一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方法

摘要

本发明提供一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方法，它运用多重PCR-荧光标记单碱基延伸-标签微阵列杂交基因分型技术结合GenomeLab

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方法，这些基因是人补体受体1型(CR1)、达菲抗原/趋化因子受体(DARC)、白细胞分化抗原59(CD59)、白细胞分化抗原4(CD4)、白细胞分化抗原8A(CD8A)和白细胞分化抗原8B(CD8B)等6个基因，属于医学分子生物学领域。

背景技术

研究表明，红细胞具有免疫黏附、直接杀灭抗原异物、调节补体活性、增强NK细胞功能、结合趋化因子、参与B细胞免疫调节等多种免疫功能，在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。在红细胞表面或胞浆内存在多种免疫相关物质，其中以补体受体1型的免疫黏附功能和达菲抗原/趋化因子受体的趋化因子受体功能最受关注，白细胞分化抗原59则具有限制人补体系统溶细胞活性、介导红细胞-T细胞信号传递的作用。T细胞则是实现获得性免疫功能的主要细胞，其表面的白细胞分化抗原4和白细胞分化抗原8分别与主要组织相容性复合体II类和I类抗原结合，可增强T细胞与抗原递呈细胞或靶细胞结合的程度，在T细胞增殖和分化的信号转导中起重要作用，白细胞分化抗原4阳性的T细胞和白细胞分化抗原8阳性的T细胞分别具有免疫辅助和免疫抑制及直接杀伤功能。上述免疫分子的水平在多种疾病发生了改变，与疾病发生、发展和预后密切有关，但目前对这些分子的基因与疾病遗传易感性的关联研究未见报道。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指染色体上单个核苷酸变异而引起的DNA序列多态性，它具有密度高、遗传稳定、易于自动化分析等特点，被认为是继限制性片段长度多态性、微卫星多态性之后的第三代遗传标记，可用于基因定位、多态性分析等方面，是研究疾病遗传易感性、疾病诊断、药物筛选等的常用指标。目前已发展了20余种单核苷酸多态性检测方法，如DNA测序、限制性片段长度多态性分析、等位基因特异的寡核苷酸杂交等，但这些方法不适合大规模、自动化检测；后来发展的DNA芯片技术满足了高通量、自动化检测的需要，以DNA芯片为检测平台，结合上述反应原理，发展了多种单核苷酸多态性检测方法，但一般的单核苷酸多态性芯片存在假阳性率高、通量不灵活等缺点。Hirschhorn等(Hirschhorn JN，et al.SBE-TAGS：an array-based method for efficientsingle-nucleotide polymorphism genotyping.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(22)：12164-12169)在单碱基延伸反应单核苷酸多态性芯片的基础上，建立了基于单碱基延伸反应-标签微阵列杂交相结合的DNA芯片技术，巧妙地将等位基因特异性引物序列和能与芯片上序列特异结合的标签序列集成于单碱基延伸引物上，将单碱基延伸反应的高敏感度和高分辨率与标签微阵列的多重反应等优点融合在一起，克服了其他DNA芯片技术的缺点，达到了高通量、高精确度、高通用性、简便、经济的效果。

单碱基延伸法(single base primer extension)又称微测序法、模板介导染料终止剂掺入分析或单核苷酸多态性鉴定技术(single-nucleotide polymorphism-identification technology，SNP-IT)，是在双脱氧测序法的基础上发展出来的单核苷酸多态性检测方法。其原理是：首先设计1对PCR引物用于从基因组DNA中扩增出含有目的单核苷酸多态性位点的片段，再设计1条与待测单核苷酸多态性位点上游序列互补的延伸引物，该引物的3′端最后一个碱基与单核苷酸多态性位点上游相邻的1个碱基互补；将延伸引物与PCR产物混合，掺入标记不同荧光染料的ddNTPs进行延伸反应，由于ddNTP的特性，当延伸1个碱基，即加入的ddNTP与单核苷酸多态性位点碱基互补时，反应即终止；通过检测延伸碱基所发出的荧光类型来判断单核苷酸多态性位点的碱基类型。该方法基于测序原理，但由于只需测1个碱基，其准确性大大超过了一般测序反应，堪称单核苷酸多态性检测的黄金标准。

