用于治疗黑素瘤的细胞系、含有它们的组合物、制备所述组合物的方法以及治疗方法

摘要

用于治疗黑素瘤的细胞系、含有它们的组合物、制备所述组合物的方法以及治疗方法。更特别地，本发明涉及用于治疗恶性疾病的多种人黑素瘤细胞系，其中所述细胞系为：(a)Mel-XY1(以保藏号DSMACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，(d)Mel-XX4(以保藏号DSMACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，或(e)它们的亚群。所述细胞系可以是经过照射的，从而获得上述细胞系的凋亡表型群和坏死表型群。所述组合物可以含有佐剂和/或免疫调节剂和/或自体树突细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及用于治疗黑素瘤的细胞系、含有它们的组合物、制备所述组合物的方法以及治疗方法。更特别地，本发明涉及用于治疗恶性疾病的多种人黑素瘤细胞系，其中所述细胞系为：(a)Mel-XY1(2007年3月23日以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Inhoffenstraβe 7 B 38124 Braunschweig，Germany)，(b)Mel-XY2(2007年3月23日以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Inhoffenstraβe 7 B38124 Braunschweig，Germany)，(c)Mel-XY3(2007年3月23日以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Inhoffenstraβe 7 B 38124 Braunschweig，Germany)，(d)Mel-XX4(2007年3月23日以保藏号DSM ACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Inhoffenstraβe 7 B 38124 Braunschweig，Germany)，或(e)上述细胞系的亚群。可对所述细胞系进行照射，从而获得上述细胞系的凋亡表型群和坏死表型群。所述组合物可以含有佐剂和/或免疫调节剂和/或自体树突细胞。

背景技术

目前已进行了许多努力并利用许多资源进行癌症免疫治疗领域的研究。已有重要证据指出了T淋巴细胞在对癌症有效的免疫应答中的中心作用(Oliver RT，Nouri AM.T；Cancer Surv 1992；13：173-204)。为此，已经使用单独的、带有佐剂的或与一些细胞因子组合的同种异体细胞进行治疗。

另一方面，为人们所知的是，由于其刺激幼稚T淋巴细胞的非凡能力，树突细胞(DC)是可起始T细胞应答的抗原呈递细胞(Schuler G，Steinman RM.J Exp.Med 1997；186：1183-7，和Banchereau J，Steinman RM.Nature 1998；392：245-52)。

已经有人在小鼠模型和人体中显示DC结合凋亡细胞，从而呈递产生I类HLA复合物/肽的抗原，诱导细胞毒T淋巴细胞(Albert ML，Pearce SF，Francisco LM，Sauter B，Roy P，Silverstein RL，Bhardwaj N.J Exp Med.1998，188：1359-1368；Chen Z，Moyana T，Saxena A，Warrington R，Jia Z，Xiang J.Int J Cancer.2001，93：539-548和Shaif-Muthana M，McIntyre C，Sisley K，Rennie I，Murray A.CancerRes.2000，60：6441-6447)。为此，很重要的是凋亡细胞诱导树突细胞(DC)的成熟，但是许多人报导，人凋亡细胞不使DC成熟或者诱导这些DC丧失成熟(Pietra G，Mortarini R，Parmiani G，Anichini A.Cancer Res 2001，61：8218-8226；Labarriere N，Bretaudeau L，GervoisN，Bodinier M，Bougras G，Diez E，Lang F，Gregoire M，Jotereau F.IntJ Cancer 2002，101：280-286和Demaria S，Santori FR，Ng B，Liebes L，Formenti SC，Vukmanovic S.J Leukoc Bi0l.2005，77：361-368)。

Pardoll等的美国专利6,187,306公开了治疗和预防黑素瘤的方法，所述方法包括使用表达黑素瘤免疫显性抗原的至少一种或多种同种异体细胞系(其中所述细胞系经过改造以使它表达细胞因子)，并对患黑素瘤或有患病风险的患者施用这些转化细胞系。尽管所用的表达多数免疫显性抗原的一种或多种细胞系非常重要，但表达多数此类抗原的新细胞系或细胞系组合并未公开。该发明包含表达细胞因子(如GM-CSF)的经实质性转化的细胞系。

美国专利5,882,654和美国专利5,840,317公开了用作同种异体疫苗的经照射的黑素瘤细胞系。所公开的疗法达到NED患者低于50％(16/37)的水平，并表现出有效的体液型抗肿瘤活性。

Wallack等的美国专利2006/0034811公开了含有抗原呈递细胞的疫苗，所述抗原呈递细胞带有溶解或破裂的肿瘤细胞(包括胞质溶胶和膜)。肿瘤细胞可以是来源于患者的细胞、细胞系或经编码IL-2的重组痘苗病毒感染的细胞。Palucka等的美国专利2006/0140983公开了在癌症患者中诱导免疫的组合物，其包括分离和纯化经激发而展示一种或多种热休克蛋白和死亡肿瘤细胞的抗原呈递细胞。抗原呈递细胞是树突细胞，肿瘤细胞可以是自体或同种异体细胞(如细胞系)。该文件公开了需要通过加热肿瘤细胞使其破裂而结合热休克蛋白。显示的测定结果不能必然揭示该组合物在黑素瘤患者中具有免疫诱导活性。

Albert等的美国专利6,602,709公开了使用凋亡细胞来将抗原呈递至树突细胞，以用于T细胞诱导。所述方法可用于诱导抗原特异性的细胞毒T淋巴细胞辅助细胞。树突细胞由凋亡细胞或其片段激发，能够加工抗原并呈递加工后的抗原，并诱导可用作治疗疫苗的细胞毒T淋巴细胞的活性。

发明概述

本发明一方面提供几个用于治疗恶性疾病的人黑素瘤细胞系，其中所述细胞系为(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSMACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(d)Mel-XX4(以保藏号DSM ACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)或(e)上述细胞系的亚群。可对所述细胞系进一步进行照射，以获得具有凋亡表型的类群和具有该细胞系坏死表型的类群。

本发明另一方面提供用于治疗黑素瘤的组合物，其中所述组合物含有至少一种同种异体黑素瘤细胞系，例如(a)Mel-XY1(以保藏号DSMACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(d)Mel-XX4(以保藏号DSMACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)或其组合，其中这些细胞系不能增殖。所述组合物还可含有赋形剂、佐剂(如BCG)和免疫调节剂(如GM-CSF或IFN-α)。在一个优选实施方案中，所述组合物包含以下四种同种异体黑素瘤细胞系之间的组合：(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)和(d)Mel-XX4(以保藏号DSM ACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，其中这些细胞系经过照射且不能增殖。在另一优选实施方案中，本发明的组合物包含以下三种同种异体黑素瘤细胞系之间的组合：(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)和(c)Mel-XY3(以保藏号DSMACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，其中这些细胞系经过照射且不能增殖。

本发明另一方面提供用于辅助治疗黑素瘤的组合物，其中所述组合物包含至少一种同种异体黑素瘤细胞系，例如(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(d)Mel-XX4(以保藏号DSMACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)及其组合，其中这些细胞系经过照射且不能增殖。所述组合物还可以包含赋形剂、佐剂(如BCG)和免疫调节剂(如GM-CSF和/或IFN-α)。在一个优选实施方案中，本发明组合物包含以下同种异体黑素瘤细胞系之间的组合：(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)或(d)Mel-XX4(以保藏号DSM ACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，其中这些细胞系经过照射且不能增殖。在另一优选实施方案中，本发明的组合物包含以下同种异体黑素瘤细胞系之间的组合：(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)或(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，其中这些细胞系经过照射且不能增殖。

本发明另一方面提供用于治疗人黑素瘤的组合物，所述组合物包含成熟的自体树突细胞、载有来自至少一种同种异体人黑素瘤细胞系之细胞的自体树突细胞、这些至少一种异源人黑素瘤细胞系的凋亡细胞。所述人黑素瘤细胞系是以下细胞系的一种或多种：(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，(d)Mel-XX4(以保藏号DSMACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，或(e)其亚群。

本发明另一方面提供用于辅助治疗人黑素瘤的组合物，所述组合物包含成熟树突细胞、载有至少一种同种异体人黑素瘤细胞系之细胞的树突细胞、一种异源人黑素瘤细胞系的凋亡细胞和一种异源人黑素瘤细胞系的坏死细胞。所述黑素瘤细胞系是以下细胞系的一种或多种：(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，(c)Mel-XY3(以保藏号DSMACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，(d)Mel-XX4(以保藏号DSM ACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，或其亚群。

