基于Solexa测序法的检测人类乳头瘤病毒的方法

摘要

本发明涉及人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)的检测方法，特别是基于Solexa测序法的HPV检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)的检测方法，特别是基于Solexa测序法的HPV检测方法。

背景技术

宫颈癌是世界上女性癌症的第二号杀手，仅次于乳腺癌。每年全世界约有50万新发病例，25万死亡病例，其中发展中国家占2/3。我国是宫颈癌的高发区，占全球宫颈癌总数的10％。研究表明，人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌有着密切关系，是重要的致癌因子，同时也是引发宫颈癌的必要条件之一。已经表明，超过100种的HPV能够感染皮肤(皮肤类型)或呼吸道和肛门生殖道的粘膜(粘膜类型)，超过40种的HPV能够感染子宫颈。基于诱导的良性的，恶化前的或恶性的病变，将HPV分别分为低危型(例如HPV6，11，42，43和44)和高危型(例如HPV16，18，31，33和45)。因此，对HPV感染的及早发现和正确分型对宫颈癌防治显得至关重要。

目前HPV的检测方法主要有以下几种：①细胞学检查，其利用宫颈刮片细胞学检查或液基薄层细胞学检查，藉由细胞外观形态的转变来加以诊断。对于HPV感染，镜下可见挖空细胞、角化不良以及湿疣外底层细胞。其局限性在于，HPV感染的诊断的灵敏性和特异性较低。②免疫组化方法，其通过检测HPV的衣壳抗原来进一步明确HPV感染，其所得的阳性反应定位明确，判断可靠。但是，衣壳抗原仅在HPV-DNA复制成熟后才产生，因此，诊断为阴性的受试者并不能被确定为不被HPV感染，该方法灵敏性较低。③实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)，其主要是应用荧光检测PCR仪，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累对PCR过程中每一个循环产生的扩增产物进行实时监测，从而对模板的初始浓度进行定量。此方法通量较低。④杂交捕获法(主要为HC-II系统)，其是目前唯一获得美国FDA认证的可用于临床的HPV DNA检测方法，并且其已获得欧洲CE及中国SDA认证。该方法使用专用的标本采集保存器；已获得专利保护的全长8000bp的RNA探针以及已获得专利保护的特异性第一抗体。其原理是将核酸探针杂交到受测检体的HPVDNA上，再通过化学荧光或酶反应借助增幅的信号进行检测。该方法所使用的核酸探针主要分为两种：针对低危险型HPV的核酸探针和针对高危险型HPV的核酸探针。该方法可用于HPV的初步筛检，但是不能确定HPV的特定类型，也不能确定多重感染的情况。

将上述检测方法联合使用，可以提高HPV检测的灵敏性并降低检测的假阴性率。然而，这些方法的组合成本相对较高，一般只适用于经济发达地区的HPV检测和宫颈癌筛查。对于经济较不发达地区，特别是在山区和广大农村地区，上述检测方法的联合使用存在着较大的局限性。因此，开发适合的、低成本的HPV检测方法，是亟待解决的问题。

另一方面，目前已知的HPV检测方法，例如上文描述的那些检测方法，通量都较低。当对大规模的样品进行HPV检测时，应用上述方法是耗时耗力的，并且成本高昂。因此，本领域迫切需要新的高通量的、低成本的HPV检测方法。

发明内容

本发明基于Solexa测序法以及PCR标签(PCR index)，开发了新型的HPV检测方法以及用于此的试剂盒。根据本发明的方法和试剂盒不仅可以实现HPV的高通量、低成本检测，而且可以实现HPV的精确分型。

定义

为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“PCR”是指聚合酶链式反应。

如本文中所使用的，术语“Solexa测序法”是指近几年开发的新一代DNA测序法，也称为第二代测序法。Solexa测序法与传统测序法(例如，Sanger测序法)的不同之处在于，其采用边合成边测序的原理进行DNA序列分析。Solexa测序法具有下述优点：1)成本低，仅为传统测序成本的1％；2)通量高，可以同时对多个样品进行测序，并且进行一次的Solexa测序法可以产生大约500亿(50G)个碱基的数据；3)精确性高(高于98.4％)，有效的解决了多聚重复序列的读取问题。另一方面，高测序通量在进行测序的序列的数目确定的情况下，又反过来提高了序列的测序深度(例如，针对每个序列，可以进行多次测序)，从而确保了测序结果的可靠性。如本文所使用的，术语“测序深度”是指一段DNA序列在测序数据中集中出现的次数。测序深度可以通过将测序量除以基因组长度来计算，例如测序深度为10，表示测了10次的整个基因组。

Solexa测序法的应用十分广泛。其可以用于基因组测序，基因分型，基因多态性研究等等。本发明的方法将Solexa测序法用于检测HPV：通过对待分析的样品进行针对HPV的测序，然后使用本领域已知的比对程序，例如BLAST和SOAP，将所得的测序结果与HPV数据库中的参考序列进行比对，从而实现对样品所感染的HPV的精确分型。本文中使用的HPV数据库包含本领域已知的HPV类型的序列，所述序列可见于例如公共数据库，例如NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

