一种人源化抗人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备与应用

摘要

本发明涉及一种人源化抗人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备与应用。本发明的人源化抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，轻链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明的抗体可用于治疗多种疾病。如肿瘤、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病和其他增生性视网膜疾病等，尤其是对年龄性黄斑变性(AMD)的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人源化抗人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备与应用。

背景技术

血管生成是指组织利用既存血管产生成新的血管的过程。研究表明，许多疾病的发生都与血管生成密切相关，例如人类健康的克星一肿瘤。肿瘤的生长与转移与血管新生关系密切。早在1971年，Folkman就提出肿瘤生长是血管依赖性的，并把恶性肿瘤的生长分为血管前期和血管化期，但此观点在当时并未被人们接受，但随着后来毛细血管内皮细胞培养技术的建立、第一个血管抑制剂的发现、第一个血管生成活性蛋白的纯化等工作的完成，这一观点被越来越多的论据支持，逐渐得到了人们的认可，并使抑制血管生成变为肿瘤研究的热点及肿瘤治疗的新策略。肿瘤的生长首先需要建立一个新生血管网络，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养物质，缺少血供的肿瘤其直径一般只能维持在1～2mm³以内；肿瘤的转移及在转移部位的生长也有赖于新生血管的形成。

新生血管生成过程受四、五十种正负调节因子的共同调控，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种研究最为深入的血管生成正调节因子，VEGF是1989年由Ferrara N等在牛垂体滤泡星状细胞培养液中利用硫酸铵析出、肝素琼脂糖亲和层析法及两次反相高压液相色谱纯化得到的。它是内皮细胞的特异性的促有丝分裂原，也是一种有效的血管形成和血管通透性诱导因子。VEGF可作用于血管内皮细胞膜上的相应受体，通过一系列信号传导使内皮细胞分裂、增殖、迁移，是已知的最强的血管通透剂。在迄今发现的20多种多肽类血管生长因子中，VEGF是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的关键调节因子。例如VEGF在肿瘤血管新生过程中就起了很大作用。在肿瘤生长和发展过程中，一方面，VEGF可以促进肿瘤血管新生，增加肿瘤局部的血液供应，向肿瘤细胞提供氧、营养物质并排出废料，满足肿瘤组织无限生长的需要：另一方面，VEGF可以促使肿瘤组织各种蛋白酶及胶原酶分泌增加，不仅满足血管新生对基质降解的要求，而且也有助于肿瘤细胞的脱落，为肿瘤的浸润转移提供了便利条件。

近年来，靶向VEGF的抗血管生成逐渐成为肿瘤及其他相关疾病治疗的主要方向。其中，VEGF的单克隆抗体是一类具有极大潜力的特异性血管生成抑制剂。大量研究表明，抗VEGF单抗具有明显的抑制肿瘤血管生成的功能。例如，抗VEGF中和抗体可抑制裸鼠中各种不同人肿瘤细胞系的生长。2004年2月美国FDA批准了贝伐单抗(bevaci-zumab)用于转移性结肠癌的联合治疗，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，有效延长了患者的生存期。并且该药在非小细胞肺癌、肾癌和转移性乳腺癌III期临床试验中显示了较好的治疗效果。恶性肿瘤早期使用贝伐单抗的临床试验已经被批准进行。

尽管人们早已认识到单克隆抗体可能成为未来的一种主要的治疗剂，但实现这种可能性并不容易，主要原因是即使是治疗中使用的单克隆抗体仅以单一剂量注射一次，在患者体内也会产生强烈的免疫反应。目前避免或减小免疫反应的主要途径是将单克隆抗体人源化，研制人源化单克隆抗体。例如，2004年2月美国GENENTECH公司利用基因工程技术研制的人源化VEGF单克隆抗体AVASTIN作为治疗转移性结直肠癌的一线治疗药物在美国上市。但目前研发这类抗体往往会遇到亲和力下降、活性不高、产量低等问题。因此，在本领域有必要研发新型的抗VEGF的单克隆抗体药物，以期为相关疾病的治疗提供更广阔的空间。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种新型的人源化抗人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体及其制备与应用。

本发明一方面提供了一种新型的人源化抗人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体，该抗体的轻链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明的VEGF单克隆抗体是通过将兔单克隆抗体进行人源化而得到的，对抗原具有很高的亲和力。本发明的VEGF单克隆抗体在人宿主内的免疫原性低于所述兔亲本抗体。