标签微阵列是在玻璃芯片板的板底预先合成寡核苷酸单链(标签)，与这些标签互补的带有荧光标记的寡核苷酸链能通过杂交结合上去，然后扫描检测其荧光标记。引入芯片技术有助于实现高通量、自动化检测，而采用标签微阵列使多重检测成为可能，可以利用固定在芯片上的标签容易地将多种寡核苷酸链准确地区分开来。

2005年，美国贝克曼公司基于这一原理开发了GenomeLab^TM SNPstream12-重/48-重基因分型系统，该系统采用的微阵列芯片是特殊的384孔板，孔底是平底的玻璃芯片，从广泛应用于DNA芯片的几千条寡核苷酸链中选取了几十条交叉杂交率最低、与数据库中各种基因组同源性极小、并能提供很强信号的标签，预先合成到微阵列芯片板上。384孔板的每个孔板底有16个或者52个“点”，包括12个或48个序列不同的标签和4个质控，分别可供最多12重或48重延伸反应。利用在线引物设计工具Autoprimer设计扩增含候选单核苷酸多态性位点目的片段的多重PCR引物和相应的多重延伸引物，在每条延伸引物的5′端加有与芯片上标签序列互补的序列，用于延伸产物与标签微阵列的结合，结果可由成像仪上的双色荧光读出。其分型成功率达到96.5％，准确率达到99％，只需要2ng的DNA就足够进行12重及48重的检测，通量灵活，操作简便，自动化程度高。

本发明建立并优化了多重PCR-荧光标记单碱基延伸-标签微阵列杂交基因分型技术检测人补体受体1型等6个基因标签单核苷酸多态性位点的方法，以便对其在健康人的遗传特点及与疾病易感性的关联进行研究。

发明内容

本发明的目的是建立采用多重PCR-荧光标记单碱基延伸-标签微阵列杂交基因分型技术结合GenomeLab^TM SNPstream基因分型系统同时检测人补体受体1型(CR1)、达菲抗原/趋化因子受体(DARC)、白细胞分化抗原59(CD59)、白细胞分化抗原4(CD4)、白细胞分化抗原8A(CD8A)和白细胞分化抗原8B(CD8B)等6个基因标签单核苷酸多态性位点的方法。

本发明所述方法包括以下步骤：

1.候选基因标签单核苷酸多态性位点的筛选

利用HapMap网站的Tagger程序挑选各基因的标签单核苷酸多态性位点(http://www.hapmap.org/cgi-perl/gbrowse/hapmap_B36/)：①输入基因名；②设置条件：Population(人群)：CHB(中国汉族)；Pairwise Methods(配对方法)：Tagger pairwise(Tagger配对标志法)；RSquare cut off(复相关系数临界值)：0.8；MAF cut off(最小等位基因频率临界值)：0.05；③执行搜索，即可显示该基因标签单核苷酸多态性位点及与其密切关联的单核苷酸多态性位点的登录号。

登录Pubmed网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)查找上述标签单核苷酸多态性位点的信息。根据各单核苷酸多态性位点等位基因的类型，确定拟采用的延伸试剂的类型，并据此调整不符合设计要求的单核苷酸多态性位点，主要包括：单核苷酸多态性位点前后含大量重复序列、相邻单核苷酸多态性位点在染色体上位置太近、等位基因类型不在延伸试剂检测范围内。最终确定检测的27个标签单核苷酸多态性位点见表1。

表1 27个标签单核苷酸多态性位点信息

2.单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物设计与合成

利用贝克曼公司编写的AP Editor软件编辑模板序列：在指定页面输入选定标签单核苷酸多态性位点的登录号，设置建立通用类模板(即所有单核苷酸多态性位点的等位基因类型以T/A代替)，执行操作，即可自动搜索含该位点的序列信息；同时软件自动将重复序列用字母“N”屏蔽；导出的序列文件为.txt格式。