本发明另一方面提供制备前述组合物的方法，其中该方法通过以下步骤进行：

a)解冻并培养细胞系(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)和(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)；

b)混合这三种细胞系；

c)照射这三种细胞系；

d)向细胞系混合物中加入佐剂和赋形剂。所述方法还可以包括在步骤a)中加入细胞系Mel-XX4(以保藏号DSM ACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)。

本发明的另一目的提供制备前述组合物的方法，其包括以下步骤：

a)解冻并培养细胞系(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)和Mel-XX4(以保藏号DSM ACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)；

b)混合上述细胞系；

c)照射上述细胞系；

d)获得自体树突细胞；和

e)将所述自体树突细胞与步骤c)中经照射的细胞系共培养一段时间。

本发明另一方面提供在患黑素瘤的患者中诱导抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的以下细胞系之间的组合：(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)和(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，其中这些细胞系不能增殖。可以与佐剂和/或免疫调节剂一起施用。

本发明另一方面提供在患黑素瘤的患者中诱导抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的以下细胞系之间的组合(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)和(d)Mel-XX4(以保藏号DSM ACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，其中这些细胞系不能增殖。

本发明另一方面提供在患黑素瘤的患者中诱导抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的6至72小时之间的共同培养物，所述共同培养物包含自体树突细胞和以下细胞系之间的组合(a)Mel-XY1(以保藏号DSM ACC2830保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(b)Mel-XY2(以保藏号DSM ACC2831保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)、(c)Mel-XY3(以保藏号DSM ACC2832保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)和(d)Mel-XX4(以保藏号DSM ACC2829保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ)，其中这些细胞系不能增殖。

附图说明

图1显示以凋亡诱导和坏死为参考进行的本发明细胞系混合物γ照射结果的代表性实施例(Apo-Nec细胞)。A图显示未经照射的细胞，B图显示γ照射70Gy后的细胞，用膜联蛋白V(Anexin V)-FITC和IP(碘化丙锭)染色。早期凋亡细胞定义为膜联蛋白V-FITC⁺/IP^-，而坏死细胞为双阳性。

图2显示用本发明DC/Apo-Nec组合物治疗的患者的Kaplan-Meier图。

图3显示应答于DC所呈递的自体肿瘤细胞的体外淋巴细胞增殖。结果显示为一式三份实验的平均值±标准差cpm(每分钟计数值)。孵育结合植物凝集素(PHA)高于7×10⁴cpm的淋巴细胞作为阳性对照。

图4显示对抗原Melan A/MART-1和gp100的四聚体染色。A栏显示来源于参与检测的HLA-A＊0201患者的PBMN样品所获得的结果。＊ND表示：由于施用后样品中CD8⁺T细胞量不足而导致未测定。B图显示CD8⁺HLA T淋巴细胞/四聚体肽⁺在来源于2号患者的PBMC中提高。数值代表CD8⁺HLA/四聚体肽⁺的百分比。对来源于健康供体的HLA-A＊0201PBMC进行染色，作为对照。

图5显示对本发明Apo-Nec细胞中IL-10和IL-12的胞质内测量。A图显示来自DCin的FACS结果，B图显示来自DC/Apo-Nec细胞的FACS结果。

图6显示抗原HMB45和Mart-1在细胞系Mel-XY1和此细胞系衍生克隆中的表达。上方三个图对应于细胞系，下方三个图对应于克隆。第1列对应于细胞系和对照克隆；第2列分别对应于细胞系HMB45表达和克隆；第3列对应于细胞系Mart-1表达和克隆。

图7显示来自第100号患者的黑素瘤活检。A图显示低放大倍数图像(25×)，其中可看到Ag gp100阳性和阴性肿瘤细胞；B图显示gp100的异质表达，其中可看到高、中和零表达的细胞(400×)；C图显示AgMART-1的异质表达，其中可看到被阴性细胞环绕的高表达细胞克隆(400×)。

图8显示用本发明Apo-Nec组合物治疗的患者的Kaplan-Meier图。

图9显示从第200号患者中切除的皮肤转移癌，该患者除GM-CSF、BCG以外还用本发明Apo-Nec组合物进行治疗。A图显示在肿瘤坏死区域(1)、与肿瘤细胞接触的淋巴细胞浸润区域(2)和活肿瘤区域(3)的巨噬细胞。B图是强肿瘤浸润区域的100×细节图，C图是相同区域的400×细节图(其中观察到浸润的淋巴细胞)，D图显示相同转移癌的细节图(其大部分是坏死的，具有载有黑色素的巨噬细胞(1)和活区域(2)，25×)。

图10显示来自用本发明Apo-Nec组合物和BCG治疗的第300号患者的计算机化轴向断层摄影图。A图用箭头显示肺转移的位置，B图显示5个月后拍摄的轴向断层摄影图。

发明详述

在本申请中，术语“组合”和“混合物”可以互换。

当在本发明中提到改变哺乳动物免疫系统的组合物时，应当理解的是，这些组合物在本领域中也称为疫苗组合物、基于细胞的疫苗或简单地称为疫苗。

本发明的四种细胞系根据布达佩斯条约于2007年3月23日以以下保藏号保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ：Mel-XY1DSM ACC2830细胞系、Mel-XY2 DSM ACC2831细胞系、Mel-XY3DSM ACC2832细胞系和Mel-XX4 DSM ACC2829细胞系。

细胞系表征测定的结果示于下表：

表1：本发明的人黑素瘤肿瘤细胞标记

  标记  XY1  XY2  XY3  XX4  Gp100(HMB45)  ND  ND  +  +  Gp100(PCR)  +  +  +  +  酪氨酸酶  (PCR)  +  +  +  +  MART-1(PCR)  +  -  +  -  MAGE 1(PCR)  ND  -  +  +  S100  +  +  +  +  波形蛋白  ND  +  +  +  CEA  ND  +  +  ND  GD2  +  +  +  +  GD3  +  +  +  +  P53  +  +  +  +  MIA  +  +  +  +  MCP-1  -  +  +  +  TRP-2  +  +  ND  +  MDR1  -  ND  -  -  I类HLA  A02/23  B18/B37  A30/33  B18/B65  A02/A23  B18  A24(9)/A33(19)  B18/B65(14)

  标记  XY1  XY2  XY3  XX4  II类HLA  DR7/DR11  DR52/DR53  DR1/DR1  DR11  DR13  DR52  DR1/DR11  裸鼠中的肿瘤发生  +  +  +  +  软琼脂集落生长  ++  ++  ++++  ++

从Mel-XY1细胞系的表征中可以看出，细胞在大小和形状方面作为异质的无黑色素细胞单层而生长(其中大部分形状为方形或长形)，且没有延伸。它们在高密度下轻微黑素化。Mel-XY1细胞在半固体琼脂中形成大量集落。Mel-XY1细胞在无胸腺鼠(裸鼠)中是致瘤的，且不发生转移。

从Mel-XY2细胞系的表征中可以看出，细胞在大小上作为异质的无黑素细胞单层生长。该细胞尺寸小，数量较少，多核且有明显核仁。还观察到黑素瘤中特征性树枝状延伸的细胞。在高密度下生长时，它们可以堆积起来并发育成微肿瘤。Mel-XY2细胞在无胸腺鼠(裸鼠)中是致瘤的，且不发生转移。

从Mel-XY3细胞系的表征中可以看出，细胞以单层生长。细胞是均匀的、小的且部分圆形的。在高密度下生长时，它们可以堆积起来并发育成微肿瘤。Mel-XY3细胞在半固体琼脂中形成大量集落。Mel-XY3细胞在无胸腺鼠(裸鼠)中是致瘤的，且不发生转移。

从Mel-XY4细胞系的表征中可以看出，该细胞系在高密度下以纺锤状单层生长。在低密度下，它表现出类似于黑素细胞的树枝状突出。细胞是黑素化的，且其中一些含有多个具有明显核仁的细胞核。群倍增时间为172-173小时，它们在软琼脂测定中形成集落。