如本文中可互换使用的，术语“PCR标签(PCR index)”、“标签(index)”或“引物标签(primer index)”是指添加在PCR引物5′末端的一小段碱基序列，其通过PCR扩增可以用于标记PCR产物，从而辨别不同模板来源的PCR产物的混合物中各个PCR产物的模板来源。通过在引物的5′末端添加标签，可以对PCR产物进行标记，从而可以将多个不同的PCR产物混合成一个文库，用于进一步的分析和处理。文库中各个不同的PCR产物各自具有独特的标签，从而根据各个PCR产物中独特的标签，可以将各个不同的PCR产物互相区分开来，并将其与PCR模板一一对应。

例如，当需要对多个样品进行测序时，可以在用于各个样品的引物的5′末端添加不同的标签，然后用添加了标签的引物分别对各个样品进行PCR反应，从而对各个样品(即，PCR产物)进行标记。PCR反应后，可以将来自各个样品的带有不同标签的PCR产物混合在一起组成一个文库，然后应用高通量的Solexa测序法同时对文库中的各个PCR产物进行测序。最终，在所得的测序数据中，通过独特的标签，可以将测序结果与各个PCR产物(从而样品模板)一一对应。

可以仅在用于PCR扩增的引物对的一条引物中引入标签，也可以在引物对的两条引物中都引入标签。当在引物对的两条引物中都引入标签时，每个PCR引物对与一对标签组合成一对标签引物，其中正向和反向PCR引物的5′端分别具有正向标签和反向标签，并且正反标签和正反引物序列是对应的，且正向标签和反向标签可以是相同的，或不同的。

设计标签时需要考虑多种因素，包括：1)标签序列中应当避免3个或3个以上的单碱基重复序列；2)所有标签的同一位点中碱基A和碱基C的总含量应在所有碱基含量的30％-70％之间，例如，当设计100条不同的标签序列时，每一条标签序列的第二个碱基(即，所谓的同一位点)中A和C占该100条序列第二个碱基总量的30％-70％；3)标签序列本身的GC含量应在40-60％之间；4)标签之间的序列差异应大于4个碱基；5)标签序列中应避免出现与用于测序的引物相似度高的序列；6)当标签序列添加到PCR扩增引物上后，应避免PCR扩增引物形成发卡结构和二聚体等二级结构。

如本文中所使用的，术语“标签引物(index primer)”是指带有标签的引物，其包含2个部分，标签部分和引物部分，其中标签部分用于在PCR扩增反应中标记PCR产物，而引物部分与模板碱基互补配对，用于扩增模板，并且其中标签部分，任选地通过连接序列，连接至引物部分的5′端。

如本文中所使用的，术语“接头(adapter)”或“文库接头(libraryadapter)”是指经设计的一段碱基序列，其可以连接至文库中的扩增后的PCR产物上，从而文库中的所有扩增后的PCR产物都可以借助该接头进行测序，例如，使用针对该接头设计的测序引物(而无需使用针对各PCR产物设计的特异性测序引物)进行测序。优选地，本发明的接头可以通过“PCR-FREE”方法连接至PCR产物上。

如本文中所使用的，术语“PCR-FREE”是指不进行PCR反应而直接将接头连接至PCR产物上，例如通过使用DNA连接酶将接头连接至PCR产物上。利用PCR-Free方法来构建测序文库是本领域技术人员已知的，参见例如，Nature Methods 6，291-295(2009)。“PCR-FREE”方法由于整个过程无需进行PCR而具有以下有利方面：1)减少了纯化步骤，降低了花费的时间和成本；2)减少了非特异性扩增；3)在含有许多序列高度相似的PCR产物的文库的构建过程中，避免由PCR引入错误，从而提高最后的测序结果的准确性。

如本文中所使用的，本发明的方法和试剂盒可以使用至少1种接头。不同的接头可以共有相同的一段序列(在本文中称为“测序序列”)，并且可进一步包含不同的特征序列，从而，不同的接头可以共用相同的引物(其针对相同的测序序列进行设计)进行测序，并且利用独特的特征序列可以辨别多个文库的混合物中各个PCR产物的文库来源，即，对不同文库来源的PCR产物进行进一步的标记。

将标签与具有不同特征序列的接头组合，可以大大提高标记的效率(参见图1)。例如，使用100种标签可以标记100个样品，而使用100种标签和200种具有不同特征序列的接头，可以标记100*200＝20000个样品。

因此，本发明的一个方面提供了一组标签，其包含至少10种，优选至少20种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种或95种标签，并且所述标签具有选自SEQ ID NO：1-95的序列。在一个优选实施方案中，该组标签至少包括SEQ ID NO：1-10，或SEQ ID NO：11-20，或SEQ ID NO：21-20，或SEQ ID NO：31-40，或SEQ ID NO：41-50，或SEQ ID NO：51-60，或SEQ ID NO：61-70，或SEQ ID NO：71-80，或SEQ ID NO：81-90，或SEQ ID NO：91-95所示的标签，或者其任何两个或者多个的组合，例如SEQ ID NO：1-95所示的标签。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的标签用于标记SEQ IDNO：96-106所示的PCR引物，从而用于进行高通量HPV测序、检测或分型。

本发明的一个方面提供了一种标签引物组，其包含11种标签引物，所述标签引物的序列包含标签序列和PCR引物序列，并且所述标签序列，任选地通过连接序列，连接至所述PCR引物序列的5′端，其中

1)所述标签序列选自SEQ ID NO：1-95，且标签引物组中的11种标签引物的每一种的标签序列都相同，和

2)所述11种标签引物的PCR引物序列分别如SEQ ID NO：96-106所示。

本发明的标签引物组可扩增出至少16种大约170bp的产物，其对应于HPV基因组中最为保守的基因区(L1区)中的一段高度保守的DNA序列。因此，本发明的标签引物组可用于HPV的精确分型。