利用贝克曼公司在线工具Autoprimer(http://www.autoprimer.com/)设计单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物，选择设计引物为48-重，导入AP Editor软件导出的序列文件，执行设计步骤，即可得到各单核苷酸多态性位点的1对PCR引物及1条延伸引物，延伸引物的5′端包含有与微阵列芯片杂交板上固定序列互补的碱基序列。采用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)及UCSC In-Silico PCR工具(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr？command＝start)对设计的PCR引物的特异性进行评价。设计好的引物委托上海生工生物工程有限公司合成，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化。

表2设计的27个单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物

3.基因组DNA样本的制备

(1)人全血基因组DNA提取

采集受试者清晨空腹静脉血2mL，入乙二胺四乙酸二钾抗凝管，混匀。采用Promega公司Wizard基因组DNA纯化试剂盒(货号A1125)提取人外周血基因组DNA，按说明书操作，具体步骤如下：①吸取900μL细胞裂解液加至1.5mL环氧树脂管中，轻摇血标本管充分混匀，取全血300μL加至含有细胞裂解液的环氧树脂管中，颠倒混和5～6次；②室温孵育10min，其间颠倒2～3次使红细胞裂解，13000～16000r/min离心40秒，尽可能移弃上清，留下白色沉淀物及约10μL残留液；剧烈震荡环氧树脂管约10～15秒，使白细胞重悬；③加入300μL细胞核裂解液至上述重悬细胞中，抽吸溶液5～6次使白细胞溶解；④加入1.5μLRNA酶，颠倒混和2～5次，37℃孵育15min，冷却至室温；⑤加入100μL蛋白沉淀液，剧烈震荡10～20秒，静置10min，其间剧烈震荡2～3次，使蛋白充分沉淀；⑥置室温中13000～16000r/min离心5min，可见褐色蛋白沉淀，将上清移至事先加好400μL异丙醇的1.5ml环氧树脂管中；⑦轻轻颠倒混和溶液直至白色丝状DNA成团状；⑧室温13000～16000r/min离心1min后轻轻倒出上清，加入500μL 70％乙醇，轻轻颠倒几次以洗涤DNA及环氧树脂管管壁，13000～16000r/min离心1min；⑨轻轻倒出上清，环氧树脂管倒置于吸水纸上，室温风干10～15min；⑩加100μL DNA水化液4℃过夜后，将DNA溶液置超低温冰箱保存。

(2)DNA纯度及浓度测定

①将DU800紫外/可见光分光光度计调至DNA测试状态，仪器稳定15min；②先用空气调零，然后吸取100μL灭菌双蒸馏水至微量比色杯中，作为空白对照，再次调零；③在0.5mL环氧树脂管中加入96μL灭菌双蒸馏水，吸取DNA溶液4μL加入其中，混匀后加至微量比色杯，上机测试，记录260nm吸光度/280nm吸光度比值以及浓度值。

4.单重PCR验证单核苷酸多态性位点扩增引物质量

(1)按下列反应体系分别配制各单重PCR混合物，加入96孔板中。

引物对(每种引物浓度为10μmol/L)         0.5μL

dNTPs(每种成分浓度为2.5mmol/L)          2.0μL

10×PCR缓冲液II                         2.5μL

MgCl₂(25mmol/L)                         5.0μL

Amplitaq Gold DNA聚合酶(5单位/μL)      0.2μL

基因组DNA                               0.5μL

双蒸馏水                                14.3μL

                                                       

合计                                    25.0μL

(2)用封板膜密封96孔板，1000r/min离心10秒。

(3)在基因扩增仪上运行如下程序：保持(HOLD)：94℃1min→40个循环：94℃30秒，55℃30秒，72℃1min→HOLD：4℃10min。

(4)1.8％琼脂糖凝胶电泳：称取0.9g琼脂糖加入锥形瓶，量取50mL 1×Tris碱-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液，摇匀，放入微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；取出后冷却至约70℃，加入2μL浓度为10μg/μL的溴化乙锭溶液，混匀，将琼脂糖缓缓倒入制胶模具中，插入梳子，待胶凝固；在对应孔中加入样本和DL2000 DNA分子标准，将胶置于加有1×Tris碱-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液的电泳槽中，以80伏电压进行电泳；电泳结束后，采用SX-300凝胶图像分析系统扫描凝胶，根据DNA分子标准判断扩增产物中是否含有与目标片段大小一致的片段。