当本发明Mel-XX4细胞系移植到裸鼠(免疫抑制的)中时，在体内产生了肿瘤细胞系。从原始肿瘤的连续传代证明，100％的被移植动物在第一个月中发生肿瘤。肿瘤生长缓慢，在第84天达到的平均值为372±63mm³。当以3×10⁶个细胞的量皮下注射时，本发明细胞系Mel-XX4是致瘤的。

从对模式染色体数目的分析中，观察到下列情况：本发明Mel-XY1细胞系在染色体计数中表现为有差异的(在105和110之间)，因而并未得到明确的众数(modal number)(男性)。本发明Mel-XY2细胞系表现出染色体数目为89和91的双峰趋势(男性)。本发明Mel-XY3细胞系表现出的众数为(男性)。数目最多的改变是第2对和第6对染色体缺失和第20对和第22对的额外染色体。本发明Mel-XY4细胞系表现出众数为57-58个(女性)。

对γ照射诱导本发明细胞系的凋亡进行研究。采用50Gy的射线足以完全抑制本发明每种细胞系在软琼脂中的克隆发生能力。当用70或100Gy照射细胞时，在凋亡/坏死诱导程度方面未观测到显著差异。图1A显示，未照射的黑素瘤细胞含有6-9％的早期凋亡细胞，其特征为为膜联蛋白-V⁺/Ip^-着色(右下方)。以70Gy照射并培养72小时以后，获得45-53％的早期凋亡细胞(见图1B，右下方)。膜联蛋白-V和IP染色的坏死细胞由未照射细胞中的7.5％提高到经照射细胞中的约15％(左上方)。因而，在本专利申请中，本发明的经照射黑素瘤细胞被称作Apo-Nec细胞，含有一种或多种任意Apo-Nec细胞系(Mel-XY1、Mel-XY2、Mel-XY3和/或Mel-XX4)的组合物被称为Apo-Nec组合物。

细胞照射使得能够获得无增殖能力的细胞，可用于生产组合物，例如本发明Apo-Nec组合物。对本领域的技术人员来说很明显的是，本发明的Apo-Nec组合物可以包含本发明的任一细胞系或它们的不同组合。在一个优选实施方案中，本发明Apo-Nec组合物包含Mel-XY1、Mel-XY2和Mel-XY3细胞系的混合物或组合。在另一优选实施方案中，本发明Apo-Nec组合物包含Mel-XY1、Mel-XY2、Mel-XY3和Mel-XX4细胞系的混合物或组合。本发明优选Apo-Nec细胞系的混合物提供了诱导优异的抗肿瘤免疫应答的多种抗原的组合。

令人惊讶的是，当用本发明Apo-Nec组合物进行治疗时，由本发明的四种Apo-Nec细胞系混合物所呈递的肿瘤抗原组合诱导针对肿瘤的特异性T细胞免疫应答，并使多于80％的患者免除疾病(见图8)。

本发明细胞系也用于制备称作DC/Apo-Nec的本发明组合物，所述组合物包含至少一种本发明细胞系和自体树突细胞。

在一个优选实施方案中，所述细胞系是细胞系Mel-XY1、Mel-XY2、Mel-XY3和Mel-XX4的不同组合。作为一个非限制性实例，所述组合可包含细胞系Mel-XY1和Mel-XY2的混合物，或者细胞系Mel-XY1和Mel-XX4的混合物。在一个优选实施方案中，细胞系的组合包含细胞系Mel-XY1、Mel-XY2、Mel-XY3和Mel-XX4的混合物；因此，存在这四种细胞。

在一个优选实施方案中，本发明组合物DC/Apo-Nec包含经照射细胞系Mel-XY1、Mel-XY2、Mel-XY3、Mel-XX4和自体树突细胞的组合。

本发明四种细胞系的特定组合提供了用于刺激树突细胞的天然抗原的独特来源，还提供了克隆发生细胞的抗原。必须考虑的是，本发明四种受照射细胞系的组合不仅提供天然抗原的特定组合，而且包含细胞群(其中存在约50％的凋亡细胞和约15％的坏死细胞)的特定组合。这种细胞群组合诱导DC的成熟。

本发明组合物DC/Apo-Nec的I期研究在16名黑素瘤患者(其特征示于表2)中进行。

表2：患者的特征

患者  性别  年龄  临床阶段  Mts   PBMC      DC/Apo-    剂量    临床评价  DTH

                                  (x10⁹     Nec                (30/3     分值

                                  个细胞)   的剂量             /07)

                                            (x10⁶

                                            个细胞)

1     F     42    IV        LN    3.5       5          4       P(8       4

                                                               m)

2     F     57    III       ND    3.6       5          4       NED       8

                                                               (54

                                                               m+)

3     M     32    III       ND    3.3       5          4       NED       14.25

                                                               (35

                                                               m+)

4        F    17    III    ND    4.4    5    4    NED    9.5

                                                  (45

                                                  m+)

5        M    56    IV     L     5      10   4    P(4    4

                                                  m)

6        M    60    III    ND    1.5    3    4    NED    4.5

                                                  (37

                                                  m+)

7        M    27    IV     SC    4.2    10   2    WP     ND

                                                  (1m)

8        M    26    III    ND    3.6    10   4    P(7    10.5

                                                  m)

9        F    42    III    ND    7.5    15   4    NED    5.6

                                                  (71m+

                                                  )

10       M    34    IV     LN    6.2    15   4    P      5.5

                                                  (11

                                                  m)

11       M    44    IV     L     4.7    15   4    P(410

                                                  m)

12       M    56    III    ND    8      15   4    NED    4.5

                                                  (25m+

                                                  )

13       M    47    IIC    ND    9.3    20   4    NED    6.5

                                                  (26

                                                  m+)

14       M    30    III    ND    7.5    20   4    NED    7.25

                                                  (39

                                                  m+)

15       M    52    IV     LN    6      20   4    P      3.75

                                                  (10

                                                  m)

16       F    57    IV     SC    8.2    20   4    P(6    5.25

                                                  m)

ND：不可测；SC：皮下；L：肺；LN：淋巴结

患者平均年龄为42岁(范围从17岁到60岁)。接受治疗的有5名女性和11名男性。其中一名患者患有IIC期AJCC黑素瘤，八名患有III期黑素瘤，七名患有IV期黑素瘤。5号和11号患者接受了肺转移手术；16号患者有皮下转移；1号、10号和15号患者由于淋巴结囊破裂而在手术后在腋窝处接受了放射治疗。患者四人一组用5、10、15或20×10⁶个与Apo-Nec细胞共培养的树突细胞(DC)(本发明DC/Apo-Nec组合物)治疗和清洗。每名患者每两周接受无佐剂的组合物DC/Apo-Nec给药(0.3ml)。由于右股的运动损伤后病情迅速发展以及不可控的感染，7号患者在第二次给药后被从实验方案中排除，该患者未被替代。

未成熟树突细胞(DCin)表现如下模式：95.1±3.6％为CD14^-/CD11c+，70±6％为CD1a⁺。纯度估计约为60％。

从接种在无血清培养基中的1×10⁸个PBMC获得约3×10⁶个DC。

当从患者中获得DCin并对包含于本发明组合物DC/Apo-Nec中的细胞进行表征时发现，来源于患者(n＝15)DCin细胞中的42.3±13.7％能吞噬本发明Apo-Nec细胞。用电子显微镜观测Apo-Nec细胞的吞噬作用，在DC内空泡中观察到完整Apo-Nec细胞或其部分。

本发明Apo-Nec细胞影响单核细胞衍生DC细胞的成熟过程的能力通过用流式细胞术(FACS)(FACSCalibur，BD Biosciences，San Jose，CA)测量特异性DC细胞标记来检测。对本发明Apo-Nec细胞的吞噬作用导致DC细胞成熟表型(相比于与LPS孵育的对照)。CD83、CD80、CD86、I类和II类HLA、CD40的表达量提高证明了DC细胞成熟。吞噬作用后，与DCin相比观察到细胞内吞的FITC-Dx下降了75.2％±16。

所有患者中在本发明Apo-Nec细胞的吞噬作用之后，趋化因子受体(C-C基序)受体7(CCR7)均提高了其在DC中的表达，这与CD细胞向MIP-3β的体外迁移相关。DCin细胞(9.6％CCR7+，MFI：23.3)向MIP-1α而不向MIP-3β迁移；相反地，DC/Apo-Nec细胞(81.8％CCR7+，MFI：41.2)明显地向MIP-3β而不向MIP-1α迁移。