在一个优选实施方案中，本发明的标签引物组可用于HPV测序、检测或分型，从而其可用于医疗用途，例如诊断HPV的存在和确定HPV的类型等，以及非医疗用途，例如构建HPV数据库，鉴定HPV的新的类型和亚型，研究HPV类型分布的地域性特点，流行病学研究和疫苗研制等。在另一个优选实施方案中，本发明的标签引物组可用于制备试剂盒，所述试剂盒可用于HPV测序、检测或分型。

本发明的另一个方面提供了一种标签引物套组，其包含至少10个，优选至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或95个上文描述的标签引物组。优选地，标签引物套组中，各个标签引物组所使用的标签序列互不相同。更优选，标签引物套组中所使用的标签序列至少包括SEQ IDNO：1-10，或SEQ ID NO：11-20，或SEQ ID NO：21-20，或SEQ ID NO：31-40，或SEQ ID NO：41-50，或SEQ ID NO：51-60，或SEQ ID NO：61-70，或SEQ ID NO：71-80，或SEQ ID NO：81-90，或SEQ ID NO：91-95所示的标签序列，或者它们任何两个或者多个的组合，例如SEQID NO：1-95所示的标签序列。

在一个优选实施方案中，本发明的标签引物套组可用于高通量HPV测序、检测或分型，从而其可用于医疗用途，例如大规模的HPV相关疾病的诊断和HPV的精确分型(为临床诊断和治疗方案选择提供依据)等，以及非医疗用途，例如构建HPV数据库，鉴定HPV的新的类型和亚型，研究HPV类型分布的地域性特点，流行病学研究和疫苗研制等。在另一个优选实施方案中，本发明的标签引物套组可用于制备试剂盒，所述试剂盒可用于高通量HPV测序、检测或分型。

本发明的另一个方面提供了一种试剂盒，其包含上文描述的标签引物组或标签引物套组。优选，本发明的试剂盒还包含至少1种，优选至少2种、至少10种、至少20种、至少30种、至少40种、至少50种、至少100种或至少200种接头。在一个优选实施方案中，所述接头适用于Solexa测序法，例如其可用于构建测序文库，例如所述接头可具有选自SEQ ID NO：121-132的序列。在一个优选实施方案中，通过PCR-FREE方法，例如DNA连接酶法，使用接头来构建测序文库。

在一个优选实施方案中，本发明的试剂盒可用于高通量HPV测序、检测或分型，并且如上所述，其可用于医疗用途和非医疗用途。

本发明的另一个方面提供了用于对一个或多个样品进行HPV测序、检测或分型的方法。所述方法包括使用上文描述的标签引物组或标签引物套组或试剂盒对各个样品的DNA进行扩增，然后进行测序以获得样品的序列的步骤。

本发明的另一个方面提供了用于对一个或多个样品进行HPV测序、检测或分型的方法，其包括下列步骤：

提供n个样品，n为大于等于1的整数，所述样品优选地来自哺乳动物，更优选是人，且优选是脱落细胞；可选地，将待分析的n个样品分成m个小组，m为整数且n≥m≥1；

1)对于每一个样品，使用一个标签引物组对样品的DNA进行扩增，其中

所述标签引物组包含11种标签引物，所述标签引物的序列包含标签序列和PCR引物序列，并且所述标签序列，任选地通过连接序列，连接至所述PCR引物序列的5′端，其中

i)所述标签序列选自SEQ ID NO：1-95，并且所述11种标签引物的每一种的标签序列都相同，和

ii)所述11种标签引物的PCR引物序列分别如SEQ ID NO：96-106所示，

其中，不同的样品使用的标签引物组可以相同或者不同，并且不同的标签引物组使用不同的标签序列；

2)将步骤1)中的使用不同标签引物组进行扩增所获得的扩增产物混合在一起，得到一个或多个PCR产物文库；

3)通过PCR-FREE方法，例如DNA连接酶法给步骤2)中获得的一个或多个PCR产物文库分别添加接头，从而构建一个或多个测序文库，其中不同的测序文库所使用的接头可以相同或者不同，且不同的接头共有相同的测序序列，但具有不同的特征序列；

4)任选地，将步骤3)中获得的使用不同接头的测序文库混合在一起，得到一个或多个文库混合物；

5)对步骤3)中获得的一个或多个测序文库或步骤4)中获得的一个或多个文库混合物分别进行测序，其中利用二代测序技术，优选Pair-End技术(例如Solexa、Illumina Hiseq 2000)进行测序；

6)根据标签引物组的标签引物序列，或者根据标签引物组的标签引物序列以及接头的特征序列，将测序结果与样品一一对应；

其中所述样品优选是脱落细胞，且优选来源于动物，例如人。

在优选的实施方案中，本发明的方法使用至少10个，优选至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或95个上文描述的标签引物组。进一步优选地，所使用的标签序列至少包括SEQ ID NO：1-10，或SEQ ID NO：11-20，或SEQ ID NO：21-20，或SEQ ID NO：31-40，或SEQ ID NO：41-50，或SEQ ID NO：51-60，或SEQ ID NO：61-70，或SEQ ID NO：71-80，或SEQ ID NO：81-90，或SEQ ID NO：91-95所示的标签序列，或者它们任何两个或者多个的组合，例如SEQ ID NO：1-95所示的标签序列。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，本发明的方法使用至少1种，优选至少2种、至少10种、至少20种、至少30种、至少40种、至少50种、至少100种或至少200种接头，例如所述接头可具有选自SEQ ID NO：121-132的序列。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，在测序后，将获得的样品序列与上文描述的HPV数据库中的序列进行对比，从而对样品进行HPV精确分型。