抗体的人源化方法是通过改变亲本抗体构架区的氨基酸序列，使人源化抗体的构架区与人抗体的构架区在序列上更为接近。与未经修饰的亲本抗体相比，人源化的抗体在宿主体内具有较弱的免疫原性，同时保留与抗原的高亲和力。具体方法可参考2003年8月3日申请的名为“兔单克隆抗体的人源化方法”的美国专利申请案第03827110.9号中描述的方法。抗体的人源化方法可包括下列步骤：

1)取得兔单克隆抗体

用VEGF对兔子进行免疫处理，当兔子产生特异性免疫反应后，将免疫兔子的脾脏细胞与浆细胞瘤系融合在一起。融合之后，将细胞在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)的培养基中培养，选择用于杂交瘤生长，在经过2到3个星期后，开始出现杂交瘤细胞集落。对生长有杂交瘤细胞的培养液进行分析，检测是否产生针对抗原的单克隆抗体。可采用免疫沉淀法、放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)的体外结合分析法来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。经过测定，选择能生产具有所要求的特异性、亲和性或活性抗体的杂交瘤细胞，可利用有限稀释法将克隆亚克隆化，并按照标准程序进行培养。

2)序列比较。

根据美国专利申请案第03827110.9号中描述的方法，分离出编码单克隆抗体的DNA并进行测序，确定兔免疫球蛋白重链和轻链的可变区序列。一旦确定兔亲本抗体VH和VL的氨基酸序列后，一般采用适当的编号系统对氨基酸进行编号，例如Chothia与1998年和Kabat提出的编号系统，同时通常鉴定互补决定区和/或构架残基。然后，序列与人类免疫球蛋白序列数据库，一般是种系序列进行比较，从而鉴别类似的人抗体。这个类似的人抗体可称为“供体”抗体。

3)兔单克隆抗体的人源化

通过将亲本抗体的VH和VL区与供体抗体的VH和VL区进行排列对比后，改变亲本抗体构架区的氨基酸序列，使其与人抗体的构架区在序列上更为接近，从而得到本发明的人源化兔单克隆抗体。

DNA分子、载体、宿主细胞、制备方法

本发明还提供了编码目的抗体的DNA分子、载体、宿主细胞、以及制备目标抗体的方法。

较佳的，本发明编码目的抗体轻链的DNA序列为SEQ ID NO：3，编码分子抗体重链的DNA序列为SEQ ID NO：4。

在获得编码本发明的抗体的核酸序列后，可按照以下方法制备生产目的抗体。在许多实施例中，编码目标抗体的核酸是直接导入宿主细胞的，细胞在适当的条件下进行培养，从而诱导出被编码抗体的表达。任何适用于对表达盒进行表达的细胞都可以作为宿主细胞。例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。在很多情况下，采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可以是：猴的肾脏细胞(COS细胞)；通过SV40(COS-7，ATCC CRL 165 1)转化的猴的肾脏CVI细胞；人的胚肾细胞(HEK-293，Graham et al.J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠的肾脏细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠的卵巢细胞(CHO，Urlaub andChasin，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4216，(1980))；幼鼠的塞尔托利细胞(sertolicells)(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾脏细胞(CVI ATCC CCL70)；非洲绿猴的肾脏细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人的子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬类的肾脏细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠的肝脏细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人的肺部细胞(W138，ATCC CCL 75)；人的肝脏细胞(hep G2，HB 8065)；幼鼠的乳腺癌细胞；(MMT 060562，ATCC CCL 51)；；TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci383：44-68(1982))；NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)和幼鼠的L细胞(ATCC CCL-1)。其他细胞系在本学科领域的文献中也比较常见。从美国模式菌种收集中心(ATCC)可以获得多种细胞系，地址：American Type Culture Collection，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209。

把核酸导入细胞的方法有许多种。比较常用的方法包括电穿孔(electroporation)技术、粒子枪技术(particle gun technology)、磷酸钙沉淀(calcium phosphateprecipitation)、直接显微注射等等。具体方法的选择一般取决于被转化的细胞类型，以及进行转化所处的具体环境(即：在试管、体外还是在有机体内进行)。有关这些方法的一般性介绍可以参考：Ausubel，et al，Short Protocols in Molecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995。在某些情况下，可以采用多阴离子转染脂质体(Lipofectamine)和钙离子调节的细胞质基因转化技术。