除了6号患者(其表现出低PBMC产率，因而无法获得10×10⁶个DC/Apo-Nec细胞的剂量，只能每次施用3×10⁶个细胞的剂量)以外，剩余所有患者均接受预计剂量的本发明DC/Apo-Nec组合物，第1组：5×10⁶个，第2组：10×10⁶个，第3组：15×10⁶个，第4组：20×10⁶个。本发明DC/Apo-Nec组合物的耐受良好，发现的平均毒性病例均为1级。在给药部位发现弱局部反应和DTH，包扩红斑和丘疹。无患者显示自身免疫病的表现(表3)。

表3与施用本发明DC/Apo-Nec组合物相关的毒性

症状            组合物    组合物    组合物    组合物

                5x10⁶     10x10⁶    15x10⁶    20x10⁶

疲劳            1/4       1/3       0/4       0/4

头痛            1/4       0/3       0/4       0/4

寒战            1/4       0/3       0/4       0/4

腹部痛性痉挛    0/4       0/3       0/4       1/4

局部反应        4/4       3/3       4/4       4/4

虚弱            0/4       1/3       0/4       0/4

恶心            0/4       0/3       0/4       1/4

腹部疼痛        0/4       0/3       0/4       1/4

呕吐            0/4       0/3       0/4       1/4

厌食            0/4       1/3       0/4       0/4

腹泻            0/4       0/3       0/4       1/4

肌痛            1/4       0/3       1/4       0/4

在手术后平均随访41.5月(在25到71个月之间)后，IIC期患者显示无疾病迹象(no evidences of disease，NED)；7/8(87.5％)的III期患者为NED，7/7的IV期患者显示疾病的发展(见图2)。

评估本发明异质细胞Apo-Nec每次给药的DTH反应，并评估反应强度，DTH分数如实施例所述。在施用前，只有6/15的患者表现出针对本发明Apo-Nec细胞的轻微DTH反应。DTH测定揭示，Apo-Nec细胞的给药在所有患者中均诱导特异性反应，因为在施用第二剂DC/Apo-Nec组合物之后，DTH分数与第一次施用后观测到的基础反应相比显著提高(Mann Whithney检验P＝0.029，n＝15)。NED患者中的DTH分数高于疾病正在发展的患者(P＝0.28，Mann Wilcoxon秩和检验)。

提高每次给药的DC/Apo-Nec细胞量没有显著提高DTH值。

通过FACS分析测定，在给药前和给药后未观察到针对包含于本发明组合物中的活黑素瘤细胞的体液应答。还利用Western印迹技术在给药前和给药后的血清中鉴定了针对Apo-Nec细胞的反应性性抗体的存在情况。在四名患者(3号、4号、号和16号)中，在给药后血清中只观察和检测到黑素瘤蛋白的一条弱条带(＞200kDa)，所述条带在作为非特异性对照的乳腺癌细胞提取物中并未观察到。

为1号患者建立自体黑素瘤细胞系，从而可以测定在该患者中施用DC/Apo-Nec细胞来诱导针对自身肿瘤的淋巴细胞增殖应答的可能性。在施用Apo-Nec 1号细胞(如实施例中所述获得的来自1号患者的经照射的肿瘤细胞)之前和之后经5天的淋巴细胞孵育后，测定淋巴细胞增殖。图3显示，与给药前的淋巴细胞相比，作为对DC/Apo-Nec 1号细胞之应答的给药后淋巴细胞增殖要更高，提示存在针对Apo-Nec细胞所呈递肿瘤抗原的特异性免疫，所述特异性免疫在DC/Apo-Nec细胞给药后也存在于1号患者的肿瘤中。

参与本研究的15名患者中的7名具有单倍型I类HLA-A＊0201，这使得可以在他们自身的PBMC样品中研究限制性HLA肿瘤特异性应答。通过HLA四聚体/肽和IFN-γ分泌(用ELISpot测量)之间的特异性关联，直接在外周血样品中测定由CD/Apo-Nec组合物诱导的抗gp100应答和特异性Melan A/MART-1 CD8+T细胞。

在5/7的患者中，在之前(第一次给药前7天)和之后(第四次给药后15天)获得了足够的PBMC，用以通过四聚体染色分析对gp100和Melan A/MART-1具有反应性的特异性CD8+T淋巴细胞的存在。结果显示于图4A。2号和6号患者在给药后的gp100和Melan A/MART-1特异性CD8+T细胞的比例显著提高至高于1％，而且他们仍为NED(分别在手术后的53个月和36个月)；而5号、8号和16号患者的给药前四聚体染色降低，而且它们均在给药后处于疾病发展状态(图3A)。以2号患者的结果为例显示于图4B。识别gp100或Melan A/MART-1肽的CD8+T细胞的百分比在给药后分别从0.17和0.26提高到1.15和1.16。用健康阳性HLA-A＊0201供体在相同条件下进行的实验中未观察到反应性。

与用gp100或Melan A/MART-1脉冲刺激的自体DC细胞孵育24小时后，在给药前和给药后总PBMC的ELISpot中分析IFN-γ的释放，用流感肽作为对照(flu_58-66)。在5/7的HLA-A＊0201患者中进行这一分析。观察到两名患者(5号和16号)在施用本发明DC/Apo-Nec组合物后诱导了IFN-γ，所述IFN-γ由gp100和Melan A/MART-1特异性CD8+T细胞所分泌。在5号和16号患者中，所诱导的分泌IFN-γ的CD8+T细胞发生率为7-3.5×10^-4。在2号患者中，在给药前和给药后发现大量的gp100和Melan A/MART-1特异性CD8+T细胞。这名患者在手术后54个月仍未患病。8号和15号患者在基点(给药前)显示少量CD8+T细胞，在本发明DC/Apo-Nec组合物四次给药后未观察到变化。

在吞噬作用后的不同时间点通过FACS来定量本发明DC/Apo-Nec细胞中IL-12和IL-10之间的平衡，之后用Brefeldin A处理8小时以在胞质内积聚细胞因子。如图5所示，只有6.1％的DCin产生IL-12，但是在32小时之后，通过共培养，30.8％的DC/Apo-Nec细胞被诱导产生IL-12。另一方面，81.6％的DCin在胞质中含有细胞因子，且它们在吞噬作用后不会被修饰。产生IL-10和IL-12的双阳性细胞在24小时时为27.8％(见图5)。

本发明DC/Apo-Nec组合物是安全的，患者对其耐受良好。

本发明DC/Apo-Nec组合物诱导患者中的细胞应答，因为与基准值相比，用Apo-Nec细胞作为免疫原的DTH反应第二次给药后在所有患者中均提高。

在手术后进行治疗时，本发明DC/Apo-Nec组合物所治疗患者(IIc和III期)中的85％在平均41.5个月的随访后无疾病(见图2)。本发明DC/Apo-Nec组合物本身可用于治疗患黑素瘤的患者，也可用作根治后的辅助治疗，因为它能刺激患者中的免疫应答，其中免疫系统清除了所有残留的肿瘤细胞，保护患者免于复发的可能。更特别地，本发明DC/Apo-Nec组合物可用于治疗处于IIB、IIC和III期的具有较少肿瘤块的患者，也可用作IV期患者在根治之后的辅助治疗。

对本领域技术人员很明显的是，本发明DC/Apo-Nec组合物可用于治疗人黑素瘤；它也可作为与其他疗法一起使用的佐剂以及免疫系统刺激剂，例如，这取决于患者的阶段和治疗阶段。

重要地，必须指出的是本发明Apo-Nec细胞的组合物诱导自体DC细胞成熟。本发明Apo-Nec细胞的混合物或组合物是用于装载树突细胞的黑素瘤抗原的很好来源。注意，树突细胞只通过接触、吞噬本发明Apo-Nec细胞的组合而成熟，无需加入额外的刺激(例如常用做成熟混合物的白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、CD40配体或前列腺素E)。吞噬本发明Apo-Nec细胞的DC提高了应答于趋化因子MIP-3β的体外迁移和IL-12的胞内产生。本发明DC/Apo-Nec细胞能向特异性CTL抗原呈递交叉的天然肿瘤抗原。