在本发明的另一个方面，本发明基于Solexa测序法提供了用于对多个样品进行高通量HPV测序、检测或分型的方法，所述样品优选是脱落细胞，且优选来源于动物，例如人，所述方法包括下列步骤：

1)将待分析的样品分成m个小组，m为≥1的整数；

2)对每个样品小组进行如下步骤：

2a)从待分析的样品中提取DNA；

2b)根据用于扩增HPV DNA的引物组中的所有引物的序列，设计一套标签，标签的个数n等于该样品小组的样品数目；

2c)将2b)中设计的每一个标签分别添加至引物组的所有正向引物或所有反向引物或所有引物的序列的5′末端，从而提供n个标签引物组；

2d)使用2c)中提供的标签引物组对2a)中获得的样品DNA进行PCR扩增，从而提供PCR产物，其中针对每个样品DNA，使用不同的标签引物组；和

2e)将2d)中的所有PCR产物混合在一起，获得PCR产物文库；

3)给2)中得到的PCR产物文库加上接头，其中各个PCR产物文库使用不同的接头，从而构建m个测序文库，其中各个接头共有相同的测序序列，而具有互不相同的特征序列；

4)将m个测序文库混合在一起，利用二代测序技术，优选Pair-End技术(例如Solexa、Illumina Hiseq 2000)进行测序；得到所有样品的测序结果；

5)根据测序结果中的接头的特征序列、标签的序列以及引物的序列，将获得的测序结果与样品一一对应；和任选地，将每个样品的测序结果与HPV数据库进行比对，从而实现HPV测序、检测或分型。

在一个优选实施方案中，使用本领域技术人员熟知的方法进行DNA提取。例如，可以使用自动化的DNA提取仪和DNA提取试剂盒进行DNA提取，例如可商购获得的KingFisher自动提取仪，例如美国Thermo Scientific Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统。

在一个优选的实施方案中，2b)中的引物组包含11条引物，其序列分别如SEQ ID NO：96-106所示。这11条引物组成的引物组可扩增出至少16种大约170bp的产物，其对应于HPV基因组中最为保守的基因区(L1区)中的一段高度保守的DNA序列。因此，通过对该扩增产物进行精确测序，可以实现HPV的精确分型。

在又一个优选的实施方案中，2b)中设计的标签的个数为至少10个，优选至少20个，至少30个，至少40个，至少50个，至少60个，至少70个，至少80个，至少90个，或至少100个。优选，标签可具有选自SEQ ID NO：1-95的序列。在优选的实施方案中，不同样品小组之间的所使用的标签可以相同或者不同。在优选的实施方案中，引入正向引物的标签与引入反向引物的标签可以相同或者不同。在特别优选的实施方案中，2b)中设计的标签至少包括SEQ ID NO：1-10，或SEQ ID NO：11-20，或SEQ ID NO：21-20，或SEQ ID NO：31-40，或SEQ ID NO：41-50，或SEQ ID NO：51-60，或SEQ ID NO：61-70，或SEQ ID NO：71-80，或SEQ ID NO：81-90，或SEQ ID NO：91-95所示的标签，或者它们任何两个或者多个的组合。在特别优选的实施方案中，2b)中设计的标签如SEQ ID NO：1-95所示。

在一个优选的实施方案中，使用PCR-FREE方法，给PCR产物文库加上接头，例如使用DNA连接酶。特别地，在本发明的方法中，由于不同HPV类型之间的DNA序列高度相似，因此，本发明的测序文库的构建必须通过PCR-FREE方法来完成。相反，如果通过采用常规的pooling PCR将接头连接至PCR产物上来构建测序文库，那么所得到的文库中将含有大量的与原模板不一致的产物，导致不能对原模板进行准确测序。在一个优选的实施方案中，使用的接头的数目为至少1种，优选至少2种、至少10种、至少20种、至少30种、至少40种、至少50种、至少100种或至少200种，例如所述接头可具有选自SEQID NO：121-132的序列。

在本发明的方法的优选实施方案中，接头是可商购获得的接头，例如可购自Illumina公司的PCR-free Index Adapter Oligo Mix。在另外的实施方案中，本发明也可使用下列PCR-free接头(下划线部分为接头的特征序列)。

PCR-free接头1(SEQ ID NO：121)：ATCACG

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头2(SEQ ID NO：122)：CGATGT

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头3(SEQ ID NO：123)：TTAGGC

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头4(SEQ ID NO：124)：TGACCA

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头5(SEQ ID NO：125)：ACAGTG

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头6(SEQ ID NO：126)：GCCAAT

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头7(SEQ ID NO：127)：CAGATC

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头8(SEQ ID NO：128)：ACTTGA

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头9(SEQ ID NO：129)：GATCAG

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATCAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头10(SEQ ID NO：130)：TAGCTT