在把试验核酸导入到细胞中之后，一般需要对细胞进行培养，正常培养温度为37摄氏度，某些时候温度可以选择，培养时间为1到24个小时，从而充分地实现抗体表达。在大多数情况下，抗体大多分泌到细胞培养液的上清液中。

在哺乳动物的宿主细胞中，许多以病毒为基础的表达系统可以用来对一种抗体进行表达。在采用腺病毒作为表达载体的情况下，对相关抗体进行编码的序列可以捆绑在一个转录/编译控制复合体上，比如后期启动子(late promoter)和三重引导序列(leadersequence)。之后，可以采用试管内和活有机体内相结合的方法，把这个嵌合基因插入腺病毒基因组。如果插入病毒基因组中非重要的区域，重组病毒会成活并且能在被感染的宿主内表达抗体分子(Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359(1984))。如果加入适当的转录强化因子和转录终止子(terminator)等，可以提高表达的效率(Bittner et al.，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。

对于长期进行重组抗体的高产量生产，可以采用稳定的表达形式。例如，可以通过生物工程技术稳定表达抗体分子的细胞系。如果不采用包含复制病毒原的表达载体，可以通过免疫球蛋白表达盒以及选择性的标记对宿主细胞进行转化。在导入外来的DNA之后，细胞可以在富营养培养介质中生长一到两天，之后，把营养介质变成选择性培养液。重组质粒中的选择性标记对选择性培养液产生抵抗，使得细胞可以稳定地把质粒和染色体整合，并融入细胞核之后，可以通过克隆并进一步生长为细胞系。这种经生物工程改造的细胞系尤其适用于对直接或间接与抗体分子相互作用的化合物进行筛选和评价。

一旦获得本发明所说的抗体分子，就可以采用本领域技术人员所知的常规方法对抗体分子进行纯化。具体纯化方法包括色谱法，比如，离子交换，亲和层析，尤其与蛋白质A的特定抗原进行亲和层析，以及尺寸柱层析(sizing column chromatography)、离心过滤法、差异溶解度(differential solubility)等。在很多情况下，细胞分泌的抗体进入培养液，并在培养液中收获。

检测目标抗体的特性和活性

在获得本发明的抗体之后，可用常规手段对其进行鉴定。一般需要采用已有的方法对它的亲和力进行检验，这些检验方法包括：1)采用标记(用放射性同位素或荧光标记)母抗体、修饰后抗体以及母抗体识别抗原的竞争结合分析法(competitive bindinganalysis)；2)用BIACore仪器进行的表面胞质基因回声(surface plasmon resonance)，提供一个抗原的结合特性。采用这种方法时，把抗原固定在固相基因芯片上，并以实时方式测量抗体在液相状态下的结合力；以及3)流动细胞计数(flow cytometry)，例如，采用荧光激活的细胞筛选(FACS)分析法，分析抗体与细胞表面抗原的结合力；4)酶联免疫吸附分析(ELISA)；5)均衡分离(equibrilium dialysis)或FACS。测量结合性亲和力一般采用Harlow等人介绍的方法：《抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)》，FirstEdition(1988)Cold spring Harbor，N.Y.；Ausubel，et al，Short Protocols inMolecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995。

采用BIAcore-3000对本发明的人源化抗VEGF单克隆抗体的结合亲和力进行测定，发现本发明的的抗体对VEGF具有很强的亲和力。

本发明的目标抗体同时具有很高的生物学活性。体外实验(如鸡胚尿囊膜实验、HUVEC细胞增殖实验)以及体内实验(如对小鼠氧致视网膜血管新生模型的抑制试验等)均证明了本发明的抗体能很好的抑制血管的生成。

药物组合物

本发明还提供了一种医药组合物，其包含本发明的抗体以及医药学上可接受的载体。术语“医药上可接受的载体”指天然或合成的一种或多种有机或无机成分，本发明的抗体与其相混合有助于抗体发挥作用。可作为医药学上可接受的载体及其组分的物质包括糖类；纤维素及其衍生物；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂；多元醇；海藻酸；乳化剂；润湿剂；着色剂；调味剂；压片剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液等。

本发明的药物组合物可根据需要制成任何剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式可采用例如灌注和其他治疗方式。

应用

本发明的抗体可应用于制备治疗与血管生成相关的疾病的药物或制剂。

所述与血管生成相关的疾病包括肿瘤、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病和其他增生性视网膜疾病等。