如前所述，每名患者的DCin对Apo-Nec细胞的吞噬均诱导这些DC的成熟。

另一方面，对本发明细胞系的克隆发生能力进行分析。软琼脂中的本发明MEL-XY3细胞系集落表现出不均匀的形态，细胞间具有低粘附。观察到低比例的黑素化集落。软琼脂中的本发明MEL-XY1细胞系集落表现为紧密的形态，在所含细胞间具有高粘附。很少观察到黑素化的集落。

作为表征集落的方法，比较了本发明细胞系和软琼脂中所述细胞系集落的黑素瘤抗原表达水平，以β-肌动蛋白的表达进行归一化。克隆表征的结果示于表4和图6。

表4本发明细胞系和本发明克隆发生系之间抗原表达的比较研究

ND：未测定

＊未归一化的数据

可以观察到，在本发明的细胞群和每种细胞系都存在克隆发生细胞的亚群，这些克隆发生细胞也包括在本发明的范围内。克隆发生细胞的存在可以为患者提供未分化细胞(也叫做干细胞)的典型抗原。

黑素瘤肿瘤的异质性高，因此对免疫疗法而言，很重要的是使用由细胞系及其亚群的混合物或组合所提供的复合抗原混合物。作为一个实例，图7显示了原发黑素瘤活检，其显示了该肿瘤的异质性与黑素细胞分化抗原表达的比较。

当根据下述实施例中公开的方案，用本发明Apo-Nec组合物和作为佐剂的BCG、作为免疫调节剂的GM-CSF一起治疗患者时，观察到75％的患者(IIC期和III期)在最长51个月的随访中无疾病(见图8)，且毒性低，仅为1级。

显示了来自一个选定方案患者的示例性结果。200号患者为女性，白种人，67岁，2003年11月加入实验。2002年6月，她接受了对生长的脊背痣的手术。组织学显示为皮肤黑素瘤，Clark分级为IV，Breslow分级为5.7mm。2002年8月，检测到一些卫星瘤，并将它们切除。向该患者施用Apo-Nec+BCG+GM-CSF，接受600μg GM-CSF(/组合物)，结束治疗时几乎无毒性。在最后一次临床检查时，在其背部检测到一个可疑结节，将其切除，显微镜图像显示于图9。观察到强烈的淋巴浸润和残余的存活肿瘤区域，但也有强烈的肿瘤组织坏死，而且存在载有黑色素的巨噬细胞。

作为一个实例，还显示了用本发明Apo-Nec组合物+BCG+IFN-α治疗的患者中的结果。300号患者是男性，17岁，他加入实验时患有左腹股沟腺病。两个月后，实施了另一左腹股沟切除手术，其中得到4/11的有黑素瘤转移的结节。他接受了低剂量白细胞介素-2的治疗。

第二次切除的14个月后，在腹股沟弓检测到复发，再次实施手术，其中分离了5/7有黑素瘤转移的结节。患者表现出背部疼痛。计算机化轴向断层摄影术揭示了腹膜后的腺病，实施采用Dartmouth方案的化学疗法。结束化学疗法后，他开始用本发明Apo-Nec组合物+BCG治疗。开始用本发明组合物治疗14个月后，在左腹股沟区域检测了一个结节。对其进行手术，检测到黑素瘤转移，以及大量淋巴浆细胞浸润。该患者继续用Apo-Nec组合物+IFN-α治疗。图10显示了左肺结节的消退。现在，该患者已经无疾病。

本发明公开了组合表达大多数黑素瘤相关抗原的黑素瘤细胞系、包含这些经照射细胞系的组合物以及包含离体产生的自体DC(已吞噬了黑素瘤细胞系的凋亡/坏死细胞混合物)的组合物。

根据下面的实施例可更好地阐明本发明，所述实施例不应理解为对其范围加以限制。相反地，应当清楚理解的是，在阅读本说明后，本领域的技术人员可提出其他实施方案、修改和等同方案，而不偏离本发明精神和/或所附权利要求书的范围。

实施例1：本发明细胞系的获得、建立和维持

Mel-XY1：细胞系Mel-XY1得自一名男性白种人患者，从背部原发性黑素瘤后继发的肺转移中获得。该患者两年后死于脑转移。

Mel-XY2：该细胞系来源的患者是44岁的男性白种人，其表现出背部糜烂性黑色素瘤(Clark’s分级为III)。两年后，该患者同时发生腋窝腺病和肺转移。腋窝腺病被切除、分离，由这些细胞产生了本细胞系。

Mel-XY3：患者为43岁的白种男性，他发生原发性臂部黑素瘤。两年后，腋下淋巴结转移出现。该患者接受了DTIC的化疗，无明显的临床反应。腋窝转移被切除，这些细胞产生了细胞系Mel-XY3。

Mel-XX4：该细胞系从一名33岁白种女性的腹股沟腺病手术中获得，其中上述腺病被诊断为黑素瘤转移。原发性肿瘤不明。十五个月后，该患者在腹股沟淋巴结处复发。切除全部黑素化淋巴结，并切成小块，去除脂肪和结缔组织，悬于Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中，通过以尼龙筛挤压进行机械分离，将细胞聚集体在37℃用酶处理过夜。

将细胞重悬于在补充有10％胎牛血清(FBS)(Natocor，Cordoba，Argentina)的黑素瘤培养基中，接种到25cm²培养瓶中，在具有湿度和5％CO₂-95％空气的气氛中以37℃孵育。24小时后，除去培养基以除去未贴壁的细胞。

使细胞悬液四次通过抗成纤维细胞微球柱(Miltenyi Biotec，Germany)。获得的细胞被命名为Mel-XX4。

在Centro de Investigaciones Oncológicas-FUCA的GMP实验室中，通过在黑素瘤培养基DMEM：F12的营养混合物(1∶1)中进行培养来维持本发明的四种细胞系(Mel-XY1、Mel-XY2、Mel-XY3和Mel-XX4)，所述营养混合物除了10％胎牛血清(FBS)(Natocor，Córdoba，Argentina)之外，还补充有2mM谷氨酰胺、20nM亚硒酸钠、100μM抗坏血酸、0.3mg/ml半乳糖、0.15mg/ml的丙酮酸钠和5μg/ml的胰岛素、100IU/ml青霉素、10μg/ml链霉素。

将对Melan A/MART-1(M27：AAGIGILTV)和gp100(G154：KTWGQYWQV)抗原具有特异性的克隆CTL(限制的HLA A＊0201)在含有10％灭活AB人血清和抗生素的RPMI培养基中以14天的周期使用30ng/ml抗CD3抗体(OKT-3，BD Biosciences)进行扩增，并且每3天使用一组300UI/ml IL-2(Chiron BV，Amsterdam，Netherlands)。

实施例2：细胞系的表征：

体外生长动力学：

将10⁴个细胞在24孔板(Corning)的孔中培养。每2-3天，用EDTA(0.02％)处理细胞，收集并计数。从指数生长期的生长曲线斜率来计算细胞群倍增时间。

克隆发生

锚着非依赖性细胞的生长通过软琼脂方法来测定(Hamburger和Slamon，Science 197：461，1977)。将3-10×10³个细胞在上层培养基中培养。将平板孵育21天，然后每天加入50μl的培养基。将超过36个细胞的集落在显微镜下计数。

利用免疫细胞化学(ICC)和FACS来表征黑素瘤抗原

为进行ICC测定，用EDTA处理指数生长的细胞，离心，甲醛固定，石蜡包埋，然后切成薄片。用患者的正常组织样品作为对照。

用针对角蛋白、波形蛋白、gp100/HMB 45(Biogenex)、MART1/Melan-A(Dako)的单克隆抗体(Mab)和抗S100的多克隆抗体对组织和细胞进行测定。

利用抗生物素蛋白-生物素复合物(Vectastain ABC)使反应显影。利用0.6％的H₂O₂封闭内源过氧化物。

通过重悬经EDTA处理的细胞来进行间接免疫荧光反应。在使用10％稀释的正常山羊血清封闭后，将细胞与一抗孵育，冲洗，与二抗(FITC山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako))孵育，洗涤，在1％多聚甲醛中固定，并用FACS(FACS Vantage SE，Becton-Dickinson，USA)进行分析。一抗是小鼠抗p53Mab(DO-7，BD Pharmingen)、3F8抗GD2、R24抗GD3。对于p53的情况，将细胞进行透化处理。通过PCR-SSP对I类和II类人类白细胞抗原(HLA)进行分型。