5.单核苷酸多态性位点的检测

(1)基因组DNA样品的稀释

根据测定的DNA浓度，在96孔板中加入适量灭菌双蒸馏水，将待测DNA样品全部稀释到10ng/μL。

(2)引物稀释

①PCR引物稀释(共27×2个)：

将合成好的引物稀释到240μmol/L；从54管稀释好的PCR引物中各取5μL加入到一个新的环氧树脂管中，并补加210μL灭菌双蒸馏水，作为新的多重PCR引物池；PCR引物池中共有480μL试剂，各引物终浓度为2.5μmol/L。

②延伸引物稀释(共27个)：

将合成好的引物稀释到240μmol/L；从27管稀释好的延伸引物中各取5μL加入到一个新的环氧树脂管中，并补加105μL灭菌双蒸馏水作为新的延伸引物池；延伸引物池中共有240μL试剂，各引物终浓度为5μmol/L。

(3)27-重PCR

①配制多重反应混合物，每个96孔板(96个样品)所需试剂组成如下：

引物池(各引物浓度为2.5μmol/L)          10.56μL

dNTPs(各成分浓度为2.5mmol/L)            18.77μL

10×PCR缓冲液II                         52.8μL

MgCl₂(25mmol/L)                         105.6μL

Amplitaq Gold DNA聚合酶(5单位/μL)      10.56μL

双蒸馏水                                118.51μL

                                                          

合计                                    316.8μL

②向96孔板每孔内加入3μL配好的PCR混合物，再将稀释好的基因组DNA加入到对应的孔内，每孔加2μL。

③用封板膜密封96孔板，1000r/min离心10秒。

④在基因扩增仪上运行如下程序：HOLD：94℃ 1min→40个循环：94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1min→HOLD：4℃ 10min。

(4)PCR产物纯化

①按照下表中的体系，配制纯化试剂：

核酸外切酶I(20单位/μL)     10.56μL

碱性磷酸酶(1单位/μL)       105.13μL

10×碱性磷酸酶缓冲液        31.68μL

双蒸馏水                    169.43μL

                                           

合计                        316.8μL

②PCR结束后，取出96孔板，1000r/min离心10秒，每孔加入3μL新配制的纯化试剂。

③取新的封板膜密封96孔板，1000r/min离心10秒。

④在基因扩增仪上运行如下程序：37℃30min→96℃10min→4℃10min。纯化好的PCR产物可以在-20℃条件下存放几天。

(5)引物延伸反应

①提前将微阵列芯片延伸稀释缓冲液和纯化好的PCR产物解冻。

②按下表所示体系配制微阵列芯片引物延伸反应混合物：

延伸稀释缓冲液                   397.17μL

延伸引物混合物                   3.17μL

20×延伸试剂混合物(T/C，A/G)     各10.56μL

双蒸馏水                         315.53μL

DNA聚合酶                        2.21μL

                                                

合计                             739.2μL

③将PCR板1000r/min离心10秒，向每个孔中加入7μL配制好的引物延伸反应混合物。

④重新用封板膜封上PCR板，1000r/min离心10秒。

⑤在基因扩增仪上，运行如下程序：HOLD：96℃3min→46个循环：94℃20秒，40℃11秒→HOLD：4℃10min。

(6)准备微阵列芯片杂交板并进行杂交反应

①按照下表所示体系配制微阵列芯片杂交板洗涤液：

20×洗涤缓冲液I         300μL

双蒸馏水                5700μL

                                      

合计                    6000μL

②取一块384孔微阵列芯片杂交板，用封板膜将本次不使用的孔封闭。向杂交板的每个反应孔中加18μL 1×微阵列芯片板洗涤缓冲液I。

③将微阵列芯片杂交板翻过来放在无尘纸上，一起放在离心机的托盘内2000r/min离心2min，使杂交板上每个孔中的清洗液全部脱离。

④重复步骤②和③，共清洗3次。

⑤根据下表所示体系配制杂交溶液：

杂交缓冲液              850μL

杂交试剂                50μL

                                     

