淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株及其建立方法

摘要

本发明提供了淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株，母细胞为红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R，其特征在于，所述细胞为分类命名：淋巴结靶向转移人肝癌细胞株HCCLM3-R-LnM1，保藏编号：3645，具有以下生物学特性：细胞呈多边形上皮样，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，均分泌AFP蛋白。所述的建立方法包括采用裸鼠皮下和肝脏原位移植瘤模型自发性淋巴结转移筛选，淋巴结转移人肝癌细胞再进行体外克隆扩增纯化。本发明在肝癌基础研究及药物临床前期研究中具有广阔的应用前景和潜在的社会与经济价值。

说明书

技术领域

本发明涉及淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株及其建立方法，具体涉及及能稳定表达红色荧光蛋白(RFP)、具淋巴结靶向转移能力的人肝癌细胞株HCCLM3-R-LnM1及其建立方法，属于微生物动物细胞系技术领域。

背景技术

原发性肝细胞癌是我国乃至全球的高发恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位列恶性肿瘤第二位。临床上有多种方法治疗肝癌，如手术切除、TACE、瘤内酒精注射、射频治疗和放射治疗等，但长期疗效有限。根据复旦大学肝癌研究所对9,800多例肝癌手术患者的临床长期随访资料统计发现，肝癌患者手术后5年的生存率仍低于50％，其主要死亡原因为肝癌的复发与转移。

临床上肝癌患者常出现淋巴结和肺脏转移。目前国内外缺乏相应的研究对象，对肝癌细胞的器官靶向性转移分子机理知之甚少，也缺乏必要的干预手段。为此，复旦大学肝癌研究所在世界上率先建立了具有自主知识产权和国家专利的裸鼠人肝癌转移模型(LCI-D20)(Sun FX，et al.Int J Cancer.1996；66：239-243.)，克隆到了具有高转移潜能的人肝癌细胞系(MHCC97)(Tian J，et al.Br J Cancer.1999；81：814-821.)，筛选出了具有相同遗传背景的、不同转移潜能的系列肝癌细胞株(MHCC97-H，MHCC97-L)(Li Y，et al.World J Gastroenterol.2001；7：630-636.专利号WO 2003/087766 A3，ZL2003 1 0122611.5)和高转移特性的人肝细胞癌细胞系HCCLM3和HCCLM6(J Cancer ResClin Oncol.2004；130：187-196；J Cancer Res Clin Oncol.2004；130：460-468；中华医学杂志.2004；84：675-679；Cancer Genet Cytogenet.2005；158：180-183；和ClinCancer Res.2006；12：7140-7148)，并进一步发展了RFP和GFP荧光标记的肝癌细胞(HCCLM3RFP/GFP，HCCLM6RFP/GFP)和相应的荧光可视肝癌转移模型(Yang BW，et al.EurJ Gastroenterol Hepatol.2008；20-1077-1084.专利申请号：200710045676.2；和200710045675.8)。国内外文献中均未见到关于能稳定表达荧光的淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株的报道。

发明内容

本发明的目的是提供稳定表达荧光的淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株及其建立方法，更具体的是建立染色体整合型、稳定表达红色荧光蛋白编码基因的、具淋巴结靶向转移能力的人肝癌细胞系。

本发明以红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R为母细胞，采用裸鼠皮下和肝脏原位移植瘤模型自发性淋巴结转移筛选，淋巴结转移人肝癌细胞再进行体外克隆扩增纯化的方法，建立了一种淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株(HCCLM3-R-LnM1)。已于2010年3月3日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：3645，分类命名：淋巴结靶向转移人肝癌细胞株(HCCLM3-R-LnM1)。

所述红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R参见中国专利200710045676.2。已于2010年3月3日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：3643，分类命名：表达红色荧光蛋白人肝癌细胞株(HCCLM3-R)。

所述裸鼠皮下及肝脏原位移植瘤模型参见中国专利200710045675.8。

本细胞株具有以下生物学特性：

1、与母细胞具有相同的遗传背景，细胞呈多边形上皮样，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，均分泌AFP蛋白；

2、可稳定表达高强度红色荧光：转染的红色荧光蛋白编码基因与中国专利200710045676.2中所述具有序列1的红色荧光蛋白RFP相同，经过基因改造，能够有效延缓荧光淬灭时间，增加荧光表达强度，在激发波长为560nm、发射波长为585nm的条件下，可用荧光显微镜进行观察；

3、遗传性状稳定、可在常规条件下连续传代。

4、与母细胞相比，除了具有母细胞所具有的生物学特性以外，还表现出另外两个特征，其一，比母细胞具有更强的转移能力；其二，与母细胞包含不同靶向转移亚克隆的高异质性相比，本细胞异质性更低，具有淋巴结靶向转移克隆选择优势，在裸鼠肝脏原位移植后第2周首先出现淋巴结转移，转移率约为71.4％，至第4周100％出现腹腔淋巴结转移，而肺转移在第3周开始出现约14.3％，第4周约28.6％，晚期可全身转移。

所述的淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，具体步骤为：以红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R为母细胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型，得到皮下肿瘤小块；建立裸鼠肝脏移植瘤模型，将皮下肿瘤小块植入裸鼠的肝脏表面；42天后，处死裸鼠，打开腹腔，取出淋巴结转移灶组织，将淋巴结转移灶组织碾磨、离心得到细胞沉淀，经培养和逐级克隆，分选获得淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株。

