水稻纹枯病生防菌枯草芽孢杆菌WJ-1及菌剂与应用

摘要

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种用于水稻纹枯病生物防治的细菌的分离鉴定、含有该菌的菌剂或其发酵产物及对水稻纹枯病的防治。分离筛选得到一株用于水稻纹枯病的防治的生防菌-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WJ-1菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2010069。本发明还公开了所述生防菌剂的制备方法及枯草芽孢杆菌WJ-1三种菌剂在防治水稻纹枯病中的应用。本发明的生防菌剂对水稻纹枯病等植物真菌病害具有良好的生防效果。

说明书

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种用于水稻纹枯病生物防治的细菌的分离鉴定、含有该菌的菌剂或其发酵产物及对水稻纹枯病的防治。

背景技术

水稻纹枯病在世界各稻区均有发生，在我国主要在华南和长江流域的稻区重发生较为严重，二十世纪80年代在水稻种植区大面积暴发，发展成为我国水稻上的一种主要病害；二十世纪90年代以后，该病的发生为害更为猖撅，南方稻区的发病面积比例普遍超过50％以上，成为我国水稻生产的主要障碍，发病面积以及危害损失居水稻病害首位(廖皓年等，1997；孟庆忠等，2001)。根据全国农业技术推广服务中心的统计，2005年水稻纹枯病发生面积达2.48亿亩，稻米产量损失达到109万吨，占我国主要农作物由于病害而损失量的7.6％。

水稻纹枯病由半知菌亚门、丝孢纲、无孢目、丝核菌属的茄丝核菌(Rhizoctonia solaniKühn)引致，是一种顽固的土传病害。由于缺乏抗水稻纹枯菌的抗病品种，目前应用化学杀菌剂仍然是防治水稻纹枯病的有效手段。井冈霉素和艾米是农业生产上的主要农药品种，井冈霉素对环境污染较小，但是由于近30多年的持续使用，在田间已经发现了抗井冈霉素的野生菌株(胡秀荣等，2006；许文耀等，2007)，艾米的大量施用对环境造成了严重的污染，同时也加大了纹枯菌抗药突变的几率。因此寻找新的、安全有效的措施来防治水稻纹枯病十分必要。

利用生防菌防治植物病害在国内外均有相关报道，迄今美国已经有四种枯草芽孢杆菌的生防制剂拿到了生产许可证；日本东京技术研究所的Bacillus subtilis RB14和NB22对茄科植物的病害有很好的防治效果；经检索，申请者在现有的专利和非专利文献中检索到一些关于枯草芽孢杆菌的文献报道和专利。例如专利申请号为03121110.0公开了“一种防治果蔬采后软腐病的生物防治拮抗菌(BAY-1)及技术使用方法”，利用枯草芽孢杆菌H728防治番茄灰霉病。专利申请号为98124889.6公开了“一种枯草芽孢杆菌菌株、制法、制剂及应用”，利用源于苹果果实表面的枯草芽孢杆菌XM16，防治苹果霉心病和枝干病害。专利申请号为200610200365.4公开了“一株枯草芽孢杆菌菌株及其应用”，利用枯草芽孢杆菌M22BH3进行桃炭疽病菌、梨黑斑病菌、苹果褐腐病菌等植物病原真菌的生物防治。申请号为200410022543公开了一种利用枯草芽孢杆菌Xi-55菌株防治稻瘟病。在所有已申请的专利文献中均没有涉及本发明主题的专利文献报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，分离筛选一株对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病具有显著生物防治效果的细菌菌株；将其制备为生防菌剂，用来防治大田水稻纹枯病。以此消弱化学药剂对环境的破坏以及人类身体健康的影响，同时延缓水稻纹枯菌抗药性菌株的出现，以实现农业、人类和环境的和谐、可持续发展。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明从湖北省武汉市武昌狮子山地区华中农业大学校园的菜园土中分离筛选获得一株适用于水稻纹枯病防治的生防细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WJ-1，该菌株于2010年3月30日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2010069。