合计                    900μL

⑥向96孔板每孔中加入8μL上述杂交溶液，在离心机上稍稍离心使其混合均匀。吸取18μL加入到微阵列芯片杂交板上对应的孔内。

⑦将加入混合液的微阵列芯片杂交板放入一个密封的湿盒中，置于培养箱中，42℃孵育2～2.5小时。

(7)杂交反应后清洗杂交板

①按照下表所示体系配制杂交板清洗液：

64×洗涤缓冲液II            100μL

双蒸馏水                    6300μL

                                         

合计                        6400μL

②杂交反应完成后，将杂交板扣于无尘吸水纸上，2000r/min离心10秒，甩掉反应液。

③每个反应孔加入18μL 1×洗涤缓冲液II，再次清洗微阵列芯片杂交板，共清洗3次。

④清洗完毕后，用无尘纸蘸取少量无水乙醇轻轻擦拭杂交板背面玻片，使其清晰无痕迹。

(8)扫描杂交板

清洗好的杂交板马上放到GenomeLab^TM SNPstream基因分型系统扫描仪上，运行RunManager程序，进行扫描。扫描后杂交板避光保存。

6.数据分析

(1)编辑样本及信息

运行PlateExplorer程序，编辑样本信息并生成.txt文件。导入从Autoprimer软件中导出的单核苷酸多态性位点引物文件，上传样本信息文件，所有数据保存至数据库中。

(2)读取扫描信息

运行SNPAdmin程序，将扫描的杂交板信息转化为图像信息，并上传数据，获取基因型。

(3)分型结果调整与分析

运行GetGenos程序，通过QC Review判断是否存在偏移点，如存在则需调整，并保存至数据库，然后重新获取基因分型信息。在QC Review模式下分析数据，在质控点分型结果合格的情况下，去除分型成功率＜90％的单核苷酸多态性位点，通过Report程序导出分型成功率＞90％的各单核苷酸多态性位点基因分型报告。

7.单核苷酸多态性位点检测稳定性评价

按上述方法对部分DNA样本单核苷酸多态性位点重复测定2次，计算单一单核苷酸多态性位点基因分型结果符合率。

附图说明

图1为91例样本检测后质控点分型结果，其中a、b、c、d图分别为基因型XX、YY、XY和阴性质控点；

图2为91例样品检测后3个单核苷酸多态性位点的分型结果，其中a、b、c图分别为单核苷酸多态性位点rs3213427、rs863002、rs3020729，可见91例样本根据3个单核苷酸多态性位点分别被清晰地归类到XX、XY，YY、XY，XX、XY、YY基因型。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用的单碱基延伸法使检测的敏感度和准确性大大超过了一般测序反应；

(2)本发明采用的标签微阵列杂交技术可以实现高通量、自动化和多重检测；

(3)本发明所述方法操作简单、结果判断快速准确、检测结果稳定性高、单次检测平均成本低廉。

本发明所应用的试剂如下：Wizard基因组DNA纯化试剂盒、琼脂糖、碱性磷酸酶(1单位/μL)、10×碱性磷酸酶缓冲液为美国Promega公司产品，dNTPs(每种成分浓度为2.5mmol/L)、DL2000DNA分子标准为日本Takara公司产品，10×PCR缓冲液II、MgCl₂(25mmol/L)、Amplitaq Gold DNA聚合酶(5单位/μL)为瑞士Roche公司产品，Tris碱-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液、溴化乙锭溶液(10μg/μL)为北京天根公司产品，核酸外切酶I(20单位/μL)为美国Biolabs公司产品，延伸稀释缓冲液、20×延伸试剂混合物(T/C，A/G)、DNA聚合酶、20×洗涤缓冲液I、杂交缓冲液、杂交试剂、64×洗涤缓冲液II、微阵列芯片杂交板为美国Beckman Coulter公司产品(除已标明来源外)。

本发明所应用的主要仪器如下：

DU800紫外/可见光分光光度计、GenomeLab^TM SNPstream基因分型系统为美国BeckmanCoulter公司产品，基因扩增仪为德国Eppendorf公司产品，EPS-4105数字式双恒电泳仪为北京军科院仪器厂产品，SX-300凝胶图像分析系统为上海小源科技公司产品(除已标明来源外)。