利用RT-PCR测定黑素瘤相关抗原：

用Trizol(Invitrogen)提取总RNA。为了起始cDNA合成，向1-3μgRNA中加入适当的引物，与200U MMLV-RT酶(Promega)、25-40URNAsin(Promega)和250-500μM dNTP(Invitrogen)在70℃孵育5分钟，然后42℃孵育60分钟。选用特异性引物对，用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)扩增cDNA等分试样(2-10μl)。

特异性引物显示如下：

Gp100

5′-GCTTGGTGTCTCAAGGCAACT-3′(SEQ ID No 1)

5′-CTCCAGGTAAGTATGAGTGAC-3′(SEQ ID No 2)

MART-1

5′-CAAGATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3′(SEQ ID No 3)

5′-GCTTGCATTTTTCCTACACCATTCCA-3′(SEQ ID No 4)

酪氨酸酶

5′-TTGGCAGATTGTCTGTAGCC-3′(SEQ ID No 5)

5′-AGGCATTGTGCATGCTGCTT-3′(SEQ ID No 6)

5′-GTCTTTATGCAATGGAACGC-3′(SEQ ID No 7)

5′-GCTATCCCAGTAAGTGGACT-3′(SEQ ID No 8)

TRP-2

5′-GAGTGGTCCCTACATCCTACG-3′(SEQ ID No 9)

5′-GCGTCCTGGTCCTAATAATGT-3′(SEQ ID No 10)

MAGE-1

5′-GAGTCCTCAGGGAGCCTCC-3′(SEQ ID No 11)

5′-TTGCCGAAGATCTCAGGAAA-3′(SEQ ID No 12)

NY-ESO-1

5′-AGCCGCCTGCTTGAGTTCTACCTC-3″(SEQ ID No 13)

5′-AGGGAAAGCTGCTGGAGACAG-3′(SEQ ID No 14)

MDR-1

5′-TCCAAGAAGCCCTGGACAAAG-3′(SEQ ID No 15)

5′-TTGATGATGTCTCTCACTCTGTTCC-3′(SEQ ID No 16)

MIA

5′-CATGCATGCGGTCCTATGCCCAAGCTG-3′(SEQ ID No 17)

5′-GATAAGCTTTCACTGGCAGTAGAAATC-3′(SEQ ID No 18)

β-肌动蛋白

5-′ATGTTTGAGACCTTCAACACCCC-3′(SEQ ID No 19)

5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3′(SEQ ID No 20)

反义链引物显示于下面一行中。

为进行酪氨酸检测，还扩增了使用内部引物进行的第一步PCR反应的1/100等分试样(巢式PCR)。

在琼脂糖凝胶中分析PCR产物，用溴化乙锭进行染色；通过与100bp DNA PM标记(Promega)的条带进行比较来计算片段的大小。

细胞遗传学和细胞分子学分析：

将对应于本发明四种细胞系的相应细胞与秋水仙素(0.1μg/ml)在37℃孵育8-16小时，用来进行指数生长期的细胞遗传学分析，使用胰蛋白酶-EDTA溶液收集，并按照标准方案进行处理。使用G-带技术。根据人类细胞遗传学命名国际体制(Mitelman，1995 ISCN.：AnInternational System for Human Cytogenetic Nomenclature，(S Karger，Basel编辑)进行染色体的鉴定。

实施例3：从单核细胞产生树突细胞(DC)，对其进行表征，并装载Apo-Nec细胞。

从健康供体的血沉棕黄层或者白细胞清除产物中获得树突细胞。将外周血单个核细胞(PBMC)用Fycoll-Hypaque密度梯度进行纯化。将PBMC悬于新鲜的AIM-V^TM无血清培养基(Invitrogen)中，并使其在培养瓶(TPP，Germany)中贴壁。37℃培养2小时后，去除未贴壁细胞，并将贴壁的单核细胞在补充有800U/ml rhuGM-CSF和50ng/ml IL-4(Peprotech，Mexico)的AIM-V中培养5天，从而获得CDin。通过光学显微镜和FACS来分析表型变化。为诱导DCin的可控成熟，加入2μg/ml的LPS(大肠杆菌J5脂多糖，Sigma，St.Louis，CA)，最后培养细胞48小时。

在细胞处于未成熟状态(DCin)时，并且在用针对CD14、CD11c、CD1a、II类HLA、CD80、CD86、CD83、CD40、I类HLA和CCR7抗原的荧光染料标记抗体(BD Biosciences，San Jose，CA)对5×10⁵个细胞染色而进行凋亡/坏死细胞(Apo-Nec细胞)吞噬测定后，通过FACS分析(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行DC细胞表型表征。合适的同种型对照为大鼠IgG2a PE、小鼠IgG1和IgG2a(BD Biosciences，San Jose，CA)。还采用未标记的单克隆抗体抗CD83(IgG1)和合适的同种型作为对照，分析了CD83在吞噬Apo/Nec细胞的DC中的表达情况；为进行显色，使用抗小鼠IgG1-PerCP(BD Biosciences，San José，CA)。

通过将1×10⁶个DC与1mg/ml缀合FITC的葡聚糖(Dx-FITC)(Sigma，St Louis，CA)在37℃孵育30分钟，来评估DC的内吞能力。孵育后，用PBS洗涤细胞，并用FACS进行分析。对照包括与Dx-FITC在4℃下孵育30分钟(以抑制内吞过程)的DC；另一方面，在测定中时间点为0时被认为是基准掺入。用FACS定量DX-FITC的掺入(内吞)。

DC细胞吞噬作用的评估：

将DCin细胞在新鲜的AIM-V培养基中与Apo-Nec细胞(如前所述制备)进行不同时间的共培养。在一些测定中，DC被PKH26染成红色，Apo-Nec细胞被PKH67(Sigma，St.Louis，CA)染成绿色。在共培养后进行FACS分析，将吞噬了Apo-Nec细胞的DC的百分比定义为双阳性细胞的百分比。针对每种颜色进行合适的对照。通过在4℃下将细胞孵育相同时长来作为Apo-Nec细胞与DC非特异性结合的对照。

DC在体外的迁移：

在与Apo-Nec细胞共培养之前和之后，用48孔趋化小室(AP 48Neuroprobe Inc.，Gaithersburg，MD)分析DC细胞的体外迁移。将10ng/ml用RPMI稀释的MIP-1α或MIP-3β(Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA)置于底部隔室中。通过将RPMI置于下部小室中来测定基础迁移。将DC接种在上部小室(3×10⁴个CD/孔)的RPMI中。在上部和下部小室之间放置5μm孔径的聚碳酸酯膜(Neuroprobe，Inc.，Bethesda，MD)。37℃放置90分钟后，去除膜上侧的细胞，将粘附在膜下侧的迁移细胞用中性水稀释的10％Giemsa染色。将膜晾干，用加拿大树胶包埋在载玻片上，用显微镜计算迁移数目。用40×放大倍率对每个孔分析5个视野，每种条件分析3个孔。用Student检验进行统计学分析。

电子显微术：

吞噬过程也用电子显微术进行了研究。用0.1M磷酸缓冲液中2.5％的多聚甲醛固定共培养的样品，用1％的四氧化锇进行固定后染色，将样品用蒸馏水洗涤两遍，并用5％的乙酸双氧铀复染两小时。洗涤和脱水后，将样品包埋于树脂(Durkupan)中。获得超薄切片(70-90nm)，置于铜网上，并用Reynold’s柠檬酸铅进行复染。在Zeiss 109透射电子显微镜下对筛网进行分析。或者，为了获得完整细胞的图像，由超薄切片机(Reichert-Jung)得到薄切片(0.5μm)，用溶于0.1M的碳酸盐缓冲液的0.4％甲苯胺蓝染色，用Durkupan包埋，用光学显微镜(1000×)分析。由Sony Cybershot Digital数码相机(500万像素)获得图像，并用Adobe photoshop 6.0程序处理。