申请人利用发酵方法制备了一种对水稻纹枯病具有防治作用的微生物菌剂，其步骤如下：

(1)先将保藏号为CCTCC NO：M2010069的枯草芽孢杆菌WJ-1的菌株在PDA平板上于33℃活化1d，再将单菌落接种到含有200ml PDB的三角瓶中，于180r/min下，33℃振荡培养48h，得到浓度为1.5×10¹⁰cfu/ml的枯草芽孢杆菌WJ-1的发酵菌液A；

(2)将所述的发酵菌液A于4℃，6,000r/min下离心20min，取离心后的上清液，用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤所述的上清液，得到不含枯草芽孢杆菌WJ-1的发酵液B，将获得的沉淀菌体备用；

(3)将沉淀菌体用无菌水洗涤3次，再用无菌水悬浮，使枯草芽孢杆菌WJ-1的浓度达到1.5×10¹⁰cfu/ml，得菌液C；

(4)向所述发酵菌液A或发酵液B或菌液C中分别加入吐温-20，使发酵菌液A或发酵液B或菌液C中的吐温-20的终浓度为0.025％，即得到菌体浓度为1.5×10¹⁰cfu/ml的枯草芽孢杆菌WJ-1发酵菌液A；不含枯草芽孢杆菌WJ-1的发酵液B；菌体浓度为1.5×10¹⁰cfu/ml的含枯草芽孢杆菌WJ-1的菌液C；

其中

所述的PDA培养基的组分及配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min；

所述的PDB培养基的组分及配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

申请人应用上述微生物菌剂对离体、盆栽和田间栽培条件下的水稻纹枯病进行了生物防治试验，达到了预期的效果，从而完成了本发明的任务。

与已有技术相比，本发明的积极效果是：

1.本发明枯草芽孢杆菌WJ-1对水稻纹枯病有明显的防治作用，实施例的研究表明，本发明的生防菌剂在盆栽试验中，对水稻纹枯病的防效可达到96.17％，在田间试验中，对水稻纹枯病的防效与商品药剂艾米和井冈霉素的防效相当；

2.本发明所提供的枯草芽孢杆菌WJ-1菌剂及使用方法，生产及使用均十分简单，具有生物农药对人畜安全的优点。

更详细的技术方案见《具体实施方式》的内容。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是枯草芽孢杆菌WJ-1菌16S rDNA基因序列。

图1.是本发明分离筛选的枯草芽孢杆菌WJ-1对水稻纹枯病菌(A)、油菜菌核病菌(B)、大豆灰霉病菌(C)、棉花枯萎病菌(D)、小麦赤霉病菌(E)和烟草赤星病菌(F)等重要植物病原真菌的拮抗作用。

图2.是本发明的枯草芽孢杆菌WJ-1不同浓度的发酵液B对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制作用。图中：

A：PDA培养基添加15％的发酵液B；B：PDA培养基添加13％的发酵液B；

C：PDA培养基添加9％的发酵液B；C：PDA培养基添加5％的发酵液B；

E：PDA培养基添加1％的发酵液B；F：PDA培养基对照；

图3.是本发明分离筛选的枯草芽孢杆菌WJ-1发酵液B对水稻纹枯病菌菌丝的破坏作用。

图4.是枯草芽孢杆菌WJ-1菌剂对水稻纹枯病的离体试验防治效果。图中：

A先喷施菌剂，12h后再接种水稻纹枯病菌WH-1菌株；B先喷施菌剂，24h后再接种水稻纹枯病菌WH-1菌株；

C先接种水稻纹枯病菌WH-1菌株，12h后再喷施菌剂；C先接种水稻纹枯病菌WH-1菌株，24h后再喷施菌剂；

图5.是本发明分离筛选的枯草芽孢杆菌WJ-1菌剂对水稻纹枯病的活体盆栽试验防治效果。

图中：A为清水对照；B为发酵菌液A(菌体浓度为1.5×10¹⁰cfu/ml)；C为菌液C(菌体浓度为1.5×10¹⁰cfu/ml)；D为发酵液B；E为井冈霉素；F为艾米。