本发明的抗体尤其适用于制备治疗年龄性黄斑变性(AMD)的药物或制剂。

本发明的抗体可用于治疗多种疾病。例如可用于肿瘤的治疗，可抑制肿瘤部位的血管生长，由于肿瘤的生长与血管生成有密切的关系，因此本发明的抗体可用于治疗胃癌、肝癌、白血病、肺癌、小肠癌、骨癌、直肠癌、前列腺癌、大肠癌、宫颈癌等多种癌症。本发明的抗体还可用于治疗许多非肿瘤疾病，其包括：类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病和其他增生性视网膜疾病等，尤其值得注意的是本发明的抗体在年龄性黄斑变性(AMD)中的治疗。年龄性黄斑变性(AMD)是在老年人群中导致严重丧失视力的主要原因。渗出性AMD的特征是脉络膜的新血管生成和视网膜色素上皮细胞的脱落。脉络膜新生血管(choroidal neovascul  arization，CNV)好发于黄斑区，与脉络膜循环在黄斑处的生理和解剖特征有关。Wang等将表达人VEGF165的腺相关病毒载体注射到鼠的视网膜下，发现95％的鼠发生CNV，并伴随血管渗漏和视功能的下降，表明了VEGF是CNV形成过程中的主要致病因子。因此，本发明的抗VEGF抗体预期在降低AMD的严重性方面特别有效。通常是眼球局部注射给药，剂量为0.1-5.0mg/眼球。

试剂盒

如上所述，本发明还提供了用于实施本方法的试剂盒，试剂盒至少包括如下之一或更多：一种如前文所述的人源化的抗体，一种编码抗体的核酸，或包含抗体的核酸的细胞。试剂盒中还可以选用的组成包括：限制性内切酶(restriction enzyme)、控制引物(controlprimers)和质粒、缓冲液等。试剂盒的核酸可有酶切位点(restrictions site)、多克隆位点区(multiple cloning site)、引物结合点(primer sites)等等，以便于实现与非兔抗体互补决定区编码核酸的结合。试剂盒的各构成部分既可以单独存在于分开的包装中，也可以根据需要，把某些兼容的成分预先置于一个包装内。

附图说明

图1 SDS-PAGE电泳图，泳道1为蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2为TK001

图2是TK001经SEC-HPLC分析图谱

图3是ELISA法测定TK001的中和活性所得的图片。横坐标为抗体浓度，纵坐标为吸光值

图4是TK001对激光致恒河猴脉络膜新生血管的抑制作用研究实验的图片

A阴性对照组左眼造模前

B阴性对照组造模后21天，给药前

C阴性对照组给生理盐水7天

D阳性对照组左眼造模前

E阳性对照组造模后21天，给药前

F阳性对照组，给药Avastin7天

G实验组左眼造模前

H实验组造模后21天，给药前

I实验组，给药7天

序列说明：

SEQ ID NO：1 TK001抗体的轻链氨基酸序列

SEQ ID NO：2 TK001抗体的重链氨基酸序列

SEQ ID NO：3 TK001抗体的轻链的DNA序列

SEQ ID NO：4 TK001抗体的重链的DNA序列

具体实施方式

下面将结合具体实施例进一步描述本发明。

实施例中所使用的VEGF是购于R&D公司的重组人VEGF(rhVEGF165)，本发明的人源化抗VEGF单克隆抗体在以下实施例中均简称TK001。

实施例1 TK001的制备

1)杂交瘤细胞的制备：用rhVEGF165(R&D)对兔子进行免疫处理，当兔子产生特异性免疫反应后，将免疫兔子的脾脏细胞与浆细胞瘤系融合在一起。融合之后，将细胞在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)的培养基中培养，选择用于杂交瘤生长，在经过2到3个星期后，开始出现杂交瘤细胞集落。