体外交叉呈递测定、IFN-γ分泌：

用抗CD14微球(Miltenyi Biotec，Germany)从HLA A＊0201供体中纯化98％的CD14+单核细胞，并通过如前所述的5天培养分化成DCin细胞。将DCin细胞与Apo-Nec细胞孵育6、12、24和48小时，并在1ml的AIMV培养基中过夜暴露于特异性CTL MelanA/MART-1或gp100的克隆。根据厂商建议，通过ELISA技术(OptEIA IFN-γ，Pharmingen BD Biosciences，San Diego，CA)一式三份测定分泌到上清液中的IFN-γ。每个实验都绘制标准曲线，并用log-log回归分析和Cembal 2.2软件计算样品浓度。对照包括：DC加20μg/ml的MART-1或gp100肽、表达MART-1和gp100抗原的HLAA＊0201⁺活黑素瘤细胞系(阳性对照)，或者与非特异性肽和不表达合适抗原的HLA A＊0201⁺活黑素瘤细胞系一起培养的DC(阴性对照)。

测量胞质内的细胞因子IL-10和IL-12：

将PKH26标记的DC(红色)与PKH67标记的Apo-Nec细胞共培养不同的时间(6、12、24和48小时)。在培养后(Golgi Plug，BDBiosciences，San Jose CA)用Brefeldin A(8小时)封闭其产物后，通过细胞内免疫荧光技术进行积累的细胞因子的测量。用0.05％皂苷对细胞进行透化，并用抗IL10(大鼠同种型IgG2a)-APC和抗IL12亚单位p40-p70(小鼠同种型IgG1)-PerCp(BD Biosciences，San Jose，CA)进行染色。选择PKH26/PKH67双染色的细胞群来进行FACS研究，对上述细胞群在四色实验中评估细胞因子。以4℃共培养物作为对照。

实施例4：本发明组合物的制备以及给药方案：

Apo-Nec组合物：

对细胞系进行照射：

用70Gy的γ射线(Siemens，Instituto Alexander Fleming，BuenosAires，Argentina)照射本发明的四个细胞系(Mel-XY1、Mel-XY2、Mel-XY3和Mel-XX4)，随后将细胞(50％DMEM、40％人白蛋白和10％DMSO)冻于液氮中待用。

施用细胞的当天，将细胞解冻、洗涤，然后制备成包含本发明每种分离细胞系或其组合的5-10×10⁶个细胞的组合物剂量，将其重悬于DMEM培养基中。

皮内注射300ul。

DC/Apo-Nec组合物：

制备凋亡/坏死肿瘤细胞：

在含10％胎牛血清的黑素瘤培养基中，解冻并接种如前所述经照射和冷冻的细胞(Mel-XY1、Mel-XY2、Mel-XY3和Mel-XX4)，直到发生完整的凋亡过程。培养72小时后，将细胞从培养瓶的底部分离，洗涤、计数，并重悬于新鲜的无血清AIMV^TM培养基中(治疗级，GIBCO，Invitrogen Corporation，Grand Island，N.Y)。凋亡和坏死通过膜联蛋白-V FITC连接技术和碘化丙锭(IP)掺入(膜联蛋白-V凋亡检测试剂盒，BD Biosciences，San Jose，CA)来检测，用FACS进行分析。软琼脂上的克隆生成检测以一式六份进行(1.5×10⁴个细胞/孔)，以分析经照射细胞的增殖能力(与未照射的对照细胞相比)。

根据每个患者的剂量，将5、10、15或20×10⁶个DC与Apo-Nec细胞在AIMV培养基中于37℃共培养48小时。在给药当天，将共培养的细胞用1200rpm离心5分钟，重悬于DMEM培养基(300μl)，并向具有淋巴结完整通路的四肢之一进行皮内注射。

对所有组合物的制备进行质量控制和无菌测定。

实施例5：患者研究设计及选择标准：

进行患者研究以评估毒性、生存力及对治疗的免疫应答。所述研究经Institutional Revision Council of Instituto Alexander Fleming及伦理委员会批准。生存力标准为(a)经组织学证实为IIB、IIC、III或IV期(AJCC)的皮肤黑素瘤；(b)手术后具有最小程度或者不可检测疾病(ND)的患者，评估了计算机化轴向断层摄影术和乳酸脱氢酶(LDH)水平。本研究中可包括具有未知原发性黑素瘤的患者；(c)年龄在15到60岁之间；(d)预期寿命大于6个月；(e)结果(ECOG)0，o1；(f)先前用IFN-α治疗过的III期患者(该患者已完成治疗或由于疾病发展、毒性或其他临床原因而中断治疗)，或者手术前6个月未开始用IFN-α治疗的患者；(g)足以用于白细胞清除方法的静脉入口，(h)实验室选取标准为：血红素＞10gr％；白细胞计数＞4800/mm³，血小板＞150,000/mm³；总直接胆红素、谷草转氨酶、谷丙转氨酶＜1.5倍正常最高值；LDH≤450mU/ml；i)非孕妇，对未到更年期的妇女，每次给药前一周测定血清β-HCG；(i)肌酸酐＜1.4mg％；(k)前几个月无化学治疗、放射治疗或者生物治疗；(k)无皮质激素或者非固醇类抗炎药物(AINE)治疗；(l)无活跃的脑转移；(m)正常的ECG；(n)所有患者必须签署知情同意书。

患者评估和治疗方案：

在第一次给药前35天内完成患者基本评估。临床评价包括完整的临床病史、身体检查、心电图(ECG)、计算机化轴向断层摄影术(胸腔、腹腔、骨盆和脑)，测定肿瘤阶段、肿瘤大小并记录患病部位、血液化学检测和血液学。对所选的患者进行白细胞清除以获得PBMC，进而产生DC。

患者以两周的间隔接受4次DC/Apo-Nec给药。皮内进行接种(300μl)，并对每剂量进行DTH检测，该检测包括在前臂接种无佐剂的5-20×10⁶个DC/Apo-Nec细胞。给药后2、24和48小时分析生命体征和DTH皮肤反应。第70天通过腹部超声波检查和胸腔X射线来检查患者的状况，该方案结束于第75天(进行临床检查)。

为施用本发明的Apo/Nec细胞，在有完整淋巴结的一肢对患者进行皮内(id)注射。二十名(20)患者接受400μg rhGM-CSF剂量(每天100μg，共4天)。在给药当天，将0.1ml hGM-CSF与0.05ml的Apo-Nec(0.3ml中16×10⁶个未照射细胞)和BCG(1×10⁶个集落形成单位)混合。在其后3天中，在给药位点处皮内注射0.1ml rhGM-CSF。每个患者接受间隔为3周的4次给药，然后一年中每两个月接受1次组合物，次年每3个月接受1次组合物，其后继续每6个月接受1次组合物。

统计学分析：

根据国立癌症研究所(NCI)的通用毒性标准对所有不良结果进行分类。

可评估群体定义为接受4次给药的所有患者。由于多数患者数据不是正态分布的，因此对全部数据使用Wilcoxon’s秩和检验进行分析。在每组之间使用单变量ANOVA和Dunnett多重比较检验比较接受不同剂量DC/Apo-Nec的不同群体的DTH值。P值＜0.05被认为是显著的。

评估受治患者免疫应答的方法：

为评估患者的免疫应答，分别在给药前7天(前血清)和治疗完成后15天(后血清)获取血清，所得样品保存于-80℃。PBMC细胞通过Ficoll-Hypaque梯度及后续离心而从白细胞清除术(给药前)中纯化，或从最后一次给药后15天获得的100ml血液(给药后)中纯化，将PBMC冻存于50％DMEM、40％人白蛋白和10％DMSO中直到用于免疫分析。将患者样品与缀合有FITC的小鼠抗HLA＊A0201单克隆抗体(BD-Pharmingen，San Jose，CA)孵育后，测定HLA-A＊0201HLA分型。

DTH反应：

在给药的每天，在前臂上用2×10⁶个Apo-Nec细胞进行DTH测试，在给药后第2、24和48小时后评估反应。DTH强度值确定如下：0：红斑＜0.5cm；1：具斑点的红斑0.5-1.0cm；2：具斑点的红斑1.0-2.0cm；3：具斑点的红斑＞2.0cm或丘疹状红斑＜1.5cm；4：丘疹状红斑＞1.5cm。储藏DTH对应所有个体DTH强度之和的四分之一。