具体实施方式

在下面的实施例中，申请人研究了枯草芽孢杆菌WJ-1菌株的形态学特征、生理生化特性和遗传学特性，验证了WJ-1菌株对水稻纹枯病菌(Rizoctonia solani)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、大豆灰霉病菌(Botrytis cinerea)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)和烟草赤星病菌(Alternaria alternata)等重要植物病原真菌的拮抗作用，对该菌株进行发酵培养，同时将制备的生防菌剂进行水稻纹枯病的离体、盆栽和田间防治试验，确定了其对水稻纹枯病的防治作用。

实施例1：枯草芽孢杆菌WJ-1的分离鉴定及其菌学特征研究

1、枯草芽孢杆菌WJ-1的分离鉴定

本发明的一株适用于水稻纹枯病防治的生防细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WJ-1分离筛选于湖北省武汉市武昌狮子山地区华中农业大学校园的菜园土。其分离和鉴定方法按照报道的方法(周德庆主编，《微生物学实验技术手册》，上海科学技术出版社，1986版)进行，为常规微生物分离鉴定方法。该菌株已于2010年3月30日送交用于专利程序保藏的位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCCNO：M2010069。

2、枯草芽孢杆菌WJ-1的菌学特征

(1)枯草芽孢杆菌WJ-1的形态学

枯草芽孢杆菌WJ-1在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养基(配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min)上前期为白色，菌落不透明，最后逐渐变成米黄色。菌体杆状，大小为0.7-0.8×2-3μm，周生鞭毛。菌落边缘不光滑。

该菌株的保存按周德庆主编，《微生物学实验技术手册》，上海科学技术出版社，1986版介绍的方法操作。

(2)枯草芽孢杆菌WJ-1菌株的遗传学特性

将WJ-1菌株于33℃180r/min培养过夜，取1ul作为模板，对16S rDNA片段进行PCR扩增。引物涉及和扩增条件参照细菌16S rDNA的通用引物和标准方法(见：Weisburg et al.，1991)，所述的引物的DNA序列如下：

正向引物：5′ACG GTT ACC TTG TTA CGA CT 3′

反向引物：5′CCT GAG CCA GGA TCA AAC TCT 3′

序列分析表明16S rDNA扩增片段长度为1513bp，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST分析，可知其与Bacillus subtilis C7-2菌株的相应序列的同源性为99％。

(3)枯草芽孢杆菌WJ-1菌株生理生化特性

WJ-1菌株适宜的生长温度为33℃，适宜的生长环境pH值为7.0。能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、淀粉、L-树胶醛糖和肌醇等碳源；能利用酵母膏、牛肉膏和酵母粉等氮源；明胶液化、淀粉水解等生化试验鉴定为阳性，革兰氏染色为阳性，VP测定为阳性，过氧化氢酶测定为阳性，葡萄糖氧化发酵测定为阳性，硝酸盐还原反应为阳性，丙二酸盐反应为阳性，柠檬酸盐的利用为阳性，NaCl浓度超过10％时不能生长，吲哚产生为阴性、氧化酶测定为阴性、甲基红(MR)测定为阴性、苯丙氨酸脱氨酶反应为为阴性。

(4)枯草芽孢杆菌WJ-1的其他特征：WJ-1菌株对水稻纹枯病菌(Rizoctonia solani)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、大豆灰霉病菌(Botrytis cinerea)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、小麦赤霉病菌(Gibberellazeae)和烟草赤星病菌(Alternaria alternata)等重要植物病原真菌具有强烈的抑制作用。对水稻纹枯病菌菌丝有明显的破坏作用，其产生的发酵物质能使纹枯菌菌丝畸形、膨大和内部物质渗出，见图1、图2和图3。