2)杂交瘤细胞筛选：用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对生长有杂交瘤细胞的培养液进行分析，检测是否产生针对抗原的单克隆抗体。以20μg/ml VEGF包被96孔板，加入待测的培养上清液，以培养液为阴性对照，相应的免疫小鼠血清为阳性对照。也即每个待测物对应3个检测孔。以有限稀释法作阳性细胞的再克隆化，结果筛选到235个阳性的杂交瘤细胞株。然后用ELISA测定单抗对VEGF与其受体(VEGFR)结合的阻抗作用。具体测定方法有两种：a用VEGFR包板后，加入lnM VEGF和不同浓度的酶标人源抗体(HRP标记)的混合溶液孵育2小时后，显色，测定490nm处的光吸收值。b用VEGFR包板后，加入1nM VEGF，37℃温育2小时后，分别加入不同浓度的酶标人源抗体(HRP标记)孵育2小时后，显色，测定490nm处的光吸收值。结果发现有48株能与VEGF结合，从而影响VEGF与VEGFR的结合；有71株可与VEGFR结合，也对VEGF与其受体(VEGFR)的结合起到了阻抗作用。此外还用BIACore进行了亲和常数测定，用信号通路进行特异性测定等。经过一系列测定，最终选择能生产具有所要求的特异性、亲和性或活性抗体的杂交瘤细胞(本发明所选的克隆为clone21)，进行下一步实验。

3)抗VEGF单克隆抗体的人源化：抗体的人源化方法参考2003年8月3日申请的名为“兔单克隆抗体的人源化方法”的美国专利申请案第03827110.9号中描述的方法进行。利用此方法，改变亲本抗体构架区的氨基酸序列，获得本发明的单克隆抗体TK001可变区。

4)人源化抗VEGF单克隆抗体的制备

编码TK001轻链和重链的DNA序列分别由人工合成，并分别克隆至pMD18-T载体(Takara)中，利用pOptiVEC^TM-TOPO和pOptiVEC^TM-TOPO(Invitrogen)分别构建重组表达载体并共转化DG44细胞(Invitrogen)，筛选获得TK001抗体高表达细胞株，并进行无血清扩大培养获得表达抗体(按OptiCHO^TM Antibody Express Kit操作说明书进行，Invitrogen)。

实施例2 TK001的纯化

1.Mabselect(Protein A)亲和层析

1)溶液配置：

平衡缓冲液A：20mM PB，0.15M NaCl，pH7.0

洗脱缓冲液B：20mM柠檬酸钠-Na₂HPO₄，pH3.4

2)纯化

用平衡缓冲液进行平衡后，将样品上样于Protein A亲和层析柱，再次平衡后，用100％洗脱缓冲液进行洗脱，并收集洗脱峰。

2 SP Fastflow阳离子交换层析

1)溶液配置

平衡缓冲液A：15mM PB，pH5.8

洗脱缓冲液B：20mM PB，pH7.2

2)纯化

将第一步纯化所得到洗脱峰用1M Tris-HCl pH9.0调pH至5.8，A液将填料平衡后上样，100％B洗脱，收集洗脱峰。

3 Q Fastflow阴离子交换层析

1)溶液配置

平衡缓冲液A：20mM PB，pH7.2

洗脱缓冲液B：20mM PB，0.5M Na₂SO₄，pH7.2

2)纯化

填料用A液平衡后，阳离子交换层析收集的样品直接上样收集流穿，100％B冲洗柱子对填料进行清洗再生。

3)纯度鉴定：

将经纯化后的样品进行SDS-PAGE不连续凝胶电泳系统分析(结果见图1)，以及SEC检测(结果见图2)。证明经过纯化，得到了纯度大于97％的样品。

样品经氨基酸测序确认获得的抗体符合轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：1，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

实施例3 TK001的亲和力测定

本实验采用BIAcore-3000对TK001的结合亲和力进行测定。按照仪器的使用说明将VEGF固定在CM5芯片上，将一系列倍比稀释的抗体按照每分钟30ul的流速注入HBS-EP缓冲液中。结合率和(k_on)and解离率(k_off)可通过同时拟合结合和解离传感图利用1对1Langmuir结合模型来计算。解离平衡常数(Kd)由k_off/k_on计算得出。表1概括了TK001与对照药物Avastin的.Kd，从表中可以看出TK001的平均亲和力比Avastin的平均亲和力高出接近100倍。

表1  TK001和Avastin的解离平衡常数(Kd)

实施例4 TK001体外活性研究

用VEGF受体竞争抑制法测定TK001的活性。准备两块96孔板，分别为ELISA板和细胞板。两块板分别进行如下处理：

ELISA板中加入5μg/mL的VEGF Receptor 2(KDR)(R&D公司)，每孔50μL，在37℃中放置2h。用1％BSA/TBS封闭，37℃放置1h.。

