一种具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制备及应用

摘要

本发明涉及中华绒螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)基因的体外重组表达技术及其功能鉴定。中华绒螯蟹抗脂多糖因子具有序列SEQ ID NO.1中氨基酸序列。本发明利用体外重组表达技术获得了中华绒螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)，该重组蛋白具有广谱性的抑菌效果，对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、革兰氏阴性菌鳗弧菌(Listonella anguillarum)和真菌毕赤酵母(Pichia pastoris)的生长都具有明显的抑制效果，对它们起抑制作用的最小蛋白浓度分别为：150μg mL

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，涉及中华绒螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)基因编码区的体外重组表达技术，活性重组蛋白的分离纯化，以及重组蛋白对枯草芽孢杆菌、鳗弧菌和毕赤酵母的抑菌作用研究；还涉及到该重组蛋白作为一种新型抑菌药物，免疫增强剂和饲料添加剂生产中的应用价值。

背景技术：

中华绒螯蟹是东南亚重要的水产品养殖品种之一。然而，随着中华绒螯蟹养殖面积的不断扩大，由细菌，真菌和病毒引起的多种疾病在蟹的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。先前的研究已经表明，生物体死亡率的增加与其对外界病原微生物免疫防御能力低下有密不可分的关系。因此，对水产动物开展免疫防御系统的相关研究将有助于人类对其病害进行有效防控和治疗。

中华绒螯蟹是一种无脊椎动物，缺乏适应性免疫防御系统，只依赖固有免疫系统实现对外界病原微生物的免疫防御。固有免疫系统包括由血细胞引起的细胞免疫及由抗菌肽等组成的体液免疫来执行对外界病原微生物的免疫防御。在水产动物养殖过程中，抗生素的滥用不仅造成水体污染，而且因此带来抗药性微生物的产生。这个问题激发了我们对于生物体本身抗菌分子的研究，以期将其作为模板设计免疫防治的药物。并且，对于生物体内抗菌分子进行研究，将使我们进一步了解中华绒螯蟹免疫防御机制，从而更好地制定免疫防治的对策。

抗脂多糖因子(ALF)是一种可以结合脂多糖(LPS)的小蛋白，它可以调节细胞的脱颗粒作用，并引起细胞内的一系列级联反应。ALF最先在鲎中被发现，它分子量为11.8kDa，对于R-型革兰氏阴性菌有明显的抑制生长的效果。从晶体结构上看，鲎的ALF的结构中有两个高度保守的半胱氨酸结构，他们所限制的结构域为LPS结合域。体外合成鲎的ALF的LPS结合域，证明其确实可以与LPS结合。随后，从对虾，蟹，螯虾等甲壳动物中也纯化或克隆获得了一些抗脂多糖因子。

本发明中的中华绒螯蟹抗脂多糖因子，其重组产物对枯草芽孢杆菌、鳗弧菌和毕赤酵母的生长都具有抑制的功能。目前，抗脂多糖因子的结构和功能在虾中已得到一定程度的研究，但在中华绒螯蟹的研究还很少。ALFs在中华绒螯蟹中的研究，有利于更好的揭示固有免疫作用的途径及其机制，并且对开发广谱抗菌药物和筛选免疫增强剂提供指导。

发明内容：

中华绒螯蟹作为甲壳动物的代表，在进化上比较原始，研究其效应分子的作用在理论和实际中都具有重要的意义。本发明对中华绒螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)基因编码区进行原核重组，旨在确认其蛋白功能，以深入研究EsALF-2的抑菌活性，为抗菌药物和免疫增强剂的筛选提供指导。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：在EsALF-2基因编码区(信号肽除外)的两端分别设计含有限制性酶切位点的引物，通过PCR技术，扩增编码区基因并将其克隆到pET-32a表达载体中，随后转入宿主细胞BL21(DE3)plysS中实现原核体外重组表达。重组产物经镍琼脂糖凝胶柱纯化，并且透析复性后，表现出以下活性：

1、EsALF-2重组蛋白对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、革兰氏阴性菌鳗弧菌和真菌毕赤酵母有抑制生长作用。当EsALF-2重组蛋白为最大浓度(600μg mL^-1)时，该蛋白与枯草芽孢杆菌37℃孵育3小时后，再加LB培养基孵育过夜，O.D.600值为0.18±0.019(平均值±标准误)，显著低于对照组(Tris-HCl)的O.D.600值(0.38±0.013)；该蛋白与鳗弧菌28℃孵育3小时后，再加2216E培养基孵育过夜，O.D.600值为0.06±0.002，显著低于对照组(Tris-HCl)的O.D.600值(0.16±0.012)；该蛋白与毕赤酵母30℃孵育3小时后，再加YPD培养基孵育过夜，O.D.560值为0.90±0.006，显著低于对照组(Tris-HCl)的O.D.600值(0.97±0.043)。

2、EsALF-2重组蛋白对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、革兰氏阴性菌鳗弧菌和真菌毕赤酵母的最小抑制浓度分别为：150μg mL^-1，75μg mL^-1和18.75μg mL^-1。

附图说明：

图1：中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2对枯草芽孢杆菌、鳗弧菌和毕赤酵母生长的影响

图2：不同浓度梯度的中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2对枯草芽孢杆菌、鳗弧菌和毕赤酵母生长的影响

具体实施方式：

下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施实验1：

本发明的中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2基因编码区(信号肽除外)体外原核重组表达，包括下列步骤：