实施例2：枯草芽孢杆菌WJ-1菌剂的制备

(1)WJ-1菌株的活化培养：先将保藏编号为CCTCC NO：M2010069的WJ-1菌株在PDA培养基(配方如实施例1所述)平板33℃活化1d。

(2)WJ-1菌株的液体培养：将步骤1制备的单菌落接种到含有200ml PDB(配方同PDA，只是不添加琼脂)的500ml三角瓶中，180r/min，33℃振荡培养48h，即为发酵菌液A，其中枯草芽胞杆菌WJ-1浓度为1.5×10¹⁰cfu/ml。

(3)WJ-1菌剂的制备：在4℃条件下，将步骤1制备的发酵液6,000r/min离心20min，取离心上清液，用常用的细菌过滤器(孔径0.22μm))过滤上清液，得到无菌的发酵滤液(简称发酵液B)。将沉淀菌体用无菌水洗涤3次，再用无菌水悬浮，振荡摇匀，使其浓度达到1.5×10¹⁰cfu/ml(简称菌液C)。向发酵菌液A或发酵液B、或菌液C分别加入吐温(Tween)-20，使它们各自的Tween-20的终浓度为0.025％，即得到菌体浓度为1.5×10¹⁰cfu/ml的含枯草芽孢杆菌WJ-1的发酵菌液A；不含枯草芽孢杆菌WJ-1的发酵液B；菌体浓度为1.5×10¹⁰cfu/ml的含枯草芽孢杆菌WJ-1的菌液C。

实施例3：枯草芽孢杆菌WJ-1菌剂防治水稻纹枯病的离体和室内活体试验

(1)室内离体接种防治试验：

在PDA培养基平板上28℃条件下活化本发明的水稻纹枯病菌WH-1菌株(方法参照Xie etal.，2008报道的方法)。剪取水稻苗期(5叶期)叶片7.5cm，放置在无菌的玻璃培养皿(直径9cm)中，培养皿中放入吸水纸保湿，每皿3个叶片。设置处理包括：

①先喷施清水、发酵菌液A、发酵液B和菌液C，直至水稻叶片表面有一层液膜，12h后将活化的5mm水稻纹枯菌(WH-1)菌块接到水稻叶片上，距离一段约2cm；

②先喷施清水、发酵菌液A、发酵液B和菌液C，直至水稻叶片表面有一层液膜，24h将活化的5mm水稻纹枯菌(WH-1)菌块接到水稻叶片上，距离一段约2cm；

③先将5mm水稻纹枯菌(WH-1)菌块接到水稻叶片一端2cm处，12h后喷施清水、发酵菌液A、发酵液B和菌液C，直至水稻叶片表面有一层液膜；

④先将5mm水稻纹枯菌(WH-1)菌块接到水稻叶片一端2cm处，24h后喷施清水、发酵菌液A、发酵液B和菌液C，直至水稻叶片表面有一层液膜；

每个处理设5个重复，保湿48h后，根据以下水稻纹枯病的分级标准调查各个处理水稻纹枯病的病情。

水稻纹枯病的分级标准如下：

0级：叶片健康

1级：1％-25％叶片发病

2级：26％-50％叶片发病

3级：51％-75％叶片发病

4级：76％以上叶片黄化，溃烂

(2)室内活体接种防治实验：

把水稻(9311)播种于塑料盆(40cm×30cm)中，然后将苗期水稻移栽到塑料盆中，每盆中移栽12(3行×4列)株。在水稻孕稻期，将大小均一的纹枯菌WH-1菌株的菌核接种到水稻的茎基部，然后用吸水纸包住菌核保湿。18h后，分别喷施发酵菌液A、发酵液B、菌液C、井冈霉素(浙江省桐庐正中生化贸易有限公司生产，20％可溶性粉剂)和艾米(湖北省信风作物保护有限公司生产，300g/L乳油)和无菌水，至水稻叶表面形成均匀的水膜。每个处理设置12株苗，共4个重复。然后将水稻上保湿培养一周，1个月后根据以下水稻纹枯病的分级标准调查各个处理水稻纹枯病的病情。