                                序列表

<110>中国人民解放军总医院

<120>一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方法

<160>81

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4844600-R-TC-U41的上游扩增引物。

<400>1

AATAACCAGG GCGGCATT  18

<210>2

<211>18

<212>DNA    

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4844600-R-TC-U41的下游扩增引物。

<400>2

AATGCCCCAG AATGGCTT  18

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4844600-R-TC-U41的上游延伸引物。

<400>3

TACCTATGAC CAGCAAGCAC GATATGTCCC AATGGGAAAC TCAAA

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2255301-TC-U39的上游扩增引物。

<400>4

GAAAGGCAAA GGTGGAGG  18

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2255301-TC-U39的下游扩增引物。

<400>5

TGCTGGGAGG AGCGCTAA  18

<210>6

<211>45

<212>DNA    

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2255301-TC-U39的上游延伸引物。

<400>6

CACGACAAGA CAACAGATAC GGGGTAGAGG GGGACAGCGG CGACA  45

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11585-TC-U40的上游扩增引物。

<400>7

TACCTTAATT TCTAGGTGGG TGC  23

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11585-TC-U40的下游扩增引物。

<400>8

CCTCCTCTCC CAGAGGCT  18

<210>9

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11585-TC-U40的上游延伸引物。

<400>9

AAGTACCACG TCAACGTCAC TTCATTGTAG GTAAGGACAT TTTCT  45

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs831629-TC-U34的上游扩增引物。

<400>10

ATTTCTTAGT TCTGCTATGG ATGC  24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs831629-TC-U34的下游扩增引物。