细胞板中加入1％BSA/TBS，每孔200μL.，在37℃中放置2h。将TK001和对照品Avastin分别用PBS稀释成100μg/mL的母液，再将母液进行3倍稀释，共稀释11个浓度，将稀释好的样品加入细胞板中，每孔80μL。再向以上各孔中加入1μg/mL的VEGF，每孔80μL，37℃放置1h。

将ELISA板洗板两次，拍干后，将细胞板中的样品依次转移至ELISA板中，37℃放置1h，然后洗板6次。

向ELISA板中各孔加入1∶1000稀释的鼠抗人VEGF，每孔50μL，37℃放置1h，然后洗板6次。再加入1∶1000稀释的羊抗鼠二抗，每孔50μL，37℃放置1h，然后洗板6次。

反应完后加入显色液，37℃显色15min，加入终止液终止显色反应，在酶标仪上读取0D₄₀₅的数值。结果(见图3)显示TK001组的IC50值为0.4991mg/mL，Avastin组的IC50值为1.6432mg/mL，TK001的活性明显高于Avastin。

实施例5 TK001对激光致恒河猴脉络膜新生血管的抑制作用研究

1.造模

本试验采用5只成年恒河猴，采用532nm激光围绕2黄斑中心凹光凝，诱导恒河猴眼底脉络膜血管新生，建立与人类脉络膜新生血管类似的动物模型。光凝前及光凝后21天进行眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影、光学相干断层扫描，判定造模情况。

2.给药

将恒河猴随机分为阴性对照组(1只)、阳性药物Avastin对照组(2只)和TK001药物组(2只)。药物组动物每眼给予单克隆抗体药物50μL，阳性对照组动物每眼给予50μL(1.25mg)阳性药物，阴性对照组每眼给予等体积溶剂。各组动物于激光照射后21天给药。剂量设计如表2

表2  剂量设计表

3.结果

给药后7天(光凝后28天)进行眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影、光学相干断层扫描(OCT)等检查观察供试品对脉络膜新生血管的抑制情况，并解剖动物取眼球进行病理组织学检查。

荧光造影及OCT结果显示阴性对照组恒河猴在给予生理盐水7天后，荧光素渗漏程度未见明显减轻，荧光斑面积未见明显缩小，OCT检查也未见光凝处视网膜损伤有明显好转。阳性对照组(Avastin组)恒河猴在给予Avastin 7天后，荧光素渗漏面积由3.71mm²减少至2.87mm²，有了明显的改善，改善率为59.6％，荧光斑面积也明显缩小，OCT检查可见病损最高处视网膜厚度均有较明显降低，色素上皮较规整、连续。TK001组恒河猴在给药7天后，荧光素渗漏情况较给药前有明显好转，由1.54mm²减少至0mm^2.改善率为100％，与阳性对照组的药物相比，具有更好的治疗效果。OCT检查也可见视网膜病损处的症状缓解，且治疗效果好于阳性对照组。(见表3以及图4)

表3  给药前后各组动物眼底激光斑荧光素渗漏面积变化情况

序列表

<110>江苏泰康生物医药有限公司

<120>一种人源化抗人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备与应用

<130>091314

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>241

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>人源化抗人血管内皮生长因子单克隆抗体轻链

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(22)

<400>1

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1               5                   10                  15

Leu Pro Asp Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

            20                  25                  30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser

        35                  40                  45

Gln Thr Ile Tyr Asn Asn Ala Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

    50                  55                  60

Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser

65                  70                  75                  80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

            85                  90                  95

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

            100                 105                 110

Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Ile Asn Gly Phe Gly Gly Gly

        115                 120                 125

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

    130                 135                 140

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val

145                 150                 155                 160

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

                165                 170                 175

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

            180                 185                 190

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

        195                 200                 205

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr

    210                 215                 220

His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu

225                 230                 235                 240

Cys

<210>2

<211>471

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>人源化抗人血管内皮生长因子单克隆抗体重链

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(19)

<400>2

Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly

1               5                   10                  15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

            20                  25                  30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe

        35                  40                  45

Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

    50                  55                  60

Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Met Thr Thr Asp Val Lys Thr Glu Tyr

65                  70                  75                  80

Ala Asn Trp Ala Lys Ser Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Ala Lys

                85                  90                  95

Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

            100                 105                 110

Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Val Ala Ser Pro Leu Met Ser Phe

        115                 120                 125

Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

    130                 135                 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145                 150                 155                 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

                165                 170                 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

            180                 185                 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

    210                 215                 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225                 230                 235                 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

