脱细胞肌腱或韧带胶原纤维材料及其制备方法

摘要

本发明涉及生物纤维材料领域，当前肌腱和韧带替代物主要包括自体移植物、异体或异种移植物及合成材料移植物，但均有其不可回避的缺点。本发明的目的在于提供了一种具备良好的生物力学特性和生物相容性的天然生物材料-脱细胞肌腱/韧带胶原纤维材料及其制备方法。本发明保留有肌腱/韧带胶原纤维或纤维束固有的力学结构单位和细胞附着结构，采用低温干燥的方法处理肌腱/韧带纤维，分离的纤维保留一定的力学强度，通过物理开松和梳理的方法，选出可胶原纤维和纤维束，再进行脱细胞处理。本发明肌腱/韧带脱细胞胶原纤维或纤维束材料来源广泛，量大并廉价，除可用于韧带、肌腱修复重建外，因其具有纤维材料的特性，还可广泛应用于其他生物医学领域。

说明书

技术领域

本发明涉及生物纤维材料领域，具体涉及一种新的天然生物材料--脱细胞肌腱/韧带胶原纤维材料及其制备方法。

背景技术

当前肌腱和韧带替代物主要包括自体移植物、异体或异种移植物及合成材料移植物，但均有其不可回避的缺点。虽然自体韧带移植为最有效的修复重建方法，但康复时间长，功能恢复不满意而不能广泛应用于临床。异体或异种肌腱抗原性强是其最大的缺点。人工合成材料如碳纤维、聚酯材料等非降解材料，短期内能提供足够的力学强度，但其不能再生，长期使用易引起磨损断裂。近年来组织工程韧带开始进入众多研究者的视线，支架材料的选择问题是组织工程韧带面临的最大问题之一。聚羟基乙酸(PGA)等可降解人工合成支架材料，因其不具备细胞外基质(ECM)良好的细胞亲和性及生物力学性能不理想，而限制其在肌腱和韧带损伤修复领域的应用。天然材料如胶原、蚕丝等具有良好的生物相容性，但在生物力学性能、构建仿生三维结构、表面修饰及降解的调节等多方面还有待于进一步研究。脱细胞基质具有组织器官ECM的固有特点，异体和异种肌腱脱细胞后ECM抗原性大大降低，具备良好的组织相容性。但脱细胞基质与种子细胞复合培养时，细胞很难渗透到脱细胞基质内部对其进行重塑。现有的脱细胞方法足以脱除肌腱内细胞成分，但脱细胞去污剂能破坏细胞外基质和影响细胞粘附和增殖，另外完整的肌腱是致密的结缔组织，纤维束的包膜结构阻碍了细胞成分脱除和细胞植入。这些因素限制了脱细胞在组织工程韧带领域的应用。

理想的生物替代材料应该具备良好的生物力学特性和生物相容性。肌腱/韧带脱细胞胶原纤维材料为一种新型的生物材料，保留有肌腱/韧带ECM固有的力学结构单位和细胞附着结构，去除了细胞成分，具有良好的力学性能和生物相容性。肌腱/韧带脱细胞胶原纤维材料有别于合成胶原纤维材料。虽然都取材于动物(如来源于牛跟腱)，但合成胶原纤维是将动物胶原(如肌腱和韧带胶原)溶解提纯的胶原分子，在体外聚合成原纤维，其提纯胶原分子的过程完全破坏了其ECM的空间结构和成分。如何再将其制备成具有肌腱和韧带ECM结构特点的替代物或组织工程支架一直未得到满意的解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种克服上述缺点的新的天然生物材料--脱细胞肌腱/韧带胶原纤维材料及其制备方法。

肌腱/韧带胶原纤维或纤维束主要成分是胶原蛋白，传统的纤维分离提取技术中，化学方法溶解胶原是其重要步骤，因此不适用于肌腱/韧带胶原纤维的分离。本发明人经研究发现，低温干燥的肌腱纤维是可以机械分离的(图1)，分离的纤维保留一定的力学强度，通过物理开松和梳理的方法，选出可胶原纤维和纤维束，为制备肌腱脱细胞胶原纤维提供实验基础。

本发明人经研究发现：脱细胞过程中，肌腱/韧带完整的腱膜/外膜阻碍了细胞成分的脱除，切开肌腱纤维束膜后脱除细胞成分过程较完整的肌腱明显简便有效，而且ECM的基质结构和成分无明显改变，具有良好的力学特性和生物相容性。物理方法分离的胶原纤维或纤维束无完整的腱膜或外膜包绕，脱细胞方法简便。

本发明提供了一种脱细胞肌腱或韧带胶原纤维材料的制备方法，由以下步骤组成：

1)取动物肌腱或韧带，清除动物肌腱或韧带表面的外膜和滑膜组织；

2)将动物肌腱或韧带低温干燥；

3)通过物理开松的方法(如挤压、锤击、真空反爆气流冲击等)将低温干燥的肌腱或韧带结构松散；

4)物理除杂、梳理等工序分离肌腱或韧带胶原纤维或胶原纤维束；

5)将分离的胶原纤维或胶原纤维束进行脱细胞；

6)将脱细胞的胶原纤维或胶原纤维束低温干燥。

本发明还提供了根据上述脱细胞肌腱或韧带胶原纤维材料的制备方法制得的脱细胞肌腱或韧带胶原纤维材料。

本发明采用低温干燥，温度以-80℃--40℃为宜，优选-56℃，对肌腱/韧带细胞外结构影响小，可以减小其抗原性，并且便于物理开松、梳理的方法分离胶原纤维或纤维束。实验证实，无腱膜包绕的胶原纤维或纤维束，通过低渗液漂洗可以脱除粘附于胶原纤维表面的细胞成分，并对其生物力学和组织相容性无明显影响。