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头11(SEQ ID NO：131)：GGCTAC

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

PCR-free接头12(SEQ ID NO：132)：CTTGTA

5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

在一个优选的实施方案中，本发明的方法使用Solexa测序仪(例如，Illumina Genome Analyzer IIx测序仪)进行Solexa测序法。在另外的优选的实施方案中，HPV数据库包含本领域已知的HPV类型的序列，所述序列例如可见于例如公共数据库，例如NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，样品可以是脱落细胞。在另一个优选实施方案中，样品可以来源于动物，优选哺乳动物，更优选人。

发明的有益效果

本发明的新型的HPV检测方法和用于此的试剂盒相对于现有技术具有以下有利方面。

1)高通量。通过使用标签与具有不同特征序列的接头，进行一次本发明的方法，可检测甚至10000份样品，从而本发明的方法可以广泛用于疾病普查工作，成为早期诊断疾病的有效手段。

2)低成本。本发明采用Solexa测序法进行测序，测序成本大大降低(仅为常规测序法的1％)，从而HPV检测成本大大降低。

3)可对HPV进行精确分型。通过使用多条引物(例如本发明的6条正向引物和5条反向引物)进行扩增，并将扩增产物的序列信息与HPV数据库进行比对，可以精确地确定HPV的类型，从而为临床诊断和治疗方案选择提供依据。

另外，使用本发明的方法还有利于发现新的HPV类型，包括已有的类型中的新的亚型和变异体，为科学研究提供更有效和方便的工具。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1为经标签和具有独特的特征序列的接头标记后的PCR产物的示意图。在本发明的示例性方法中，通过PCR在每个样品的PCR产物两端同时引入标签；把多个带有不同标签的PCR产物混合在一起，用于构建测序文库。在测序文库的构建过程中，当需要时，可以构建多个测序文库时，其中通过使用具有不同特征序列的接头，来标记各个测序文库。文库构建完毕后，经具有不同特征序列的接头标记的多个测序文库可以混合在一起，并用Solexa测序法进行同时测序(不同的测序文库之间所使用的标签可以相同或不同)。最后，根据测序结果中的接头的特征序列和标签的序列信息，可将测序结果与每个样品一一对应。

图2为部分PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。从电泳图上可观察到，PCR产物条带的大小为约170bp。其中，泳道M是50bp DNA分子梯，泳道1-14为随机挑选的HPV阳性样本的PCR产物。

具体实施方式

采用本发明的方法，对190份已知HC-II结果的样品进行HPV基因分型，结果发现：采用本发明的方法所得的结果不仅与已知的HC-II结果一致，而且实现了对HPV的精确分型。

实施例1：样品提取

根据厂商的说明书，使用KingFisher自动提取仪(美国ThermoScientific Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统)从190份已知HC-II结果的脱落细胞中提取DNA。使用程序“Bioeasy-200μl BloodDNA_KF.msz”，进行核酸提取。程序结束后，获得100μl左右的洗脱产物(提取的DNA)，用作下一步PCR扩增中的模板。

实施例2：PCR扩增

把实施例1中获得的190份DNA依次编号为1-190，并平均分为2组(HPV-1组：编号1-95；HPV-2组：编号96-190)。根据用于扩增HPV DNA的引物组(包括6条正向引物和5条反向引物)的各条引物的序列(表2，SEQ ID NO：96-107)，设计一套标签，共95个(表1，SEQ ID NO：1-95)。将设计的每一个标签分别添加至引物组的各条引物的序列的5′末端，从而获得95个标签引物组，其中每个标签引物组包括相应的6条正向标签引物和5条反向标签引物，并且不同的标签引物组使用不同的标签(即，95个标签引物组与95个标签一一对应)。

在96孔板中对所有样品进行PCR反应，共使用2块板(HPV-1组和HPV-2组各1块板)。使用实施例1中获得的DNA作为模板，并且在HPV-1组和HPV-2组(各95个样品)中，针对每个样品，使用不同的标签引物组进行PCR扩增(即，95个样品与95个标签引物组一一对应)。记录下每一个标签引物组(每一个标签)对应的样品的编号信息。每块板中还设置一个不添加模板的阴性对照。2块板中的阴性对照所用的引物分别与样品1和样品96所用的引物相同。

表1：标签与样品的相关信息。

  标签编号  标签序列  对应96孔板位置 对应样品(组1) 对应样品(组2) SEQ ID NO：  PI-1  GCTGCGACTC  A1  1  96  1  PI-2  GTGTAGATAC  A2  2  97  2  PI-3  CTGATATCTA  A3  3  98  3  PI-4  ACGATGCTAT  A4  4  99  4  PI-5  TAGACTAGAC  A5  5  100  5  PI-6  CTGTCTGTGT  A6  6  101  6  PI-7  GCATACTGAC  A7  7  102  7  PI-8  CTGCTCGCAT  A8  8  103  8  PI-9  CATGAGTAGA  A9  9  104  9  PI-10  TCTCACTATG  A10  10  105  10  PI-11  TGTACTACTA  A11  11  106  11  PI-12  GTAGACTAGT  A12  12  107  12  PI-13  ATATGCTACT  B1  13  108  13  PI-14  CACTCGCTGT  B2  14  109  14