<400>11

TAGTGATAGC ATCAGGTGAG AAGA  24

<210>12

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs831629-TC-U34的上游延伸引物。

<400>12

CACTAGTCAT AACGCAGCCT TACTTAGGCA AGTTCAAAAC CTCCC  45

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3020729-TC-U38的上游扩增引物。

<400>13

TAAAATGAAG TGGTGAGCTT AACC  24

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3020729-TC-U38的下游扩增引物。

<400>14

GGCCCCTCTG CAATGCAA  18

<210>15

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3020729-TC-U38的上游延伸引物。

<400>15

ACGTAAGACC ACTCAAGACC AAAGAAAATC TCTGTGAAAC CCCTA  45

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1075835-TC-U37的上游扩增引物。

<400>16

TAGACTGTCA TCTCTGTCCT CAAG  24

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1075835-TC-U37的下游扩增引物。

<400>17

TACTCTGAAG TCCCACAGCA C  21

<210>18

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1075835-TC-U37的上游延伸引物。

<400>18

ACCGCACTAA GCAATGTATC GGAGAGTTGA GAAACCAAAT CACTA  45

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs13024609-R-TC-U35的上游扩增引物。

<400>19

TGGTTCTGAG GCTACAGCA  19

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs13024609-R-TC-U35的下游扩增引物。

<400>20

ACTTGAGTTA AGATCACACT GGG  23

<210>21

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs13024609-R-TC-U35的上游延伸引物。

<400>21

CAGAATAGCC ACGCCTAGAT ACCGAACTCG GCCTGTGCCC CAACT  45

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs863002-TC-U36的上游扩增引物。

<400>22

CTCAGTCTTT ATATCTCTT CCTTTTCC  28

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs863002-TC-U36的下游扩增引物。

<400>23

ATGGAACTGA CTCAAAGGCA  20

<210>24

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs863002-TC-U36的下游延伸引物。

<400>24

CACCGCTATC AACAGACTTG CTAGGAGGCT AGCATAGGAA GGAGA  45

<210>25

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3213426-R-TC-U33的上游扩增引物。

<400>25

AACTTGTAGA ATTACAACT GGCAG  25

<210>26

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3213426-R-TC-U33的下游扩增引物。

<400>26

TCCTCTGTGG TCCCAGGG  18

<210>27

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3213426-R-TC-U33的上游延伸引物。

<400>27

CGCAGAAGCA ACTCACTTCT GCCCAGGACC ACAACCCACC TCACT  45

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3213427-TC-U31的上游扩增引物。

<400>28

TTGAGTGTTG CTCTCTAGTT TCC  23

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3213427-TC-U31的下游扩增引物。

<400>29

CCTGGGATCC AAATGAGC  18

<210>30

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3213427-TC-U31的上游延伸引物。

<400>30

CAGAACATCC TCAGAAGCAA CCTTCAAGCC TAGCCCTTCT CTCAT  45

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1055141-TC-U32的上游扩增引物。

<400>31

CAGAAAAATT TGACCTGTGA GG  22

<210>32

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1055141-TC-U32的下游扩增引物。

<400>32

TTCTCCCGCT TCGAGACC  18

<210>33

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1055141-TC-U32的上游延伸引物。

<400>33

CAAGCAACGA CCTACTACAA CCACCTCCCC TAAGCTGATG CTGAG  45

<210>34

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1075838-TC-U29的上游扩增引物。

<400>34

CCACTTTATA TCCTAGGCCT GG  22

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1075838-TC-U29的下游扩增引物。

<400>35

TAACTGGGGA CCAGATGACA  20

<210>36

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1075838-TC-U29的上游延伸引物。

<400>36

AATAAGCTCA CCACCGTCAA TCCTTTGAGG TGCTATCTTG GTGCC  45

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1546727-R-TC-U23的上游扩增引物。

<400>37

CTCTAGAGCT GGCCTGT℃TA TTT  23

<210>38

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1546727-R-TC-U23的下游扩增引物。

<400>38

TAAACCTAGG GTTCTCATTT TCC  23

<210>39

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1546727-R-TC-U23的下游延伸引物。

<400>39

AGTAGCCTAA CAGCACTCGA AGGTTAAGTA ACTTGCCTGA GGGTC  45

<210>40

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs13400210-TC-U25的上游扩增引物。

<400>40

ATAAATAAAA AAGAGAAGCA CAATGC  26

<210>41

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs13400210-TC-U25的下游扩增引物。

<400>41

AACCACCCTG GAAGGTAGG  19

<210>42

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs13400210-TC-U25的上游延伸引物。

<400>42

CCATAACAAC TTACCAGCCA ATCTCTGACT CTGGCCCGTC TCTTC  45

<210>43

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11064410-R-TC-U21的上游扩增引物。

<400>43

TCTCCTCAGT TCTAGGCACA C  21

<210>44

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11064410-R-TC-U21的下游扩增引物。

<400>44

TTTTCTTTTG AAGAGAAGCA AGG  23

<210>45

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11064410-R-TC-U21的上游延伸引物。

<400>45

GATCCATCAA CAGACATCAC TATCCTGCCA TCACCCCAAA CGCAA  45

<210>46

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs17048010-TC-U19的上游扩增引物。

<400>46

AAATTTCTGC CGTAATTCTC TACC  24

<210>47

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs17048010-TC-U19的下游扩增引物。