1、重组载体的构建

通过PCR技术，使用5’末端分别添加了BamH I和Xho I特定酶切位点的基因特异性引物P1(5’-GGATCCAACATTTTTGACGATATTTTCG-3’)和P2(5’-CTCGAGTCAAGCATTCAGCAAAGGGTC-3’)扩增中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2的编码区片段。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pMD18-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用BamH I和Xho I两个酶酶切质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经BamH I和Xho I两个酶酶切的表达载体pET-32a连接，完成载体的构建。上述实验操作的具体方法请参照《分子克隆第三版》。

2、重组蛋白EsALF-2的表达

将构建好的重组载体转化表达宿主菌BL21(DE3)-plysS中，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于200mL的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养至O.D.600＝0.5-0.7。加入IPTG，使终浓度达到1mmol L^-1，继续培养4小时。4℃，5000rpm，离心10分钟，收集菌体，于-20℃冻存备用。取1mL菌液离心，弃去上清后，加入80μL水和20μL的5倍的蛋白上样缓冲液，100℃煮沸2分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。

3、重组蛋白EsALF-2的纯化与复性

本发明中重组蛋白采用北京韦氏博慧色谱科技有限公司的镍琼脂糖凝胶柱纯化。变性状态下的具体操作步骤如下：首先用缓冲液I(50mmol L^-1磷酸缓冲液，pH＝7.4，0.5molL^-1氯化钠，8mol L^-1尿素)平衡镍琼脂糖凝胶柱2-5个柱床体积，流速为2mL min^-1。经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150瓦超声破碎30分钟，12000转，离心30分钟，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1mL min^-1。再次用缓冲液I再洗2-5个柱床体积，流速为2mL min^-1，然后用有50mmol L^-1咪唑的缓冲液I再洗2-5个柱床体积，流速为2mL min^-1。最后，用400mmol L^-1咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，收集。

重组蛋白的复性采用尿素逐级稀释的方法，通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。本发明中采用的复性透析液为：50mmol L^-1Tris-HCl，pH 7.4，50mmolL^-1氯化钠，2mmol L^-1还原型谷胱苷肽，0.2mmol L^-1氧化型谷胱苷肽，10％甘油，1％甘氨酸，1mmol L^-1EDTA，6-0mol L^-1逐级稀释的尿素。最后，重组蛋白的透析缓冲液为50mmol L^-1 Tris-HCl，pH 7.4。

实施实验2：

本发明的中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2的抑菌活性检测具体步骤如下：

1、微生物的培养及制备

枯草芽孢杆菌用LB培养基37℃，鳗弧菌用2216E培养基28℃，毕赤酵母用YPD培养基30℃，同时用摇床每分钟220转数培养到菌浓度达到对数生长期时，用Tris-HCl(50mmol L^-1，pH＝8.0)稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数约为1×10³。

2、重组蛋白EsALF-2抑菌活性测定

重组蛋白EsALF-2成倍稀释，分别加50μL的EsALF-2在无菌的96孔板中，50μLTris-HCl(50mmol L^-1，pH＝8.0)设为对照，然后再加入50μL的稀释好的菌液，并且混匀。只加入50μL菌液的孔为空白孔。96孔板在菌液的培养温度下孵育3小时后，加入相应培养基150μL，空白孔加入培养基200μL，孵育过夜。加枯草芽孢杆菌和鳗弧菌的96孔板在波长为600nm的可见光下读数，加毕赤酵母的96孔板在波长为560nm的可见光下读数。实验组与对照组进行显著分析，正如图1所示，实验组重组蛋白EsALF-2(600μg mL-1)对鳗弧菌，枯草芽孢杆菌和毕赤酵母生长与对照组Tris-HCl组相比均具有明显的抑制效果(星号*：差异显著；两个星号**：差异极显著)。以重组蛋白EsALF-2最小浓度抑制菌生长的浓度定义为此菌的最小抑制浓度，正如图2所示，随着重组蛋白EsALF-2浓度的降低，抑菌活性逐渐减弱，重组蛋白EsALF-2对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、革兰氏阴性菌鳗弧菌和真菌毕赤酵母有抑制生长作用，且最小抑制浓度分别为150μg mL^-1，75μgmL^-1和18.75μg mL^-1。

序列表

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制备及应用

<140>

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>120

<212>PRT

<213>中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)

<220>

<400>1

Met Ala Arg Leu Ser Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Val Ala Val Phe

1               5                   10                  15

Thr Pro Asn Ile Arg Gln Cys Glu Ala Asn Ile Phe Asp Asp Ile Phe

            20                  25                  30

Gly Lys Val Thr Glu Thr Leu Val Asp Phe Gly Thr Thr Asp Ile Ala

        35                  40                  45

Gly Asn Pro Cys Asn Tyr Arg Leu Ser Pro Arg Leu Ile Lys Phe Glu

    50                  55                  60

Leu Tyr Phe Val Gly Leu Val Trp Cys Pro Gly Trp Thr Thr Ile Gln

65                  70                  75                  80

Gly Glu Ser Leu Thr Arg Ser Arg Thr Arg Val Val Asn Lys Ala Val

                85                  90                  95

Glu Asp Phe Ala Lys Lys Ala Val Ala Ala Gly Ile Met Thr Gln Glu

            100                 105                 110

Asp Ala Asp Pro Leu Leu Asn Ala

        115                 120