  PI-15  CATCACGCAC  B3  15  110  15  PI-16  AGCATGTGAT  B4  16  111  16  PI-17  AGCTAGTAGA  B5  17  112  17  PI-18  GCTATGTAGT  B6  18  113  18  PI-19  TACGATGATG  B7  19  114  19  PI-20  TACGCTGTAC  B8  20  115  20  PI-21  TATGTGTACT  B9  21  116  21  PI-22  TGACTCAGAC  B10  22  117  22  PI-23  TCGTAGCTCA  B11  23  118  23  PI-24  GAGACTCGTA  B12  24  119  24  PI-25  CTAGATGTCA  C1  25  120  25  PI-26  GATGACTCTC  C2  26  121  26  PI-27  TCAGTCGCAC  C3  27  122  27  PI-28  TGTAGTGAGT  C4  28  123  28  PI-29  TCATCGTAGA  C5  29  124  29  PI-30  TAGCATCTGT  C6  30  125  30  PI-31  TAGTAGTCGT  C7  31  126  31  PI-32  CTATACGTGC  C8  32  127  32  PI-33  CGACTGTAGA  C9  33  128  33  PI-34  GATGTCATGT  C10  34  129  34  PI-35  GTCTCGACTG  C11  35  130  35  PI-36  AGCTGACGAT  C12  36  131  36  PI-37  ATGATATAGT  D1  37  132  37  PI-38  ATGTGCTCTA  D2  38  133  38  PI-39  CTCACTCGAT  D3  39  134  39

  PI-40  GCTGCGACTC  D4  40  135  40  PI-41  GAGTCATGTC  D5  41  136  41  PI-42  CATACGCTCA  D6  42  137  42  PI-43  CACTCTCGTC  D7  43  138  43  PI-44  GCACTAGATG  D8  44  139  44  PI-45  AGTACGCATG  D9  45  140  45  PI-46  TCTGTGACGT  D10  46  141  46  PI-47  TAGCTCATCT  D11  47  142  47  PI-48  AGCATACACT  D12  48  143  48  PI-49  GCTATAGTCA  E1  49  144  49  PI-50  CGTCTCATGC  E2  50  145  50  PI-51  GCTACTACGT  E3  51  146  51  PI-52  GAGTGTACTA  E4  52  147  52  PI-53  GTCATACGTG  E5  53  148  53  PI-54  TATGAGAGAT  E6  54  149  54  PI-55  ATCTGAGTAC  E7  55  150  55  PI-56  CGATAGCATC  E8  56  151  56  PI-57  ACTGATCTCA  E9  57  152  57  PI-58  CTCGATACTA  E10  58  153  58  PI-59  CATGTGACTG  E11  59  154  59  PI-60  CGCATCACTA  E12  60  155  60  PI-61  GCATATATCT  F1  61  156  61  PI-62  CTGATGCGAC  F2  62  157  62  PI-63  TCTCAGAGTC  F3  63  158  63  PI-64  CAGTGCGAGT  F4  64  159  64

  PI-65  ATCTCTGATG  F5  65  160  65  PI-66  GCTAGTAGTC  F6  66  161  66  PI-67  ATGAGTCGTC  F7  67  162  67  PI-68  ATCACTCAGA  F8  68  163  68  PI-69  TCTCTCTGAT  F9  69  164  69  PI-70  CTCTAGTGCT  F10  70  165  70  PI-71  CGTCGTGCTA  F11  71  166  71  PI-72  CGACTACTAT  F12  72  167  72  PI-73  GCACGTCGAT  G1  73  168  73  PI-74  GTAGTGCTCT  G2  74  169  74  PI-75  CTGACGAGCT  G3  75  170  75  PI-76  CTATAGTCTA  G4  76  171  76  PI-77  ACACGCACTA  G5  77  172  77  PI-78  CTCGCACTAC  G6  78  173  78  PI-79  AGATCTCACT  G7  79  174  79  PI-80  ATACTAGTGT  G8  80  175  80  PI-81  ATATCTCGTA  G9  81  176  81  PI-82  TGACTGCGTA  G10  82  177  82  PI-83  TGTAGACGTA  G11  83  178  83  PI-84  AGAGACTATG  G12  84  179  84  PI-85  GTCGAGTCAC  H1  85  180  85  PI-86  TGACAGCTAC  H2  86  181  86  PI-87  CGCTAGACAT  H3  87  182  87  PI-88  CGTAGATATG  H4  88  183  88  PI-89  TGAGTCTGCT  H5  89  184  89

  PI-90  TAGTCGTATG  H6  90  185  90  PI-91  CATACACGAC  H7  91  186  91  PI-92  CGCTCAGAGA  H8  92  187  92  PI-93  GTGAGTCTCA  H9  93  188  93  PI-94  GACAGATGAT  H10  94  189  94  PI-95  GCTGTGCGAC  H11  95  190  95

表2：未添加标签的用于扩增HPV DNA的引物组的各条引物的序列信息。

  引物编号  引物序列 SEQ ID NO：  F1  TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC  96  F2  TTTGTTACTGTGGTGGATACTAC  97  F3  TTTGTTACCGTTGTTGATACTAC  98  F4  TTTGTTACTAAGGTAGATACCACTC  99  F5  TTTGTTACTGTTGTGGATACAAC  100  F6  TTTGTTACTATGGTAGATACCACAC  101  R1  GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCT  102  R2  GAAAAATAAATTGTAAATCATACTC  103  R3  GAAATATAAATTGTAAATCAAATTC  104  R4  GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC  105  R5  GAAAAATAAACTGCAAATCATATTC  106

注：F表示正向引物，R表示反向引物。

使用下列PCR参数进行扩增：

95℃30秒→48℃30秒→72℃30秒(40个循环)

