min中内融化；

2.取出其中的组织块加入到含体积比10％胎牛血清的DMEM培养基中，充分混匀；

3.在4℃，850g条件下，离心10min，弃上清液，用含体积比10％胎牛血清的DMEM培养基重悬组织块，接种，在培养箱中培养；

4.至24小时，补加培养基，以后每3天换一次培养基；

5.至12-17天，可以选择干细胞传代培养或者冻存。

上述冻存脐带组织块源MSC传代培养可采用以下操作：

1.弃尽培养皿中残留培养基，用PBS缓冲液冲洗两遍；

2.培养皿加入2ml含体积比0.25％胰蛋白酶的PBS缓冲液消化，待细胞间隙增大，细胞变短则将胰蛋白酶弃掉；倒置显微镜下见细胞变圆则每个培养皿各加入6ml含体积比10％胎牛血清的DMEM培养基，终止消化并吹打细胞；

3.将漂浮的细胞收集到离心管中，混匀细胞；

4.细胞悬液按照8000-10000/cm²的密度接种于培养皿，置于培养箱培养。

上述冻存脐带组织块源MSC冻存可采取以下操作：

1.弃每个培养皿的培养基，用PBS缓冲液冲洗两遍；

2.加入2ml含体积比0.25％胰蛋白酶的PBS缓冲液消化，待细胞间隙增大，细胞变短则将胰蛋白酶弃掉；倒置显微镜下见细胞变圆则每个培养皿各加入6ml含体积比10％FBS的DMEM培养基，终止消化并吹打细胞；

3.将漂浮的细胞收集到离心管中，混匀细胞；

4.取部分细胞接种于培养皿，置于培养箱中培养，待细胞融合50-80％时在4℃、600g条件下离心10min，弃上清液，将细胞弹起，加入提前预冷的冻存液冻存。

附图说明

图1：脐带组织块源间充质干细胞原代(10×)

图2：脐带组织块源间充质干细胞P1、P2代(10×)

图3：脐带组织块源间充质干细胞流式检测结果

技术效果

本发明的构建脐带间充质干细胞库的方法，简化操作步骤，减少人工操作的干预错误，提高效率，节约成本。

具体实施方式

一、脐带间充质干细胞库的构建步骤

1.取脐带进行血型检测(包括ABO/Rh血型检测)、微生物免疫检测，脐带用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液，轻轻冲洗脐带。所述的青霉素/链霉素溶液购自美国ScienCell公司，P/S(Penicillin/Streptomycin Solution)。

2.选脐带样本光亮度好，无破损，无水肿区域，取6-8cm长。

3.加入2ml含体积比10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养基，在4℃下尽快剪切脐带，大小至0.5-1mm³。

4.收集脐带组织块，在850g条件下4℃离心10min。

5.弃上清，沉淀的组织块用DMSO(二甲基亚砜)与FBS按体积比2∶8的比例混合的冻存液重悬。

6.分装入5ml冻存管中，(程控)降温至-196℃，转入液氮保存。

7.按供者ABO/Rh血型和性别进行保存，建立可供检索的细胞信息档案。

8.使用时再进行脐带组织块复苏和原代培养、干细胞传代培养、干细胞冻存等操作。

二、脐带组织块复苏、原代培养操作(见图1)

1.从液氮中取出需要复苏的组织块，立即放入42℃无菌水浴箱中匀速反复摇晃，使其在2min中内融化。

2.取出其中的组织块加入到含体积比10％FBS的DMEM培养基(购自Hyclone公司)中，充分混匀。

3.在4℃，850g条件下，离心10min，弃上清液，用含体积比10％FBS的DMEM培养基重悬组织块(3-4ml组织块沉淀加1ml培养基重悬)，接种，在37℃、5％CO2的培养箱中培养。

4.至24h(小时)，补加培养基，每个培养皿补加2ml新鲜含体积比10％FBS的DMEM培养基(不弃原来的培养基，只是添加新鲜的培养基)，以后每3天换一次培养基(弃去旧的培养基加入等量新鲜培养基)。

5.至15天左右，细胞克隆数量增多，克隆内细胞融合60-90％，可以选择细胞传代或者冻存。

三、冻存脐带组织块源MSC传代培养操作(图2)

1.弃尽培养皿中残留培养基，用PBS缓冲液冲洗两遍。

2.培养皿加入2ml含体积比0.25％胰蛋白酶的PBS缓冲液消化，待细胞间隙增大，细胞变短则将胰蛋白酶弃掉(在细胞没有漂浮前弃掉胰蛋白酶)；倒置显微镜下见细胞变圆则每个培养皿各加入6ml含体积比10％FBS的DMEM培养基，终止消化并吹打细胞。

3.将漂浮的细胞收集到50ml离心管中，混匀细胞，计细胞数量及活力。

4.细胞悬液按照8000-10000/cm²的密度接种于培养皿，置于37℃，5％CO₂的培养箱培养。

四、冻存脐带组织块源MSC冻存操作(图3)

1.每个培养皿留取2ml培养基，以备需氧菌及真菌检测之用，弃余下培养基，用PBS缓冲液冲洗两遍。

2.加入2ml含体积比0.25％胰蛋白酶的PBS缓冲液消化，待细胞间隙增大，细胞变短则将胰蛋白酶弃掉(在细胞没有漂浮前弃掉胰蛋白酶)；倒置显微镜下见细胞变圆则每个培养皿各加入6ml含体积比10％FBS的DMEM培养基，终止消化并吹打细胞。

3.将漂浮的细胞收集到50ml离心管中，混匀细胞，计细胞数量及活力。

4.将上述每个培养皿中留取的培养基用无菌注射器打入需氧菌检测瓶中，置细菌培养仪中培养15天，检测需氧菌及真菌。

5.取部分细胞接种于培养皿，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞融合50-80％时用于支原体检测；留取5×10⁵-1×10⁶细胞，以用于流式细胞仪鉴定，鉴定指标为CD34，CD45，CD44，CD105，CD146，HLA-DR。

6.剩余细胞悬液，在4℃、600g条件下离心10min，弃上清液，将细胞弹起，加入提前预冷的冻存液(用DMSO(二甲基亚砜)与FBS按体积比2∶8的比例混合的冻存液)，冻存。