本发明的肌腱/韧带脱细胞胶原纤维材料，直接从动物肌腱/韧带分离，进行脱细胞后获得，具备保留有肌腱/韧带ECM固有的力学结构单位和细胞附着结构，且去除了细胞成分。

本发明的制备方法取材丰富，成本低廉，猪、牛等哺乳动物的肌腱/韧带均可作为材料来源。本发明的生物材料不含细胞成分，具备良好的生物力学特性、ECM空间结构、生物相容性和实用性。本发明的肌腱/韧带脱细胞胶原纤维材料肌腱/韧带脱细胞胶原纤维材料除可以应用于韧带、肌腱修复重建外，因其具有纤维材料的特性，还可以广泛应用于其他生物医学领域，社会需求量大。

附图说明

图1是低温干燥牛韧带或肌腱胶原纤维或纤维束实物图。

图2是牛肌腱脱细胞胶原纤维或纤维束的组织HE染色切片图(100倍)。

其中A是正常肌腱纤维束；B是脱细胞肌腱纤维束。

图3是牛脱细胞胶原纤维与兔髌韧带成纤维细胞体外复合培养1周后，组织冰冻切片HE染色图(100倍)。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1：牛肌腱脱细胞胶原纤维或纤维束的制备

1)取新鲜牛肌腱，清除肌腱带表面的外膜和滑膜组织。

2)将肌腱置于-56℃真空冻干仪(美国VirTis BENCHTOP)，12h。

3)通过挤压、锤击将低温干燥的肌腱结构松散。

4)将松散的肌腱进一步梳理分离肌腱胶原纤维或胶原纤维束。

5)将分离的胶原纤维或纤维束脱细胞：

用10mM的低渗tris缓冲液+丝氨酸蛋白酶抑制剂(0.05％苯甲基磺酰氟化物乙醇溶剂，35ml/L 50ml乙醇+25mgPMSF)，持续96h，每隔24h换液一次。根据纤维束粗细，在脱细胞过程中可酌情加用少量去污剂(如TritonX-100、三磷酸丁酯等)和胰酶等。所有步骤均在室温、摇床(150RPM)进行，均加5ml/L青霉素/链霉素溶液(10000U/ml 10000mg/ml)溶液预防污染，完成每一步骤均使用PBS冲洗3边。

6)将脱细胞的胶原纤维或纤维束用干燥无菌纱布汲干表面水分，置于-56℃真空冻干仪，3h后干燥保存待用。

实施例2：牛韧带脱细胞胶原纤维或纤维束的制备

以牛韧带替换牛肌腱，其余同实施例1。

实施例3：牛肌腱脱细胞胶原纤维或纤维束的组织学检查

取脱细胞前、后的胶原纤维或纤维束给予石蜡包埋，切片(5μm)、HE染色观察。观察细胞核成分(苏木素染色)，胶原排列形态(伊红染色)，图2中A脱细胞前的胶原纤维束；B脱细胞后的胶原纤维或纤维束见细胞成分完全脱除。

实施例4：牛肌腱脱细胞胶原纤维或纤维束的体外异种细胞相容性评价

1)异种细胞培养

髌韧带成纤维细胞的分离：新西兰大白兔(3月，第二军医大学动物实验中心提供)1％戊巴比妥钠静脉麻醉后，在无菌操作下取髌韧带，PBS冲洗，并彻底清除髌韧带滑膜及周围软组织。用胶原酶处理15min(37℃)，PBS冲洗3边后将髌韧带剪成1mm³组织块，间隔3mm铺在培养皿(10×10cm²)上，加少量10％胎牛血清细胞培养液。组织块贴壁后(4h)加10％胎牛血清细胞培养液覆盖组织块，培养液没3-4天更换一次。分离的第三代成纤维细胞用于实验。

2)肌腱脱细胞纤维消毒

将脱细胞纤维初步成束(直径约2mm，也可根据不同实验编织成不同直径的样本)支架密封包装，使用使用γ射线(15KGray)消毒，将消毒的脱细胞韧带加入10％胎牛血清细胞培养液24h后未见菌落生长。

3)体外复合培养

将韧带成纤维细胞消化离心悬液(细胞浓度10⁶/ml)，滴在脱细胞纤维束表面，培养4小时后移入培养液中悬浮培养3天。

4)组织学检查

将培养3天肌腱脱细胞胶原纤维束，在室温下OCT胶浸润，而后至于-20℃30min，冰冻切片(10μm)，行HE染色。如图3所示，见韧带成纤维细胞贴附在胶原纤维表面，生长形态(细胞核呈梭形)良好，说明牛肌腱/韧带胶原纤维材料对异种细胞组织相容性好。