72℃10分钟→12℃∞

PCR反应体系为25μl，其组成是(所有试剂均购自Enzymatics公司)：

  试剂  体积/反应  水(HPLC级)  14.375μl  10x Ex Taq缓冲液(Mg²⁺plus)  2.5μl  dNTP混合物(各2.5mM)  2μl  带有标签的F1/F2/F3/F4/F5/F6的混合物(各7.5pmol)  0.5μl  带有标签的R1/R2/R3/R4/R5的混合物(各7.5pmol)  0.5μl  Ex Taq HS(5U/μl)  0.125μl  模板DNA  5μl  总体积  25μl

PCR反应在Bio-Rad公司的PTC-200PCR仪上运行。PCR完成后，取3μl PCR产物在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测(图2)。

实施例3：PCR产物的混合和纯化

把HPV-1组与HPV-2组中剩余的PCR产物各混合在一个3ml的EP管中(同样标记为HPV-1组和HPV-2组)，并震荡混匀。从2管混合物中各取出500μl DNA，并根据厂商的说明书，使用Qiagen DNAPurification试剂盒进行过柱纯化，得到200μl DNA。使用Nanodrop8000(Thermo Fisher Scientific公司)，测定纯化后的混合物的DNA浓度分别为98ng/μl(HPV-1组)和102ng/μl(HPV-2组)。

实施例4：Solexa测序文库的构建

4.1：末端修复反应

使用Thermomixer(Eppendorf公司)，对实施例3中获得的经纯化的两管DNA混合物分别进行DNA末端修复反应。修复反应的反应体系为100μl，其组成是(所有试剂均购自Enzymatics公司)：

  试剂  体积/反应  上一步所得的DNA  75μl  20x多核苷酸激酶缓冲液(B904)  10μL  dNTP混合物(各20mM)  4μL  T4DNA聚合酶  5μL  Klenow片段  1μL  T4多核苷酸激酶  5μL  总体积  100μL

反应条件为：20℃，30分钟。

根据厂商的说明书，使用QIAquick PCR Purification试剂盒纯化并回收DNA末端修复反应的产物。回收的产物溶于34μl EB(QIAGENElution Buffer)中。

4.2：3′末端加A反应

使用Thermomixer(Eppendorf公司)，对回收的DNA进行3′末端加A反应。反应体系为50ul，其组成是(所有试剂均购自Enzymatics公司)：

  试剂  体积/反应  上一步所得的DNA  32μl  dATP(1mM，GE公司)  10μl  10x Blue缓冲液  5μl  Klenow(3′-5′exo-)  3μl  总体积  50μl

反应条件为：37℃，30分钟。

根据厂商的说明书，使用MiniElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化并回收3′末端加A反应的产物。回收的产物溶于20μl的EB中。

4.3：添加Solexa接头

使用Thermomixer(Eppendorf公司)，对上一步获得的2种产物分别添加不同的接头以构建2个测序文库。记录下接头和文库的对应关系。

添加Solexa接头的反应体系为50ul，其组成是(所有试剂均购自Illumina公司)：

  试剂  体积/反应  上一步所得的DNA  11μL  2x快速连接缓冲液  15μL  PCR-free Index Adapter Oligo Mix(25mM)  1μL  T4DNA连接酶(快速，L603-HC-L)  3μL  总体积  30μL

反应条件为：20℃，15分钟。

根据厂商的说明书，使用Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)纯化反应产物并将产物溶于17μl去离子水。使用Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent公司)和荧光定量PCR(QPCR)测定产物的DNA浓度，结果如下：

  2100(nM)  qPCR(nM)  HPV-1组  20.4  24.2  HPV-2组  21.6  25.8

实施例5：Solexa测序

以Agilent Bioanalyzer 2100所测浓度为准，将上一步所得的2种产物等摩尔混合在一起(各取10pmol DNA)。根据厂商的说明书，使用Solexa测序仪(Illumina Genome Analyzer II x测序仪)，用Solexa PE-75程序进行测序。

实施例6：结果分析

根据测序结果中的接头的特征序列以及标签引物(标签部分和引物部分)的序列的信息，将测序结果与每个样品一一对应。然后，使用本领域已知的比对程序，例如BLAST和SOAP，将每个样品的测序结果与HPV数据库进行比对，从而实现HPV检测，并对HPV进行精确分型。

所得到的检测结果与已知的结果完全一致(参见表3)，表明本发明方法可以用于精确检测样品中的HPV。

表3：190个样品的检测结果。

  样品  编号  原HC-II结果  (RLU/CO值)  本次检测的  HPV结果  样品  编号  原HC-II结果  (RLU/CO值)  本次检测的  HPV结果  1  14.2  HPV56  96  0.28  阴性  2  0.31  阴性  97  0.33  阴性  3  196.41  HPV16  98  181.29  HPV35，HPV6  4  5.76  HPV18  99  77.32  HPV16  5  0.35  阴性  100  91.22  HPV39  6  99.86  HPV18，HPV11，HPV16  101  188.92  HPV52  7  128.86  HPV39  102  1352.83  HPV35，HPV11，HPV39  8  35.12  HPV18，HPV6  103  1.39  HPV43  9  498.69  HPV16，HPV56  104  119.5  HPV45，HPV11  10  603.57  HPV18，HPV31，HPV39  105  292.43  HPV56，HPV31  11  0.27  阴性  106  2.91  HPV68  12  3420.57  HPV18  107  193.13  HPV45  13  0.38  阴性  108  2.62  HPV6  14  0.41  阴性  109  94.12  HPV16  15  455.06  HPV16  110  792.72  HPV18，HPV31  16  8.93  HPV18  111  31.76  HPV11  17  0.6  阴性  112  0.25  阴性  18  0.41  阴性  113  0.23  阴性  19  0.29  阴性  114  750.82  HPV56，HPV16  20  27.64  HPV31  115  0.4  阴性  21  1985.41  HPV56，HPV68  116  2.75  HPV31  22  20.71  HPV42  117  396.04  HPV45