水稻纹枯病的分级标准：

0级：全株无病；

1级：第四叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一叶片)；

3级：第三叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一叶片)；

5级：第二叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一叶片)；

7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一叶片)；

9级：全株发病，提早枯死。

根据步骤(1)和步骤(2)中的病情，计算病情指数和枯草芽孢杆菌WJ-1对水稻纹枯病的相对防效。

病情指数＝∑[病级数×该级病株数]/(调查总数×最高病级数)×100

相对防效(％)＝(无菌水处理病情指数-处理病情指数)/无菌水处理病情指数×100％

试验结果见表1、图4和图5，WJ-1三种菌剂无论是离体还是室内活体接种防治水稻纹枯病，均能获得理想的防治效果，其防治效果与传统的商业制剂“井冈霉素”无显著差异，表明本发明的生防菌菌剂对水稻纹枯病既有预防效果，也有治疗效果。

表1 WJ-1菌剂对水稻纹枯病的离体防治效果

表2 WJ-1菌剂对水稻纹枯病室内活体接种防治效果

实施例4：本发明的枯草芽孢杆菌WJ-1菌剂防治水稻纹枯病的田间试验

(1)本发明的枯草芽孢杆菌微生物菌剂(即发酵菌液A、发酵液B和菌液C，下同)制备同《发明内容》所述。

(2)试验在两个地区同时开展：即湖北省武穴市梅川镇松阳村，水稻品种为开优8号(公开推广的水稻品种)；湖北省大冶市金湖街道办事处姜桥村，品种为金优288(公开推广的水稻品种)；生育期均为水稻孕稻期。稻田设置小区，120m²/小区。发酵菌液A、发酵液B、菌液C、井冈霉素(浙江省桐庐正中生化贸易有限公司，20％可溶性粉剂)、艾米(湖北省信风作物保护有限公司，300g/L乳油)和清水对照共六个处理，12-15ml/m²，喷施时可用清水稀释，每处理设置4个小区重复，4个小区随机分布。20d后调查水稻纹枯病发病情况，病情指数和相对防效计算同前所述。

田间试验结果见表3，WJ-1三种菌剂处理，对水稻纹枯病均获得较高防治效果，其防治效果与化学药剂艾米及井冈霉素之间没显著性差异。

表3本发明的WJ-1菌剂对水稻纹枯病田间防治效果

参考文献：

1.廖皓年，肖陵生，王华生.水稻纹枯病发生历史及演变原因简析.广西植保，1997，3：35-38.

2.孟庆忠，刘志恒，王鹤影，张书绅，魏松红.水稻纹枯病研究进展.沈阳农业大学学报.2001，32(5)：376-381.

3.胡秀荣，许文耀，吕伟成.福建省水稻纹枯病菌对井冈霉素的抗药性检测.中国农学通报，2006，22(增刊)：160-162.

4.许文耀，吕伟成，胡秀荣.水稻纹枯病菌抗井冈霉素突变体的生物学特性.福建农林大学学报(自然科学版).2007，36(3)：230-233.

5.周德庆主编，《微生物学实验技术手册》，上海科学技术出版社，1986

6.Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，Lane HJ.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.JBacteriol.1991，173(2)：697-703.

7.Xie J，Fu Y，Jiang D，et al.Intergeneric transfer of ribosomal genes between two fungi.BMC EvolutionaryBiology.2008.8：87.

序列表

<110>华中农业大学

 

<120>水稻纹枯病生防菌枯草芽孢杆菌WJ-1及菌剂与应用

 

<130>

 

<141>2010-03-29

 

<160>1

 

<170>PatentIn version 3.1

 

<210>1

<211>1513

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

 

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1513)

<223>

 

<400>1

cgagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc     60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa    120

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