本发明以高转移特性肝癌细胞株HCCLM3R为母本细胞，采用裸鼠肝脏原位肿瘤移植模型(参见申请专利200710045675.8)中的淋巴结转移灶肝癌细胞作为克隆对象，经体外培养扩增获得；淋巴结靶向转移人肝癌细胞株HCCLM3-R-LnM1经裸鼠肝脏原位肿瘤移植模型确认首先发生淋巴结转移；所获肝癌细胞与母本肝癌细胞HCCLM3R具有相同的遗传背景；具有表达高强度红色荧光、遗传性状稳定、可连续传代、淋巴结靶向转移克隆选择优势等特性。

本发明获得红色荧光表达的淋巴结靶向转移性人肝癌细胞HCCLM3-R-LnM1，在体外常规的二维及三维细胞培养体系中生长良好，可用于肝癌转移尤其是器官靶向转移分子机理的研究；或作为抗肝癌转移新药疗效判别的效应细胞。此外，还可作为裸鼠皮下接种的肝癌细胞，用于裸鼠皮下和肝脏原位荧光示踪肝癌模型的建立，为尽早发现裸鼠体内人肝癌器官靶向转移等生物学行为的变化提供参考，以及为在体抗肿瘤转移新药或其他干预治疗的效果评估提供便利。

本发明在肝癌基础研究及药物临床前期研究中具有广阔的应用前景和潜在的社会与经济价值。

附图说明

图1为不同时间节点裸鼠肺中的肝癌细胞转移情况示意图；

图2为不同时间节点裸鼠腹腔淋巴结中的肝癌细胞转移情况示意图；

图3为不同时间节点裸鼠肺和淋巴结中的肝癌细胞转移数量示意图；

图4为不同时间节点裸鼠肺和腹腔淋巴结中的肝癌细胞荧光面积示意图。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1

1、建立HCCLM3R裸鼠皮下移植瘤模型：BALB/c nu/nu雄性裸鼠，5-6周龄，体重15-18克，饲养在无特定病原体的我所裸鼠室中。背部左侧皮下注射体外培养的肝癌高转移荧光细胞HCCLM3R，剂量为2X10⁷细胞/只，生长4周后无菌取皮下肿瘤，切成1mm³左右的肿瘤小块、供后续实验；

2、建立HCCLM3R裸鼠肝脏移植瘤模型：定位裸鼠肝脏、消毒肝脏外皮肤、无菌切开皮肤暴露小鼠肝脏、用镊子分离肝包膜并划开一个小口，将肿瘤小块植入肝脏表面，缝合肝包膜和皮肤。

3、淋巴结转移性肝癌细胞的获取：原位移植瘤生长至第42天，处死裸鼠，打开腹腔，展开肠系膜，观察腹壁及肠系膜淋巴结转移灶的大小和数目(Leica荧光体视显微镜，IPP软件)，经荧光定位取4-6个淋巴结转移灶组织。

4、淋巴结转移性肝癌细胞的克隆和扩增：用200目的滤网，将淋巴结转移性组织碾磨成细胞悬液，离心(1500rpm×5min)取细胞沉淀。用1×PBS液洗涤3次后，转移性肝癌细胞重悬于含10％FBS的DMEM完全培养液中，置37℃、5％CO₂孵箱中培养和逐级克隆，直至分选获得单克隆肝癌细胞，常规液氮保存备用。

5、淋巴结转移性荧光表达肝癌细胞的功能鉴定：制备淋巴结转移性HCCLM3-R-LnM1肝癌细胞的裸鼠皮下和肝脏原位移植瘤。每隔一周处死肝癌原位移植瘤的裸鼠，观察不同时间节点裸鼠肺和淋巴结中肝癌转移情况。图1和图2分别为不同时间节点裸鼠肺和腹腔淋巴结中的肝癌细胞转移情况示意图；图3为不同时间节点裸鼠肺和腹腔淋巴结中的肝癌细胞转移数量示意图；图4为不同时间节点裸鼠肺和腹腔淋巴结中的肝癌细胞荧光面积示意图。

结果表明，本发明所获的淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株HCCLM3-R-LnM1经裸鼠肝脏原位肿瘤移植模型确认首先发生淋巴结转移，随后陆续出现腹腔、腹壁淋巴结及全身转移；淋巴结靶向转移性肝癌细胞与母本肝癌细胞HCCLM3R具有相同的遗传背景；且具有表达高强度红色荧光、遗传性状稳定、可连续传代、淋巴结靶向转移克隆选择优势等特性。经体外长期连续培养发现，红色荧光表达强度高、荧光不易被淬灭，荧光表达稳定，是较为理想的荧光示踪、器官靶向转移性人肝癌细胞。可在体外二维及三维细胞培养体系中作为荧光标记的实验细胞，用于肝癌转移的分子机理研究；也可作为效疗判别细胞用于抗肝癌转移新药的疗效观察；也可作为裸鼠皮下接种的荧光标记肝癌细胞，用于荧光可视人器官靶向转移性人肝癌裸鼠皮下模型和肝脏原位模型的建立，用于肝癌转移早期生物学行为的监视，以及在体药物或其他干预治疗效果的评估。