  23  1795.83  HPV11，HPV16，HPV52  118  354.76  HPV18，HPV16  24  9.55  HPV43  119  6.26  HPV11  25  237.62  HPV39  120  1719.67  HPV16，HPV45  26  1.5  HPV6  121  76.92  HPV51  27  1478.98  HPV68，HPV16  122  1318.02  HPV56，HPV16，HPV42  28  115.31  HPV44  123  0.28  阴性  29  419.31  HPV16  124  0.33  阴性  30  1.81  candHPV89  125  181.29  HPV59  31  2013.61  HPV52，HPV39  126  77.32  HPV68  32  1379.09  HPV54，HPV33  127  110.8  HPV52  33  12.74  HPV42  128  147.25  HPV16  34  1695.31  HPV16，candHPV89  129  0.24  HPV26  35  1410.85  HPV35  130  1.55  HPV11，HPV53  36  1149.25  HPV18  131  2.03  HPV6，HPV66  37  0.24  阴性  132  8.45  HPV43  38  1.55  HPV11  133  0.2  阴性  39  2.03  HPV11，HPV6  134  0.24  阴性  40  8.45  HPV42  135  10.53  HPV11  41  0.2  阴性  136  1410.85  HPV16，HPV53，HPV70  42  0.22  阴性  137  1149.25  HPV56，HPV81，HPV73  43  0.53  阴性  138  0.24  阴性  44  10.38  HPV6  139  413.9  HPV45  45  78.21  HPV16  140  17.05  HPV11

  46  0.23  阴性  141  23.6  HPV52  47  45.42  HPV16，HPV18  142  3379.09  HPV16，HPV35，HPV56  48  0.35  阴性  143  0.18  阴性  49  148.66  HPV18，candHPV89  144  1.46  HPV18  50  60.27  HPV56  145  1.25  HPV11，HPV26  51  0.28  阴性  146  2.13  HPV6，HPV81  52  360.26  HPV56，HPV68  147  872.52  HPV16，HPV45，HPV52  53  50.31  HPV18  148  1.5  HPV18  54  0.18  阴性  149  4.33  HPV16  55  0.31  阴性  150  0.82  阴性  56  196.41  HPV16  151  60.35  HPV59  57  5.76  HPV51  152  0.24  阴性  58  0.23  阴性  153  0.23  阴性  59  0.88  阴性  154  0.18  阴性  60  0.16  阴性  155  1.46  HPV51  61  870.63  HPV52，HPV16  156  11.25  HPV16  62  10.18  HPV42  157  2.13  HPV11  63  0.15  阴性  158  0.13  阴性  64  1.36  HPV11  159  90.18  HPV58  65  68.2  HPV59  160  0.15  阴性  66  0.68  阴性  161  602.79  HPV68，HPV16  67  130.41  HPV45  162  132.68  HPV56，HPV11  68  0.26  阴性  163  127.08  HPV39，HPV54

  69  5.25  HPV6  164  602.79  HPV33  70  0.46  阴性  165  276  HPV18  71  8.23  HPV40  166  243.6  HPV45  72  0.28  阴性  167  229.44  HPV51  73  100.16  HPV43，HPV44  168  1384.92  HPV16，HPV58，HPV72  74  450.13  HPV41  169  172.64  HPV58  75  127.08  HPV39，HPV6  170  855.24  HPV16，candHPV89  76  602.79  HPV45  171  126.47  HPV51  77  276  HPV16  172  86.62  HPV44，HPV11  78  243.6  HPV6，HPV70，HPV39  173  879.37  HPV18，HPV58  79  229.44  HPV35  174  119.39  HPV56  80  1384.92  HPV52，HPV56，HPV11  175  0.61  阴性  81  172.64  HPV26，HPV42  176  18.02  HPV16  82  855.24  HPV35，HPV6  177  16.06  HPV18  83  620.69  HPV52  178  60.69  HPV56，HPV11  84  128.02  HPV11  179  2.45  HPV11  85  514.84  HPV33  180  94.93  HPV39  86  68.3  HPV58  181  1635.3  HPV16，HPV35，HPV51  87  402.15  HPV59，HPV16  182  754.64  HPV33，candHPV89  88  51.72  HPV33  183  0.23  HPV11  89  1.78  HPV6  184  20.28  HPV18  90  56.7  HPV11，HPV31  185  0.16  阴性  91  186.06  HPV16  186  0.13  阴性

  92  0.02  阴性  187  60.18  HPV59  93  386.06  HPV18，HPV16  188  0.15  阴性  94  28.09  HPV6，HPV44  189  1.36  HPV43  95  186.06  HPV68，  190  0.28  阴性

此外，本发明的方法还可以对样品中的HPV进行精确分型。表4中提供了图2所示的泳道1-14所对应的样品的测序序列和分型结果。

参考文献

本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的专利、出版物和其他材料通过引用合并入本文，并且为方便起见按下列文献目录提供。

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