<400>47

TATGGAGTTT CTGTTATAAC TGCC  24

<210>48

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs17048010-TC-U19的上游延伸引物。

<400>48

CCACTCAACT CCACGAATAC TTCAAGGCTG CTCCTTGTTC TAATA  45

<210>49

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4832054-R-TC-U20的上游扩增引物。

<400>49

AAAAGAAGTT TCTCTCTCCT CATG  24

<210>50

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4832054-R-TC-U20的下游扩增引物。

<400>50

ATTTGTCATG TAATCCACAT GTTC  24

<210>51

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs4832054-R-TC-U20的下游延伸引物。

<400>51

ACAACTACCG ACGACAAGAC TGGAGTCTAT TCATGCATCA CTTCA  45

<210>52

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3818361-TC-U18的上游扩增引物。

<400>52

AAAGGACAGT TCCAGAGCAC T  21

<210>53

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3818361-TC-U18的下游扩增引物。

<400>53

TTAGTGAGAT GTGGCTACTG AACTAC  26

<210>54

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs3818361-TC-U18的上游延伸引物。

<400>54

AACATCCACG CAACTCATAC GTTAGATATG GGGCAATTTC CTTTG  45

<210>55

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11064404-TC-U14的上游扩增引物。

<400>55

TACAAAATTG GAACACCACC  20

<210>56

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11064404-TC-U14的下游扩增引物。

<400>56

GCTTTGCCAT TTTAGCCTC  19

<210>57

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11064404-TC-U14的上游延伸引物。

<400>57

AACATACAGA CGCACTCCTC AATGCTGATG AGGATGTGGA GAAAC  45

<210>58

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1738548-TC-U12的上游扩增引物。

<400>58

AATTACTTGT CTGAAATGGC AGG  23

<210>59

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1738548-TC-U12的下游扩增引物。

<400>59

AAGAAGCAGA AAAAAGTCAT GATG  24

<210>60

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs1738548-TC-U12的上游延伸引物。

<400>60

CCAGATCCTC ACCATGTAAG ACCTCAATCT GTAGTACATA TCAAG  45

<210>61

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11118167-TC-U10的上游扩增引物。

<400>61

ATTTAATTGA GTCAATACTG GTTATGTG  28

<210>62

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11118167-TC-U10的下游扩增引物。

<400>62

AAAAGATAAG GCATGAGAAA TGAA  24

<210>63

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs11118167-TC-U10的上游延伸引物。

<400>63

TCCAGAATAG ACAACAGACG CCAATATGTG AATATTATTA TCTTA  45

<210>64

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2231454-R-TC-U6的上游扩增引物。

<400>64

TATACTTACT ACTGTGAAGT AGGTCTCAAC T  31

<210>65

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2231454-R-TC-U6的下游扩增引物。

<400>65

TCCCTAAAGT TTGAGAACCA CT  22

<210>66

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs2231454-R-TC-U6的上游延伸引物。

<400>66

ACAACTCACG CAAGTACCAT CACCAACTGG TGCTAAAGAC TAGGA  45

<210>67

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs12477946-R-TC-U7的上游扩增引物。

<400>67

ATATTTATTC TATCTGGAGT ATACATTTGT GA  32

<210>68

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs12477946-R-TC-U7的下游扩增引物。

<400>68

AAGGATTCGA TCATTAGTGC TG  22

<210>69

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs12477946-R-TC-U7的上游延伸引物。

<400>69

TACAAGCACG CACTAGACAT GAGATAGAGT TCAAGTTTTA CGTTT  45

<210>70

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs6722860-TC-U5的上游扩增引物。

<400>70

TTTGTCTTAC ATCCAAGTAC TGAAGT  26

<210>71

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs6722860-TC-U5的下游扩增引物。

<400>71

ATCTGAGAAT TCAGAAAGCA GATC  24

<210>72

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs6722860-TC-U5的上游延伸引物。

<400>72

CAACAAGTAA TCCGCAGACT CCAGGCTGCT ACAGGGCTTG AAGGT  45

<210>73

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs12576440-R-TC-U4的上游扩增引物。

<400>73

TTTTAGTCTA GGGAGTAGTT TTACCAA  27

<210>74

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs12576440-R-TC-U4的下游扩增引物。

<400>74

CCCAAATATT CTATAATTAA CCAAGTATTA C  31

<210>75

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs12576440-R-TC-U4的上游延伸引物。

<400>75

ATCTAACGCA CCTACGACCT GAACATTGTC ATGTGTGAAT TTTCC  45

<210>76

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs10768024-TC-U3的上游扩增引物。

<400>76

AGATTAAGGA GATTATTTTG GATTATTC  28

<210>77

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs10768024-TC-U3的下游扩增引物。

<400>77

TCGGTCATGA GTCTTTGACA  20

<210>78

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs10768024-TC-U3的上游延伸引物。

<400>78

CAGCCATCCA TTCACTATCT GGGCCCAATG TAATCCCAGG GGTCA  45

<210>79

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs9429945-TC-U2的上游扩增引物。

<400>79

AATTTCCACA AACTTAGTGG CTT  23

<210>80

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs9429945-TC-U2的下游扩增引物。

<400>80

AGCCTCCACA AGGAACACA  19

<210>81

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：本发明设计用于扩增rs9429945-TC-U2的上游延伸引物。

<400>81

CTCAGACTAC GAATCCACGT TGTATTCTCT TCCAGTTCTG GAGGC  45