                245                 250                 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

            260                 265                 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

        275                 280                 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

    290                 295                 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305                 310                 315                 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

                325                 330                 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

            340                 345                 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

        355                 360                 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

    370                 375                 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385                 390                 395                 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

                405                 410                 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

            420                 425                 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

        435                 440                 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

    450                 455                 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465                 470

<210>3

<211>723

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人源化抗人血管内皮生长因子单克隆抗体轻链编码序列

<220>

<22l>sig_peptide

<222>(1)..(66)

<400>3

atggacatga gggtccctgc tcagctcctg ggactcctgc tgctctggct cccagatacc    60

agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctcgctgt ctgcatctgt gggagacaga   120

gtcaccatca actgccaggc cagtcagacc atttataata acgcagaatt atcctggtat   180

cagcagaaac cagggaaacc tcccaagctc ctgatctaca gggcatccac tctggcatct   240

ggggtcccat cacggttcag cggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagt   300

agcctgcagc ctgaagatgt tgccacttac tactgtggag gctataaaag ttatagtaat   360

gatatcaatg gtttcggcgg agggaccaag gtggagatca aacgcaccgt ggcggcgccg   420

agcgtgttta tttttccgcc gagcgatgaa cagctgaaaa gcggcaccgc gagcgtggtg   480

tgcctgctga acaactttta tccgcgcgaa gcgaaagtgc agtggaaagt ggataacgcg   540

ctgcagagcg gcaacagcca ggaaagcgtg accgaacagg atagcaaaga tagcacctat   600

agcctgagca gcaccctgac cctgagcaaa gcggattatg aaaaacataa agtgtatgcg   660

tgcgaagtga cccatcaggg cctgagcagc ccggtgacca aaagctttaa ccgcggcgaa   720

tgc                                                                 723

<210>4

<211>1413

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>人源化抗人血管内皮生长因子单克隆抗体重链编码序列

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(57)

<400>4

atggaactgg ggctccgctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag    60

gtgcagttgg tggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg gggggtccct gagactcagc   120

tgcgcagctt ctggattttc ctttagtaat aatgacgtga tgtgctgggt ccgccaggct   180

ccagggaagg ggctggagtg gatcggatgt attatgacta ctgatgttaa gactgagtac   240

gcgaactggg cgaagagccg attcaccgtc tccagagact cggccaagaa ctcagtgtat   300

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt atttctgtgc gagagacagt   360

gttgcgagtc ctttaatgtc ctttgacttg tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc   420

tcagcgagca ccaaaggccc gagcgtgttt ccgctggcgc cgagcagcaa aagcaccagc   480

ggcggcaccg cggcgctggg ctgcctggtg aaagattatt ttccggaacc ggtgaccgtg   540

agctggaaca gcggcgcgct gaccagcggc gtgcatacct ttccggcggt gctgcagagc   600

agcggcctgt atagcctgag cagcgtggtg accgtgccga gcagcagcct gggcacccag   660

acctatattt gcaacgtgaa ccataaaccg agcaacacca aagtggataa aaaagtggaa   720

ccgaaaagct gcgataaaac ccatacctgc ccgccgtgcc cggcgccgga actgctgggc   780

ggcccgagcg tgtttctgtt tccgccgaaa ccgaaagata ccctgatgat tagccgcacc   840

ccggaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg agccatgaag atccggaagt gaaatttaac   900

tggtatgtgg atggcgtgga agtgcataac gcgaaaacca aaccgcgcga agaacagtat   960

aacagcacct atcgcgtggt gagcgtgctg accgtgctgc atcaggattg gctgaacggc  1020

aaagaatata aatgcaaagt gagcaacaaa gcgctgccgg cgccgattga aaaaaccatt  1080

agcaaagcga aaggccagcc gcgcgaaccg caggtgtata ccctgccgcc gagccgcgat  1140

gaactgacca aaaaccaggt gagcctgacc tgcctggtga aaggctttta tccgagcgat  1200

attgcggtgg aatgggaaag caacggccag ccggaaaaca actataaaac caccccgccg  1260

gtgctggata gcgatggcag cttttttctg tatagcaaac tgaccgtgga taaaagccgc  1320

tggcagcagg gcaacgtgtt tagctgcagc gtgatgcatg aagcgctgca taaccattat  1380

acccagaaaa gcctgagcct gagcccgggc aaa                               1413