增殖测定：

通过Ficoll-Hypaque密度梯度获得施用组合物前和施用组合物后的PBMC，冻存于液氮中待用。将细胞解冻用于测定，在AIM-V培养基(Gibco，Grand Island，NY)中以37℃孵育1小时。将5×10⁵个细胞接种到含有或不含植物凝集素(PHA)(5μg/ml)(Gibco，Grand Island，NY)的96孔板中，并在37℃孵育72小时。在最后16小时中，对细胞进行(³H)dThd(Amersham，1μCi/well)脉冲刺激，在细胞裂解后用液闪计数器测量(Ceu Harvester，Nunc，Rochester，NY)DNA中掺入的放射性。

细胞因子的测定：

在给药前(给药前血清)和第四次给药后两周(给药后血清)测定患者的血清IL-10和IL-12浓度。将血清冻于-80℃直至ELISA测定(OptEIA IL-10和IL-12，BD Biosciences，San Diego，CA)。每次实验都绘制标准曲线，样品的浓度使用Cembal 2.2软件通过log-log线性回归分析进行计算。

用ELISpot技术测量IFN-γ：

使用包被有抗CD14(Miltenyi Biotec，Paris，France)的微球，从来自HLA-A2阳性患者的PBMC中纯化CD14⁺细胞作为刺激剂，在含有100ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4的合成SYN-H培养基(AbCys，Paris，France)中培养5天，并用10μg/ml的LPS再处理48小时使其成熟。在37℃下用稀释在SYH-H培养基中的10μg/ml合适多肽对成熟的DC脉冲刺激1小时，洗涤，并与PBMC混合直至达到10∶1的E/T患者比例，每孔使用总计10⁵个CD8⁺淋巴细胞。

用硝酸纤维素膜(MAIPS 450；Millipore，Bedford，MA)盖上96孔板，与10μg/ml人抗IFN-γmAb(Mabtech，Nacka，Sweden)在pH 9.6的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中4℃过夜，洗涤，用IMDM培养基+10％AB人血清(Biowest，Nuaille，France)在37℃封闭1小时。将效应细胞接种到100μL培养基中，加入靶细胞直至达到10∶1的E/T比例，每孔总计200μL。孵育24小时后，将孔用含0.1％吐温-20的PBS洗涤5次。将平板与1μg/ml人生物素标记的抗IFN-γ小鼠mAb(Mabtech)在PBS/HSA(0.4g/L)中室温孵育2小时。用含0.1％吐温-20的PBS洗涤数次后，加入溶于PBS/HSA中的1∶1000碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白(Mabtech)，室温孵育1小时。然后洗涤平板，加入5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基-四氮唑蓝底物，室温放置30分钟(Mabtech)。用水洗涤平板来终止显色。干燥后，使用ELISpot自动图像读取系统(AID，Strassberg，Germany)通过硝酸纤维素膜上的彩色点来计数和显现分泌IFN-γ的CD8⁺T细胞。

用HLA四聚体/肽染色：

用HLA-A0201四聚体来分别鉴定对MART-1(AAGIGILTV)或缀合PE(藻红蛋白)的gp-100(KTWGQYWQV)或APC(别藻蓝蛋白)具有特异性的CD8⁺T淋巴细胞的克隆。在37℃进行染色方法15分钟，并立即置于冰上。然后，将样品与抗CD8 FITC(BD Biosciences，SanJose CA)在4℃再孵育40分钟，并用FACS进行分析。使用MART-1(M27：AAGIGILTV)和gp100(G154：KTWGQYWQV)抗原的特异性CTL克隆(受限的HLA A＊0201)作为阳性对照，所述克隆在RPMI培养基中以14天的周期进行增殖，上述培养基中含有30ng/ml抗CD3抗体(OKT-3，BD Biosciences)和每3天300UI/ml IL-2(Chiron BV)，以及10％灭活的人AB血清和抗生素。用来自健康HLA-A0201供体的PBMC样品作为阴性对照。

体液应答的测定：

将含有Apo-Nec细胞的活细胞按照相同比例混合，用10％兔血清封闭30分钟，并与1/10稀释的给药前和给药后的血清于4℃孵育1小时。然后进行洗涤，将上述细胞与从兔(DakoCytomation，Glostrup，DK)中得到的人抗免疫球蛋白抗体(IgG+A+M)在4℃孵育1小时。洗涤细胞，并以1％的多聚甲醛固定，通过FACS进行分析。或者，在封闭阶段先用含0.05％皂苷(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO)的PBS对细胞进行透化，并在反应阶段之后向每个反应中加入0.05％皂苷/PBS。用正常血清作为一抗对照。

从本发明Apo-Nec细胞系中制备蛋白提取物。将细胞沉淀冻于-80℃，解冻，并用裂解缓冲液(50mM Tris-ClH，pH 7.5，1％ NP₄O，150mMNaCl，5mM EDTA，1mM PMSF)在4℃处理20分钟。将悬液用Polytron(Brinkmann Instruments，USA)匀浆，并于10,000g离心40分钟。将上清液以等分试样冻存于-20℃。根据Lowry法测量蛋白浓度。用类似方法制备IIB-BR-G人乳腺癌细胞系蛋白提取物。

将蛋白提取物(50μg)在3％-12％梯度的SDS-PAGE中电泳，转移到硝酸纤维素膜(0.45μm孔径，Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)。用3％的脱脂牛奶(Moliko，Argentina)封闭后，将膜与1/10稀释的患者血清孵育4℃过夜。数次洗涤后，将膜与从山羊中获得的缀合辣根过氧化物酶(HRP)(Zymed，San Francisco，CA)的人抗IgG+A+M一起抗体孵育，用4-氯-萘酚和H₂O₂显色。

黑素瘤转移瘤的组织病理学分析：

用石蜡包埋的活检来分析淋巴样细胞和DC细胞的浸润。将三到五个切片用苏木精/曙红染色，或者用抗CD4(1F6 clon)、抗CD8(C8E-144b clon)、抗CD20(L26 clon)、抗CD1a(010 clon)(DakoCytomation，Glostrup，DK)和抗CD57(NK1 clon，Zymed，San Francisco，CA)抗体进行免疫染色，用ABC试剂和对二氨基联苯(DAB)或以Novared作为底物(Vectastain，Vector，Burlingame，CA)显色。将不含一抗的反应作为对照。切片用Olympus BX40显微镜进行分析。

序列表

<110>CONICET

Mordoh，José

<120>用于治疗黑素瘤的细胞系、含有它们的组合物、制备所述组合物的方法以及治疗方法

 

<130>CONICET

<160>20

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>GP100 5′-3′引物

<400>1

gcttggtgtc tcaaggcaact        21

 

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义Gp100引物

<400>2

ctccaggtaa gtatgagtgac         21

 

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>MART-1 5′-3′方向引物

<400>3

caagatgcca agagaagatg ctcact    26

 

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>MART-1反义引物

<400>4

gcttgcattt ttcctacacc attcca    26

 

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5′-3′有义酪氨酸酶引物

<400>5

ttggcagatt gtctgtagcc           20

 

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义酪氨酸酶引物

<400>6

aggcattgtg catgctgctt           20

 

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5′-3′有义内部酪氨酸酶引物(巢式DNA)

<400>7

gtctttatgc aatggaacgc           20

 

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义内部酪氨酸酶引物(巢式PCR)

<400>8

gctatcccag taagtggact      20

 

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5’-3’有义TRP-2引物

<400>9

gagtggtccc tacatcctac g    21

 

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义TRP-2引物

<400>10

gcgtcctggt cctaataatg t    21

 

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5’-3’有义MAGE-1引物

<400>11

gagtcctcag ggagcctcc       19

 

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义MAGE-1引物

<400>12

ttgcccgaaga tctcaggaaa        20

 

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5′-3′有义NY-ESO-1引物

<400>13

agccgcctgc ttgagttcta cctc    24

 

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义NY-ESO-1引物

<400>14

agggaaagct gctggagaca g       21

 

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5′-3′有义MDR-1引物

<400>15

tccaagaagc cctggacaaa g       21

 

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义MDR-1引物

<400>16

ttgatgatgt ctctcactct gttcc      25

 

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5′-3′有义MIA引物

<400>17

catgcatgcg gtcctatgcc caagctg    27

 

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义MIA引物

<400>18

gataagcttt cactggcagt agaaatc    27

 

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5′-3′有义β-肌动蛋白引物

<400>19

atgtttgaga ccttcaacac ccc        23

 

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义β-肌动蛋白引物

<400>20

 

gccatctctt gctcgaagtc cag        23